CN103911288B

CN103911288B - 一种预浓缩破壁提取微生物油脂的方法

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Publication number: CN103911288B
Application number: CN201310005865.2A
Authority: CN
Inventors: 洪丰; 王勇; 姜元荣; 王野
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2013-01-08
Filing date: 2013-01-08
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2033-01-08
Also published as: CN103911288A

Abstract

本发明提供一种预浓缩破壁微生物及提取微生物油脂的方法，该方法包括将发酵液的pH值调节到10－14的范围，和浓缩前述步骤所得的发酵液，从而使所述微生物细胞破壁。破壁之后可对油脂等活性成分进行提取。本发明方法预浓缩和破壁合为一步完成，在浓缩的过程中完成破壁，工艺简单，破壁后体系粘度低，利于后续提油操作，通过简单易行的方法提取微生物细胞中的油脂等活性成分。

Description

一种预浓缩破壁提取微生物油脂的方法

技术领域

本发明属于微生物油脂提取领域，具体涉及预浓缩破壁提取微生物油脂的方法。

背景技术

通过培养收获的微生物细胞一般存在于水相体系中，颗粒细小，含油量高，具有坚韧的细胞壁。因此传统的植物油提油工艺不适用于微生物油脂的制备。一般微生物油脂的制备包括4个步骤：1.在发酵罐中利用适当培养基对微生物进行培养；2.收获微生物的生物质并加以处理(如洗涤/脱水或干燥)；3.细胞破壁，包括物理处理(蒸煮，蒸汽爆破)，化学(热碱，螯合剂)，机械(压榨，均质，研磨)等手段；4.从细胞碎片中提取微生物油脂(如溶剂萃取，直接离心分离)。

CN101429467B采用热碱法破壁提取微生物油脂和蛋白质。该法调节生物质含量为2.5％～10％，调节pH至7.5～12，通过110～140℃饱和蒸汽处理3～30min实现破壁。通过离心，破乳(调pH至5～7)，油水分离获得微生物油脂。该法生物质含量低，后续提油阶段需要大量溶剂，脱溶能耗高；同时较多的水分使得溶剂提油阶段极易乳化，提油效率低；在水相体系内采用110～140℃高温处理，热敏性油脂易变质。

CN1226923，CN1817846A采用干法提油方式。其中CN1226923将生物质干燥到含水量<20％，CN1817846A将生物质干燥到含水量≤10％。该法将微生物油脂提油与传统的油脂浸出工艺相结合。缺点也较为明显：1.发酵液的含水量～90％，通过热干燥的方式除去50％左右的水分，能耗巨大；2.通过干燥的方式造粒提油，微生物细胞缺少破壁过程，油脂提油率偏低；3.热干燥过程中，微生物不可避免的经受了热处理，热敏性油脂易变质。

CN101168501B，CN101323865A采用预浓缩机械破壁提油工艺。其中，CN101168501B采用絮凝剂和乙醇预浓缩，CN101323865A采用吸水剂预浓缩。通过预浓缩可以提高破壁效率，减少后续提取溶剂的用量。缺点也较为明显：1.采用絮凝剂和乙醇预浓缩，絮凝剂会残留在粕中，影响粕的后续使用，同时需要增加乙醇回收装置，设备投入和运行成本较高；2.采用吸水剂预浓缩，吸水剂的清洗会产生大量废水，同时吸水剂的复活采用加热干燥的方式，能耗较高；3.机械破壁发酵液体系粘度增加明显，不利于后续溶剂提油。

现有的预浓缩方法主要包括：絮凝沉降、乙醇浓缩、离心浓缩、压滤浓缩。其中，絮凝沉降浓缩程度较小，一般用于低密度培养(生物质浓度低)发酵液的浓缩；乙醇浓缩将消耗大量乙醇，形成乙醇水溶液，乙醇回收、提纯能耗较高；离心浓缩浓缩程度有限，浓缩后生物质浓度一般＜20％；压滤浓缩一般与絮凝沉降结合适用，多用于低密度培养发酵液浓缩，其浓缩效果受限于菌体性状及大小。以上浓缩方法均无法实现浓缩和破壁同时完成。

通过以上分析可以看出，传统的热碱法破壁提油存在溶剂耗量大、易乳化等缺点；通过干燥后破壁提油可解决上述问题，却又带来能耗高、提油率偏低等缺点；采用先预浓缩后破壁方法，可在一定程度上克服热碱法和干法破壁提油的缺点，但又带来新的问题，如工艺繁琐、浓缩过程中引入其他物质、破壁后体系粘度高等。

本发明旨在解决上述问题，将预浓缩和破壁合为一步完成，即通过调节发酵液pH，然后进行真空浓缩，在浓缩的过程中完成破壁。该法工艺简单，破壁后体系粘度低，利于后续提油操作，同时也可避免热碱法和干燥后破壁提油的常见问题。

发明内容

本发明将预浓缩和破壁合为一步完成，即通过调节发酵液的pH值，然后进行真空预浓缩，在预浓缩的过程中完成细胞破壁，减少后续的破壁设备投入和运行成本，从而通过简单易行的方法提取微生物细胞中的油脂等活性成分。

本发明适合处理高密度培养的发酵液，可将发酵液浓缩至60％以上。

因此，本发明提供一种对微生物细胞实施破壁的方法，所述方法包括：

将发酵液的pH值调节到10－14的范围；和

浓缩前述步骤所得的发酵液；

从而使所述微生物细胞破壁。

本发明还提供一种提取微生物活性成分的方法，所述方法包括：

将发酵液的pH值调节到10－14的范围；

浓缩前述步骤所得的发酵液，从而使所述微生物细胞破壁；和

从细胞碎片中提取微生物细胞的活性成分。

在一具体实施方式中，所述方法包括向发酵液中添加碱、碱溶液、或能生成碱的物质，从而将发酵液的pH值调节到10-14的范围。

在一具体实施方式中，所述碱选自碱金属碱、碱土金属碱、或其混合物。

在一具体实施方式中，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾和/或氢氧化钙。

在一具体实施方式中，所述微生物为单细胞微生物。

在一具体实施方式中，所述微生物为产油微生物。

在一具体实施方式中，使用所述碱将发酵液的pH值调节到11－12.5的范围。

在一具体实施方式中，所述浓缩为真空浓缩。

在一具体实施方式中，所述真空浓缩的真空度为29000Pa-66000Pa。

在一具体实施方式中，向所述发酵液中添加氢氧化钾，将发酵液的pH值调节到11.5-12.5的范围。

在一具体实施方式中，向所述发酵液中添加氢氧化钾和氢氧化钙，将发酵液的pH值范围调节到11.5-12.5的范围。

在一具体实施方式中，以发酵液质量计，氢氧化钙的添加量为0.1％-0.6％。

在一具体实施方式中，所述活性成分选自油脂和蛋白质。

在一具体实施方式中，适用于本发明方法提取微生物油脂的微生物选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)的微生物、裂殖壶菌属(Schizochytrium)的微生物、被孢霉属(Mortierella)的微生物、Althornia属的微生物、Aplanochytrium属的微生物、Japonochytrium属的微生物、Labyrinthula属的微生物、Labyrinthuloides属的微生物、Crypthecodinium属的微生物，褐指藻属(Phaeodactylum)的微生物，微绿球藻属(Nanochloropsis)的微生物，裸藻属(Euglena)的微生物，四膜虫属(Tetrahymena)的微生物，螺旋藻属(Spirulina)的微生物，和吾肯氏壶藻属(Ulkenia)的微生物，隐甲藻属(甲藻)(Crypthecodinium(Dinofagellates))的微生物，以及它们的混合物。优选的，所述微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属(甲藻)的微生物，以及它们的混合物。

在一具体实施方式中，在70℃-90℃实施所述真空浓缩。在某些实施方式中，将浓缩温度控制在75℃-85℃。

具体实施方式

本发明的方法可用于从各种微生物中提取各种脂质，所述脂质含有胆固醇，植物甾醇，链甾醇，生育三烯酚，生育酚，泛醌，类胡萝卜素例如β-胡萝卜素，叶黄素，黄体素，番茄红素，虾青素，玉米黄质，角黄素和/或脂肪酸例如结合亚油酸，ω-3和ω-6高不饱和脂肪酸，例如二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，和花生四烯酸，十八碳四烯酸，双高γ-亚麻酸和γ-亚麻酸或它们的混合物，更优选的是，ω-3高不饱和脂肪酸，例如二十二碳六烯酸(DHA)，二十碳五烯酸(EPA)，和/或二十二碳五烯酸(DPA)(即ω-3形式的DPA)，尤其是含相对大量DHA的脂质，包含ω-6高不饱和脂肪酸例如花生四烯酸和二十二碳五烯酸(DPA)(即ω-6形式的DPA)的脂质。

适用于本发明方法提取微生物油脂的微生物包括本领域周知的各种产油微生物，包括但不限于各种藻类、细菌、真菌和原生生物，例如包括微藻类，如绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorella emersonii，Chlorella sorokiniana，Chlorellasaccharophila，Chlorella regularis，微小小球藻(Chlorella minutissima)，Chlorellaprotothecoides，小球藻(Chlorella zofingiensis)，以及绿藻门中的Brachiomonassubmarina，Chlamydobonas reinhardtii，Chlamydomonas acidophila，雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)，湖泊红球藻(Haematococcus lacustris)，斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)，Spongiococcum exetriccium，Tetraselmis suecica，扁藻(Tetraselmis chuii)，四肩突四鞭藻(Tetraselmis tetrathele)，Tetraselmisverrucosa，微芒藻(Micractinium pusillum)；硅藻门的筒柱藻(Cylindrothecafusiformis)，Nitzschia laevis，Nitzschia alba，Nitzschia fonticola，Naviculaincerta，羽纹硅藻(Navicula pelliculosa)；蓝藻门的多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis)；金藻门的Poterioochromonas malhamensis；甲藻门的前环藻(Amphidiniumcarterae)，寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)；裸藻门的Euglena gricilis；和红藻门的单细胞红藻(Galdieria sulphuraria)，以及它们的混合物。

适用于本发明方法提取微生物油脂的微生物还可以包括选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)的微生物、裂殖壶菌属(Schizochytrium)的微生物、被孢霉属(Mortierella)的微生物、Althornia属的微生物、Aplanochytrium属的微生物、Japonochytrium属的微生物、Labyrinthula属的微生物、Labyrinthuloides属的微生物、Crypthecodinium属的微生物，褐指藻属(Phaeodactylum)的微生物，微绿球藻属(Nanochloropsis)的微生物，裸藻属(Euglena)的微生物，四膜虫属(Tetrahymena)的微生物，螺旋藻属(Spirulina)的微生物，和吾肯氏壶藻属(Ulkenia)的微生物，隐甲藻属(甲藻)(Crypthecodinium(Dinofagellates))的微生物，以及它们的混合物。优选的，所述微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属(甲藻)的微生物，以及它们的混合物。更优选的，所述微生物为Schizochytrium sp.。更优选的，所述微生物为ATCC20888和/或SR21。

本发明方法可用于提取微生物油脂。油脂包括“藻油”。“藻油”指由微藻细胞产生的脂质组分，如胆固醇，植物甾醇，链甾醇，生育三烯酚，生育酚，泛醌，类胡萝卜素和叶黄素例如β-胡萝卜素，黄体素，番茄红素，虾青素，玉米黄质，角黄素，和脂肪酸例如结合亚油酸，ω-3和ω-6高不饱和脂肪酸，例如，二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，花生四烯酸，十八碳四烯酸，双高γ-亚麻酸和γ-亚麻酸中的一种或多种。

优选的是，微生物包含的脂质至少约为20％重量，更优选的是至少约30％，最优选的是至少约40％。更优选的是至少约20％的脂质是胆固醇，植物甾醇，链甾醇，生育三烯酚，生育酚，泛醌，类胡萝卜素和叶黄素例如β-胡萝卜素，黄体素，番茄红素，虾青素，玉米黄质，角黄素，和脂肪酸例如结合亚油酸，ω-3和ω-6高不饱和脂肪酸，例如，二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，花生四烯酸，十八碳四烯酸，双高γ-亚麻酸和γ-亚麻酸中的一种或多种，优选的是至少约30％，更优选的是至少约40％。

提取完油脂后，可将固渣和水溶液分离，水溶液经过滤、等电点沉淀、干燥等得到蛋白质粉末；固渣经乙醇水溶液浸提，得到低聚糖；剩余粕渣经干燥、造粒后可用于动物或水产饲料。

在本发明的一个具体实施例中，使用上述方法进行细胞破壁的微生物为单细胞微生物。在本发明的一个优选实施例中，使用上述方法进行细胞破壁的微生物为产油的单细胞微生物。在本发明的一个优选实施例中，使用上述方法进行细胞破壁的微生物为产油的单细胞微生物。

在另一个实施例中，使用上述方法进行细胞破壁的微生物为产蛋白的单细胞微生物。

本发明通过向发酵液中添加碱或碱溶液或能生成碱的物质来调节发酵液的pH指。通常，获得发酵液后，可直接向发酵液中加入碱或碱溶液，或者可先对发酵液实施巴氏灭菌灭活，然后再加入碱或碱溶液或能生成碱的物质。

适用于本发明的碱包括但不限于碱金属形成的碱(即碱金属碱)、碱土金属形成的碱(即碱土金属碱)或其混合物，例如氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙或其任意混合物。优选是能溶于水或微溶于水的碱。或者，也可使用其它能在发酵液中反应形成本发明所用的碱及pH范围的成分，例如，可在发酵液中加入适量的CaO，其与水发生反应后可生产本发明所需的氢氧化钙。

优选地，本发明使用氢氧化钾或氢氧化钾与氢氧化钙的混合物。本发明的碱可以固体或水溶液的形式使用。

本发明通过碱或碱溶液来调节发酵液的pH在10－14的范围之内。因此，对用于调节发酵液pH值的物质(例如本文所述的碱或碱溶液，或能在发酵液中生成所述碱的物质)的量并无特别限制，技术人员可根据发酵液的量以及所用的碱和/或碱溶液的浓度等因素，选择适当量的物质加到发酵液中，以将发酵液的pH值控制在10－14的范围之内。

在使用碱或碱溶液混合物的情况下，混合物中各碱的比例也无特殊限制，以能将发酵液的pH控制在10－14的范围之内为准。但在使用氢氧化钙与其它碱的混合物的实施方式中，通常，以调节pH前发酵液质量为基准，氢氧化钙的添加量为0.1％-0.6％。在某些实施方式中，以调节pH前发酵液质量为基准，氢氧化钙的添加量在例如0.1％-0.5％、0.1％-0.4％、0.2％-0.3％的范围内。在使用氢氧化钙和氢氧化钾的混合物的实施方式中，以调节pH前发酵液质量为基准，氢氧化钙的添加量可以在例如0.1％-0.5％，例如0.1％-0.3％的范围内。

在某些优选的实施方式中，通过碱或碱溶液将发酵液的pH值控制在11－13的范围之内。在其它优选的实施方式中，通过碱或碱溶液将发酵液的pH控制在11.5－12.5的范围之内。

在其它实施方式中，当使用氢氧化钾时，可用氢氧化钾将发酵液的pH值调节到11.5-12.5的范围；当使用氢氧化钠时，可用氢氧化钠将发酵液的pH值调节到11.5-12.5的范围；当使用氢氧化钙时，可用氢氧化钙将发酵液的pH值调节到11.5-12.5的范围；当使用氢氧化钾和氢氧化钙时，可用它们将发酵液的pH值范围调节到11.5-12.5。

调节好发酵液的pH值之后，可对所述发酵液实施真空浓缩步骤。在某些优选的实施方式中，优选的真空范围在29000Pa-66000Pa。在其它优选实施例中，真空范围控制在44000Pa到66000Pa的范围之内。

浓缩温度通常为70℃-90℃。在某些实施方式中，将浓缩温度控制在75℃-85℃。

通过浓缩时间控制浓缩程度，优选的浓缩比例为浓缩后发酵液干物质含量为25％-55％。

经真空浓缩后，即可获得破壁的产物。

可对破壁的细胞产物实施进一步的处理，包括调节pH值、活性成分如油脂、蛋白等的提取。

油脂的提取方法可包括向采用上述步骤获得的预浓缩的产物中加入适量溶剂(如预浓缩液：正己烷＝1：3w/v)，充分混合后，分离出混合油(油脂和溶剂的混合物)，脱除溶剂得到毛油。溶剂抽提的过程中，加入适量乙醇，有利于提高抽提效率。应理解，还可采用其它的油脂提取技术来提取油脂。油脂提取完成之后，还可采用常规的技术手段对残渣中的其它活性成分例如蛋白质进行提取。

本发明有以下优点：

1.通过pH调节，减低了发酵液粘度，有效提高了浓缩效率(见表1)；

2.真空浓缩可减少物料与氧气的接触，降低浓缩温度，提高油脂品质；

3.通过筛选合适的碱，可有效抑制浓缩过程中的起泡现象，利于浓缩操作(见表2)；

4.浓缩的过程完成破壁(见表3)，减少破壁的设备投入和运行成本；

5.碱法预浓缩，可提高浓缩程度，降低体系粘度，减少后续提取溶剂的用量(见表4)；

6.预浓缩破壁可抑制正己烷抽提过程中的乳化现象(见表9)。

与CN101429467B相比，本发明采用真空预浓缩，加热温度较低，利于油脂品质提高。

与CN1226923、CN1817846A相比，本发明适度浓缩，无需干燥至水分＜10％，节约能耗；本发明在预浓缩的过程中完成破壁，油脂提取率相对较高；本发明采用真空干燥，温度相对较低，有利于提高油脂品质。

与CN101168501B、CN101323865A相比，本发明在预浓缩过程中即可完成破壁，无需增加破壁设备投入和运行成本；本发明在预浓缩的过程中不会引入絮凝剂，影响粕的使用；本发明在预浓缩的过程中不会引入乙醇，无需乙醇回收设备；本发明在预浓缩的过程中不会引入吸水剂，避免吸水剂回收复活成本。

下面将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非限制本发明的范围。实施例中所使用到的材料、试剂等，除非另有说明，否则为市场上可购得的各种材料和试剂。

对照实施例：热碱法破壁提油(未浓缩发酵液)

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)100g，调节pH值后，常压下加热搅拌破壁。采用正己烷提取破壁后的发酵液。具体步骤为：

1.调节pH值：采用30％KOH调节pH值至12。

2.加热破壁：80℃，搅拌加热30min。

3.溶剂抽提：向破壁后的发酵液中加入适量正己烷(发酵液：正己烷＝1：1w/v)，充分混合后，3000g 3min离心分离混合油，重复抽提3次，合并混合油层。

4.真空脱溶。采用旋转蒸发仪60℃1h脱溶，得到毛油。

在此条件下，油脂的回收率为83.04％，其中，油脂回收率＝获得的油脂/发酵液中的总脂质(下同)。

实施例1：不同pH值对发酵液粘度和浓缩效率的影响

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)500g，分别调节发酵液pH值为pH9、pH10、pH11、pH12，采用旋转蒸发仪蒸发浓缩(9000Pa，80℃，30min)，考察粘度变化及浓缩效率。粘度检测：按GB/T 22427.7-2008淀粉粘度测定中的方法进行；干物质浓度检测：按GB/T 20264-2006，粮食、油料水分两次烘干测定法进行。结果显示在下表1中。

表1不同pH对发酵液粘度及浓缩效率的影响

由表1可以看出，加碱调节pH可降低发酵液粘度，pH＞11时，浓缩后的发酵液粘度明显降低，此时发酵液浓缩效率最高。

实施例2：不同碱对预浓缩过程中起泡现象的影响

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)500g，分别采用不同的碱液调节发酵液至pH12，进行真空预浓缩(9000Pa，80℃，30min)，起泡情况。

结果显示在表2中。

表2不同碱对预浓缩过程中起泡现象的影响

*：Na₂CO₃调节样品pH值为10.42

实施例3：不同碱预浓缩后的油脂提取率

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)1000g，分别采用不同的碱液调节发酵液pH，然后80℃、44000Pa、浓缩30min，考察油脂回收率差异。结果显示在表3中。

表3不同碱预浓缩后的油脂提取率

*先用KOH调节pH12，再加入0.2％的Ca(OH)₂粉末

由表3可以看出，不同的碱调节都可起到浓缩破壁的效果，其中KOH和NaOH调节的样品油脂回收率相对较高；pH对油脂回收率影响较大，采用KOH调节时，优选pH11.5～pH12.5。

实施例4：不同碱对浓缩程度及正己烷用量的影响

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)600g，分别采用不同的碱液调节发酵液pH，然后80℃、44000Pa、浓缩30min，采用正己烷提取破壁后的发酵液。考察正己烷用量差异。结果显示在表4中。

表4不同碱对浓缩程度及正己烷用量的影响

注：采用正己烷3次抽提，发酵液(或浓缩后发酵液)：正己烷＝1:1(w/v)。

由表4可以看出，采用真空浓缩，可有效减少后续正己烷的用量，降低蒸发能耗。

实施例5：使用KOH进行真空浓缩破壁提取油脂

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)100g，调节pH值后，进行真空预浓缩。采用正己烷提取预浓缩后的发酵液。具体步骤为：

1.调节pH值：采用30％KOH调节pH值至12。

2.真空浓缩：80℃，44000Pa，浓缩30min。浓缩的过程中即可完成破壁。在此过程中，虽然起泡现象较为明显，但不影响到真空浓缩的正常进行。

3.溶剂抽提：向预浓缩发酵液中加入适量正己烷(发酵液：正己烷＝1：1w/v)，充分混合后，3000g 3min离心分离混合油，重复抽提3次，合并混合油层。

4.真空脱溶：采用旋转蒸发仪60℃1h脱溶，得到毛油。

油脂的回收率为80.47％。

实施例6：使用NaOH真空浓缩破壁提取油脂

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)100g，调节pH值后，真空浓缩。采用正己烷提取预浓缩后的发酵液。具体步骤为：

1.调节pH值：采用30％NaOH调节pH值至12。

2.真空浓缩：80℃，44000Pa，浓缩30min。浓缩的过程中即可完成破壁。在此过程中，起泡严重(相对于实施例1更严重)，需要严格控制真空度，以避免泡沫溢入真空系统。

4.真空脱溶：采用旋转蒸发仪60℃1h脱溶，得到毛油。

油脂的回收率为87.19％。

实施例7：使用Ca(OH)₂真空浓缩破壁提取油脂

发明人在实验的过程中发现，采用Ca(OH)₂浓缩破壁可有效抑制真空浓缩过程中的起泡现象。称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)100g，调节pH值后，真空浓缩。采用正己烷提取预浓缩后的发酵液。具体步骤为：

1.调节pH值：向发酵液中加入1.2％的Ca(OH)₂粉末，调节pH至12。

2.真空浓缩：80℃，44000Pa，浓缩30min。浓缩的过程中即可完成部分破壁。在此过程中，起泡现象得到明显抑制，没有起泡溢入真空系统。

3.溶剂抽提：向预浓缩发酵液中加入适量正己烷(发酵液：正己烷＝1:1w/v)，充分混合后，3000g 3min离心分离混合油，重复抽提3次，合并混合油层。

4.真空脱溶：采用旋转蒸发仪60℃1h脱溶，得到毛油。

油脂的回收率为49.91％。

实施例8：使用复配碱真空浓缩破壁提取油脂

发明人在实验过程中发现，采用KOH和Ca(OH)₂的复配碱进行预浓缩破壁，不仅可以抑制真空浓缩过程中的起泡现象，而且可以提高破壁效率(相对与单独使用Ca(OH)₂浓缩破壁)。具体步骤为：

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)100g，调节pH值后，真空浓缩。采用正己烷提取预浓缩后的发酵液。

1.调节pH值：采用30％KOH调节pH值至12，再加入0.2％的Ca(OH)₂粉末混匀。

2.真空浓缩：80℃，44000Pa，浓缩30min。在此过程中，起泡现象得到明显抑制，没有起泡溢入真空系统；同时破壁效率得到一定程度提高。

4.真空脱溶：采用旋转蒸发仪60℃1h脱溶，得到毛油。

结果显示在表5中。

表5：Ca(OH)₂预浓缩破壁和复配碱预浓缩破壁的提油率差异

注：采用正己烷3次抽提，浓缩液：正己烷＝1:1(w/v)。

由表5可以看出，采用Ca(OH)₂和KOH的复配碱预浓缩破壁可提高油脂的回收率。

实施例9：使用复配碱(NaOH+Ca(OH)₂)对预浓缩过程中起泡现象的影响

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)500g，采用30％NaOH调节pH值至12，分别添加0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％的Ca(OH)₂，真空浓缩，考察抑制起泡效果。结果显示在表6中。

表6：复配碱(NaOH+Ca(OH)₂)中Ca(OH)₂添加量对预浓缩过程中起泡现象的影响

由表6可以看出，Ca(OH)₂和NaOH复配，抑制起泡效果不明显，同时，过高的Ca(OH)₂添加会显著降低油脂回收率。

实施例10：不同KOH+Ca(OH)₂的组合对抑制起泡现象的影响

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)500g，采用30％KOH调节pH值至12，分别添加0.08％、0.1％、0.2％、0.4％、0.6％的Ca(OH)₂，真空浓缩，考察抑制起泡效果。结果显示在表7中。

表7：复配碱(KOH+Ca(OH)₂)中Ca(OH)₂添加量对预浓缩过程中起泡现象的影响。

由表7可以看出，Ca(OH)₂添加量＞0.1％时，表现出抑泡效果，考虑到过高的Ca(OH)₂添加量对油脂回收率不利，优选Ca(OH)₂添加量为0.2％。如实施例3所示，此时油脂回收率为70.39％。

实施例11：真空度对油脂回收率的影响

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)500g，采用30％KOH调节pH值至12，分别在19000Pa、29000Pa、44000Pa、66000Pa条件下真空浓缩30min，采用正己烷提取预浓缩后的发酵液，比较油脂回收率差异。结果显示在表8中。

表8：不同真空度预浓缩对油脂回收率的影响。

由表8可以看出，随着真空度的增加，油脂回收率呈下降趋势，权衡浓缩速度和油脂回收率，优选44000Pa真空浓缩。

实施例12：预浓缩破壁抑制提油过程中的乳化现象

称取发酵液(Schizochytrium sp.自行培养获得，灭菌后生物质含量15.5％，干基含油38.7％)400g，分别采用不同的碱液调节发酵液pH，然后80℃，44000Pa，浓缩30min，采用正己烷提取破壁后的发酵液，考察提油过程中的乳化现象。结果显示在表9中。

表9：提油过程中的乳化现象

注：2000g 1min离心，考察离心后的乳化现象

由表9可以看出，真空浓缩破壁后，可显著抑制提油过程中的乳化现象，提高混合油(油脂和正己烷混合物)分离效率。

Claims

1.一种对微生物细胞实施破壁的方法，所述方法包括：

将发酵液的pH值调节到10－14的范围；和

真空浓缩前述步骤所得的发酵液；

从而使所述微生物细胞破壁；

其中，所述微生物为产油单细胞微生物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属的微生物、以及它们的混合物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为Schizochytrium sp.。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为ATCC20888和/或SR21。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，向发酵液中添加碱、碱溶液、或能生成碱的物质，从而将发酵液的pH值调节到10-14的范围。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碱选自碱金属碱、碱土金属碱、或其混合物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙。

8.如权利要求5－7中任一项所述的方法，其特征在于，使用所述碱、碱溶液或能生成碱的物质将发酵液的pH值调节到11－12.5的范围。

9.如权利要求1－7中任一项所述的方法，其特征在于，所述真空浓缩的真空度为29000Pa-66000Pa。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述真空浓缩的真空度为29000Pa-66000Pa。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，向所述发酵液中添加氢氧化钾，将发酵液的pH值调节到11.5-12.5的范围。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，向所述发酵液中添加氢氧化钾和氢氧化钙，将发酵液的pH值范围调节到11.5-12.5的范围；其中，以发酵液质量计，氢氧化钙的添加量为0.1％-0.6％。

13.一种提取微生物活性成分的方法，所述方法包括：

将发酵液的pH值调节到10－14的范围；

真空浓缩前述步骤所得的发酵液，从而使所述微生物细胞破壁；和

从细胞碎片中提取微生物细胞的活性成分；

其中，所述微生物为产油单细胞微生物。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属的微生物、以及它们的混合物。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述微生物为Schizochytrium sp.。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述微生物为ATCC20888和/或SR21。

17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，向发酵液中添加碱、碱溶液、或能生成碱的物质，从而将发酵液的pH值调节到10-14的范围。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述碱选自碱金属碱、碱土金属碱、或其混合物。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙。

20.如权利要求17－19中任一项所述的方法，其特征在于，使用所述碱、碱溶液或能生成碱的物质将发酵液的pH值调节到11－12.5的范围。

21.如权利要求13－19中任一项所述的方法，其特征在于，所述真空浓缩的真空度为29000Pa-66000Pa。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述真空浓缩的真空度为29000Pa-66000Pa。

23.如权利要求13所述的方法，其特征在于，向所述发酵液中添加氢氧化钾，将发酵液的pH值调节到11.5-12.5的范围。

24.如权利要求13所述的方法，其特征在于，向所述发酵液中添加氢氧化钾和氢氧化钙，将发酵液的pH值范围调节到11.5-12.5的范围；其中，以发酵液质量计，氢氧化钙的添加量为0.1％-0.6％。

25.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述活性成分是油脂和蛋白质。