CN103421595A - 一种提取微生物油脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提取微生物油脂的方法。所述方法包括以下步骤：A）制备微生物生物质、低级醇、水的混合物；B）将步骤A）的所述混合物进行破壁，获得破壁混合物；和C）将步骤B）的所述破壁混合物进行离心处理，收集油相。使用本发明的方法具有工艺简单，溶剂用量少，能耗低，油脂品质高以及提取效率高等优点。

Description

一种提取微生物油脂的方法

技术领域

本发明属于油脂分离领域，具体地说涉及一种提取微生物油脂的方法。

背景技术

通过培养收获的微生物细胞一般存在于水相体系中，颗粒细小，含油量高，具有坚韧的细胞壁。因此其油脂提取工艺有其特殊性，与通常的植物油脂的制备有差别。一般微生物油脂的提取包括3个步骤：1.收获微生物的生物质并加以处理（如洗涤/脱水或干燥）；2.细胞破壁，包括物理处理（蒸煮、蒸汽爆破）、化学（热碱、螯合剂）、机械（压榨、均质、研磨）等手段；3.从细胞碎片中提取微生物油脂（如溶剂萃取、直接离心分离）。但上述方法存在许多不足，如微生物收获后的浓缩/干燥步骤，能耗较高；采用有机溶剂萃取存在安全隐患；多次重复萃取溶剂耗量大、蒸发量大等，因此，行业人士对其进行了不断改进，其中，

专利US006166231A提出在水相环境下对微生物细胞进行破壁，然后进行液液萃取操作。该方法无需对微生物细胞进行干燥，两相分离后，细胞碎片保留在水相中，分离较为方便。但其缺点也较为明显：1.水相中的微生物油脂含量较低，萃取过程溶剂耗量大；2.含有细胞碎片的水相体系粘度很高，在与溶剂混合的过程中极易乳化，后续分离较为困难；3.萃取后得到的混合油（微生物油脂和萃取溶剂组成的混合物）需要脱溶处理，该过程需要经过高温，不利于油脂品质提高。

专利CN01806424.8提出了无溶剂提取微生物油脂的方法。在水相环境下对微生物细胞进行破壁，然采用多次水洗、离心的方法，提取微生物油脂。该方法最大的优点在与不采用溶剂提取。缺点也较为明显：1.水相体系的破碎细胞混合物粘度较高，极易乳化，直接进行离心分离较为困难；2.通过水洗可以降低混合物粘度，但是也容易夹带微生物油脂，油脂提取率偏低；3.多次水洗还会产生大量的工业污水。

专利US20090156694A1提出了一种较为新颖的微生物油脂提取方法。将载体油与微生物干物质混合，一同经过机械破壁处理，再固液分离、过滤，得到含有微生物油脂的混合油脂。该方法无需溶剂的加入，简单易行。但其缺点较为明显，所获得的油脂为混合油脂，目标产物（如ARA、DHA）含量低。

因此，业界需要一种分离方法简单、溶剂耗量少、能耗低的微生物油脂提取方法。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种提取微生物油脂的方法，以简单高效地从微生物细胞中提取微生物油脂。

本发明提供的方法包括以下步骤：

A）制备微生物生物质、低级醇和水的混合物；

B）将所述混合物破壁；和

C）将破壁后的混合物进行离心处理，收集油相。

在本发明的一个优选实施例中，微生物生物质来源于微生物干粉、微生物发酵液，及其混合物。

在本发明的一个优选实施例中，微生物干粉通过将微生物发酵液进行喷雾干燥而制备获得。

在本发明的一个优选实施例中，微生物发酵液为经巴氏杀菌的微生物发酵液。

在本发明的一个优选实施例中，该微生物发酵液为浓缩处理的微生物发酵液。

在本发明的一个优选实施例中，该浓缩为离心脱水浓缩。

在本发明的一个优选实施例中，低级醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇之一或其组合物。

在本发明的一个优选实施例中，乙醇与水的比例为1:1.2～1:4，优选为1:1.4-1:3，更优选为1:1.4～1:2，更优选为1:1.8-1:2。

在本发明的一个优选实施例中，异丙醇与水的比例为1:1～1:4，优选为1:2。

在本发明的一个优选实施例中，甲醇与水的比例为1:1～1:4，优选为1:2。

在本发明的一个优选实施例中，混合物中微生物生物质含量低于40%，优选为40％～15％，更优选为30％～20％。

在本发明的一个优选实施例中，混合物的离心为于20-60℃、2000g-6000g，离心2-6min。

在本发明的一个优选实施例中，该方法还包括下述步骤：D）收集离心沉淀，回收所述离心沉淀中残留的微生物油脂。优选的，该离心沉淀中残留的微生物油脂通过正己烷回收。

在本发明的一个优选实施例中，破壁为物理处理破壁、化学破壁和/或机械破壁。优选的，所述物理处理破壁为蒸煮或蒸汽爆破，所述化学破壁为热碱或螯合剂破壁，所述机械破壁为压榨、均质或研磨破壁。

在本发明的一个更优选的实施例中，所述机械破壁为使用砂磨机、高压均质机和/或高速剪切机破壁。

在本发明的一个优选实施例中，所述微生物为选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)的微生物、裂殖壶菌属(Schizochytrium)的微生物、被孢霉属（Mortierella）的微生物、Althornia属的微生物、Aplanochytrium属的微生物、Japonochytrium属的微生物、Labyrinthula属的微生物、Labyrinthuloides属的微生物、Crypthecodinium属的微生物，褐指藻属（Phaeodactylum）的微生物，微绿球藻属（Nanochloropsis）的微生物，裸藻属（Euglena）的微生物，四膜虫属（Tetrahymena）的微生物，螺旋藻属（Spirulina）的微生物，和吾肯氏壶藻属（Ulkenia）的微生物，隐甲藻属（甲藻）（Crypthecodinium（Dinofagellates））的微生物，以及它们的混合物。优选的，所述微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属（甲藻）的微生物，以及它们的混合物。更优选的，所述微生物为Schizochytrium sp.。更优选的，所述微生物为ATCC20888和/或SR21。

使用本发明的方法从微生物中提取油脂，具有以下优点：

（1）工艺简单。本发明无需萃取，将微生物原料、低碳链醇类、水按适当比例混合后，破壁离心后可直接得到微生物油脂。

（2）溶剂用量少。本发明所需溶剂为低碳链醇类（非萃取剂），可与水互溶，较为典型的如乙醇，在提取过程中用量少，离心后获得的低碳链醇类-水溶液可回收利用，降低了溶剂使用量，更环保，成本也更低。

（3）能耗更低。本发明无需混合油脱溶，可减少脱溶过程中的热能消耗。

（4）油脂品质更高。本发明采用低碳链醇类和水的混合物提取油脂，在固液分离过程中，大量色素和极性物质被极性层（低碳链醇类和水的混合物）带走，所获得的微生物油脂色泽浅、AV低。同时本发明无需脱溶步骤，微生物油脂无需经历高温处理，故氧化稳定性更好。

（5）提取效率高。在优选方案中，可通过控制低碳链醇类和水的比例，减少或避免乳化现象，通过单次离心操作即可获得微生物油脂，同时对分离条件的要求也较低。

具体实施方式

下面结合优选的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些优选的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。

在本发明中，“低级醇”和“低碳链醇类”可互换，指的是具有1-4个碳原子的醇。低级醇的实例包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等。甲醇、乙醇和异丙醇，特别优选乙醇。

在本发明中，微生物在包括但不限于“生物反应器”和“发酵罐”中培养，“生物反应器”和“发酵罐”指的是通常使细胞在悬浮液中进行培养的封闭装置或部分封闭装置，如发酵槽或发酵容器。“发酵”指的是利用培养条件有意促进一种或多种细胞（通常是微藻）的生长和/或繁殖。

“干物质”或“微生物干粉”指的是生物质中基本上所有的水已被移除后剩下的物质/组分。

“细胞破壁”指的是生物有机体的细胞破坏成足以释放至少一部分细胞内容物。

在本发明中，“微生物”指的是任何微观的单细胞生物体，所述微生物可从其培养物中获得。本发明的方法可以用于多种能产生合适的油和/或脂质的微生物，微生物油和/或脂质优选源于选自以下的微生物：破囊壶菌属(Thraustochytrium)的微生物、裂殖壶菌属(Schizochytrium)的微生物、被孢霉属（Mortierella）的微生物、Althornia属的微生物、Aplanochytrium属的微生物、Japonochytrium属的微生物、Labyrinthula属的微生物、Labyrinthuloides属的微生物、Crypthecodinium属的微生物，褐指藻属（Phaeodactylum）的微生物，微绿球藻属（Nanochloropsis）的微生物，裸藻属（Euglena）的微生物，四膜虫属（Tetrahymena）的微生物，螺旋藻属（Spirulina）的微生物，和吾肯氏壶藻属（Ulkenia）的微生物，隐甲藻属（甲藻）（Crypthecodinium（Dinofagellates））的微生物，以及它们的混合物。在其它实施方案中，微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属（甲藻）的微生物，以及它们的混合物。其中，能产出高含量的合适的油和/或脂质的微藻是优选的，优选的微藻包括但不限于破囊壶菌微生物，如Schizochytrium sp.，如ATCC20888，SR21。

“藻油”指的是由微藻细胞产生的脂质组分，如富含DHA和/或ARA的脂质。

“巴氏灭菌”指的是旨在减慢微生物生长的加热过程。通常情况下，巴氏灭菌在高温下短时间进行。

在本发明的下述实施例中，细胞破壁采用机械破壁的方法进行，但对于本领域的技术人员而言，可采用其他方法，包括物理处理（蒸煮、蒸汽爆破）、化学（热碱、螯合剂）、机械（压榨、均质、研磨）等进行常规的细胞破壁方法也是可行的，具体如调节发酵液的温度和pH，促使细胞溶解以实现破壁，或采用超声波进行细胞破壁，或采用单一或混合酶系进行破壁等，均是本领域中可行的常规细胞破壁方式。

在本发明的下述实施例中，使用的用于油脂抽提的微生物生物质包括微生物干粉（例如藻粉）和微生物发酵液（例如藻细胞发酵液），其中，

藻粉为将产油藻类，如Schizochytrium sp.，进行发酵培养，获得的发酵液通过喷雾干燥制备，经检测，其含水量约为3.2％；

藻细胞发酵液为将产油藻类，如Schizochytrium sp.，进行发酵培养，获得的发酵液经过巴氏杀菌制备获得，优选的，发酵液为浓缩发酵液，更优选的，该浓缩发酵液通过直接离心脱水制备或在发酵液中加入低级醇后离心制备。

但事实上，在本发明中，在藻类发酵液中加入藻粉，以提高发酵液中藻细胞的含量，也是一种可行的方法。

在本发明中， Schizochytrium sp.的发酵培养采用常规方法进行，如可参考：专利CN100491519C中的方法进行。

本发明的下述实施例中，预混的混合物中乙醇与水的比例为1:1.2～1:4，优选为1:1.4-1:3，更优选为1:1.8-1:2，再优选为1:1.4～1:1.3

本发明的下述实施例中，预混的混合物中甲醇与水的比例为1:1～1:4，优选为1:2。

本发明的下述实施例中，预混的混合物中异丙醇与水的比例为1:1～1:4，优选为1:2。

本发明的下述实施例中，藻粉与乙醇水溶液的混合物中的藻粉含量为低于40%，优选为40％～15％，更优选为30％～20％。

本发明的下述实施例中，细胞使用Puhler PHN0.5型砂磨机进行机械破碎，但也可以使用高压均质机、高速剪切机等设备，或者将这些设备的联用以进行机械破壁。

在本发明的下述实施例中，正己烷抽提采用US6166231A中的方法进行，如无特殊说明，则为采用分批重复抽提。

在本发明中，“离心”指用于通过离心力分离液体悬浮液中固体物质的悬浮颗粒。工业上通常使用的蝶式离心机、卧螺式离心机均可用于本发明的离心操作。在本发明的下述实施例中，混合物的离心采用常规方法进行，例如，可以采用《发酵和生化工程手册：原理、方法设计和设备》，Fermentation andBiochemical Engineering Handbook：Principles，Process Design，& Equipment，ed. by Vogel and Todaro，Noyes Publications，Westwood，NJ，1997，第12章“离心”(centrifugation)中的方法，也可以采用以下方法：将混合物在20-60℃、2000g-6000g，于离心机中离心2-6min。

在本发明的下述实施例中，使用的检测方法如下：

油脂含量检测：参考US6166231A的方法；

油脂酸价（AV）检测按GB/T 5530-2005 动植物油脂 酸值和酸度测定中的方法进行；

油脂过氧化值（PV）检测：按GB/T 5538-2005 动植物油脂 过氧化值测定中的方法进行；

油脂颜色检测：按GB/T 22460-2008 动植物油脂 罗维朋色泽的测定中的方法进行；

油脂脂肪酸组成检测：按GB/T 17377-2008 动植物油脂 脂肪酸甲酯的气相色谱分析中的方法进行；

粘度检测：按GB/T 22427.7-2008 淀粉粘度测定中的方法进行。

实施例1、微生物油脂提取

预混合：将1250g藻粉（理论含油量为624.75g）与3750g乙醇水溶液（乙醇:水=1:1.8）混合后，用高速搅拌机处理20min，使得藻粉细胞与乙醇溶液混合均匀。

机械破碎：采用砂磨机进行破壁处理，处理速度40min。

离心：4000g的条件下，对混合物进行离心分离，得到3相，其中上层为微生物油脂，中层为乙醇-水溶液，下层为湿藻粕。

回收上层油相，获得毛藻油487.37g，其回收率为78.01％；

回收下层微生物细胞残渣，获得湿藻粕（微生物细胞残渣和乙醇溶液的混合物）1400.93g；

回收中层的乙醇-水溶液，经检测，其乙醇:水=1:1.8，乙醇溶液中油脂含量小于0.5％，因此，该乙醇溶液可循环利用。

对比例1、正己烷回收藻油

使用正己烷回收藻油，以作为对照，其具体步骤如下：

破壁：配置2000 g藻液（200g藻粉+1800g水复配），预混合后，砂磨机破壁。

正己烷抽提：向破壁后的发酵液中加入2000g正己烷，搅拌萃取1h。

离心：6000g的条件下，对混合物进行离心分离，得到3相，其中上层为混合油（正己烷和藻油混合物），中层为水相，下层为藻粕（微生物细胞残渣和水的混合物）。

脱溶：回收上层混合油（正己烷和藻油混合物），60℃真空脱溶后得到藻油69.49g（首次回收），得率为69.52%。

将实施例1回收的离心藻油和对比例1回收的藻油进行比较，结果如表1和表2所示。

表1、藻油常规指标比较

表2、藻油脂肪酸组成比较

根据表1和表2的结果，采用实施例1中直接离心获得的藻油，其品质更好，回收的目标脂肪酸DHA含量也更高。而且，本发明的方法操作更简单，减少了生产的能耗；乙醇-水溶液可回收利用，减少了溶剂消耗；不仅降低了成本，而且对环境也更友好。

发明人为进一步提高实施例1中藻油的回收率，使用正己烷对获得的藻粕进行进一步抽提，获得毛藻油82.34g，其回收率为13.18%；因此，当采用先用乙醇-水溶液回收藻油，再将湿藻粕用正己烷回收藻油的方法，藻油的总回收率可达91.19％。

与使用正己烷直接抽提藻油的方法相比，采用“先用乙醇-水溶液回收藻油，再将湿藻粕用正己烷回收藻油”的方法，不仅能提高藻油的总回收率，而且由于78％的油脂是采用直接离心获得，其品质好、能耗低；同时，在乙醇-水溶液回收之后的藻粕中，残留的藻油较少，因此，在提高藻油总回收率的同时，还可大幅降低正己烷的总用量。

实施例2、藻粉浓度的影响

2.1、藻粉浓度对藻油回收率的影响

为考察藻粉浓度对藻油回收率的影响，分别制备了藻粉含量为15%、20%、25%、30%和35%的样品，其中使用的乙醇水溶液中乙醇:水=1:1.5，藻粉与乙醇水溶液的混合物总量均为3000g。将制备获得的样品，分别使用砂磨机处理30min。

将上述样品分别在4000g条件下离心分离，收集上层微生物油脂。微生物油脂回收率信息见表3。

表3、藻粉浓度对油脂回收率的影响

2.2、藻粉浓度对混合体系粘度的影响。

为考察藻粉浓度对混合体系粘度的影响，分别制备了藻粉含量为10%、20%、30%、40%和50%的样品，其中使用的乙醇水溶液中乙醇:水=1:1.5，藻粉与乙醇水溶液的混合物总量均为50g。检测制备获得的样品的粘度，结果如表4所示。

表4、藻粉浓度对混合体系粘度的影响

根据表4结果，当藻粉浓度高于40％后，体系流动性变差，将导致随后的破壁和相关分离操作无法正常进行，因此，应将藻粉浓度控制为低于40%。

根据上述结果，预混合步骤中藻粉浓度对体系的流动性以及藻油回收率均有重要影响，因此，需要控制藻粉浓度。根据上述实验结果，应将藻粉浓度控制为低于40%，优选为40％～15％，更优选为30％～20％。

实施例3、乙醇和水的比例对藻油回收率的影响

分别配制乙醇：水为1:1，1:1.2，1:1.4，1:1.6，1:1.8，1:2，1:3和1:4的乙醇水溶液，将藻粉与不同比例的乙醇水溶液混合，获得预混的混合物，藻粉在混合物中的比例为22.31％。

将获得的混合物经破壁和离心处理，观察离心后的乳化情况，并收集微生物油脂，计算回收率，结果如表5所示。

表5、乙醇和水的比例对藻油回收率的影响

根据表5的结果，混合物中乙醇与水的合适比例为1:1.2～1:4，优选乙醇：水=1:1.4-1:3，更优选为1:1.4-1:2，更优选为1:1.8-1:2。

根据上述结果，使用乙醇-水溶液，能从藻粉中回收藻油，特别是当乙醇-水溶液的密度大于油脂密度时，其效果更优异；更优地，调节乙醇和水至合适比例（1:1.4-1:3），使离心后的油脂层与低级醇-水层间无乳化层或仅有少量乳化层，从而避免乳化的影响，提高油脂提取效率。

实施例4、低级醇-水溶液提油

分别配制甲醇:水=1:1，1:2，1:3，1:4，1:5的甲醇-水溶液，异丙醇:水=1:1，1:2，1:3，1:4，1:5的异丙醇-水溶液-，用于藻油抽提，以蒸馏水作为对照。

将藻粉与不同比例的上述溶液混合，获得预混的混合物，控制藻粉在混合物中的比例约为20％。

将获得的混合物经破壁和离心处理，观察离心后的乳化情况，并收集微生物油脂，计算回收率，其中水溶液样品为对照样，结果如表6所示。

表6、不同浓度的异丙醇-水溶液的抑制乳化效果

根据表6的结果，使用甲醇-水溶液和异丙醇-水溶液等低级醇-水溶液都具有明显的抑制乳化效果，当上述溶液中低级醇:水=1:2～1:4时效果较好，优选低级醇:水=1:2；当上述低级醇:水=1:5时，抑制乳化效果减弱，藻油回收率降低；低级醇:水=1:1时，低级醇-水溶液密度小于油脂，油脂层在中层，藻油回收率偏低。

根据上述实施例的结果，使用低级醇-水溶液，能从藻粉中回收藻油，特别是当低级醇-水溶液的密度大于油脂密度时，其效果更优异；更优地，调节低级醇和水至合适比例，使离心后的油脂层与低级醇-水层间无乳化层或仅有少量乳化层，可避免乳化的影响，提高油脂提取效率。

在进行上述低级醇-水溶液提油实验时，同样要考察藻粉浓度的影响。实验显示，上述低级醇具有类似的性质，均会随着藻粉浓度的升高，混合体系粘度增加明显，因此，为了保证混合体系拥有较好的操作性能，应将藻粉浓度控制为低于40%；但藻细胞浓度过低时，混合体系（低级醇-水溶液及藻粉形成的混合体系）中油脂所占比例小，不利于油脂颗粒相互结合形成油相，因此为了提高油脂回收率，优选藻粉浓度＞15％，即优选的藻粉浓度为40％～15％，更优的，当藻粉浓度为30％～20％时，具有更好的油脂回收率。

在上述方法中，使用低级醇-水溶液从藻粉中回收藻油，由于需要先将发酵液干燥成藻粉（脱水），再将藻粉与低级醇-水溶液混合（加水），制备藻粉、低级醇和水的混合物，由于发酵液干燥成藻粉是高能耗步骤，同时干燥过程的热效应可能会降低藻油的品质，因此发明人直接使用发酵液进行了提油实验，以便确定能否直接使用发酵液进行提油。

实施例5、发酵液直接提油

发明人在发酵液中加入乙醇并搅拌，获得混合物，控制混合物中的乙醇：水为1:2，然后破壁、离心，具体步骤如下：

预混合：分别称取湿藻液（灭菌处理后的发酵液，干物质含量为10％）各2010g，按照水：乙醇=2:1和18:1分别添加乙醇，用高速搅拌机处理20min，使得藻细胞与乙醇溶液混合均匀。

破壁：取样，采用砂磨机进行破壁处理，处理时间20min。

离心：6000g的条件下，对混合物进行离心分离，得到3相，其中上层为微生物油脂，中层为乙醇溶液，下层为湿藻粕，观察离心后溶液的乳化情况，结果如表7所示。

提油：收集上层油脂，烘箱烘干，收获毛藻油，分别计算回收率，结果如表7所示。

表7、直接对发酵液提油的结果

在本实施例中，藻油回收率偏低，这可能是由于湿藻液中干物质含量过低（仅为10％），导致混合物中藻细胞含量过低，从而影响回收率。为了对此进行考察，发明人在破壁前对混合物进行了浓缩操作。

实施例6、乙醇-水溶液预浓缩发酵液提油

预混合：称取湿藻液（同实施例5）2010g。按照水：乙醇=2:1添加乙醇905g，混匀后离心浓缩，除去上层乙醇水溶液2111g，得到预浓缩的藻液和乙醇混合物804g，其中干物质：水：乙醇=1:2:1，用高速搅拌机处理20min，使得藻细胞与乙醇溶液混合均匀。

破壁：取样700g，采用砂磨机进行破壁处理，处理时间20min。

离心：6000g的条件下，对混合物进行离心分离，得到3相，其中上层为微生物油脂，中层为乙醇溶液，下层为湿藻粕。

提油：收集上层油脂，烘箱烘干，收获毛藻油64.81g，回收率75.58%。

根据上述结果，使用乙醇-水溶液对发酵液进行预浓缩后，毛藻油的回收率得到明显提高。

实施例7、乙醇和水的比例对发酵液提油的影响

按实施例6的方法处理发酵液，但在预混合步骤，分别控制干物质：水：乙醇=2:4:1，1.8:3:1，1.5:2:1，1:1.2:1。

将获得的混合物分别经破壁和离心处理，观察离心后的乳化情况，并收集微生物油脂，计算回收率，结果如表8所示。

表8、乙醇和水的比例对发酵液提油的影响

根据表8的结果，乙醇：水的比例为1:1.2-1:4时，能有效回收浓缩后的发酵液中的藻油。

实施例8、发酵液先浓缩再添加乙醇的提油

为了减少乙醇的耗量，发明人尝试了先预浓缩发酵液，再添加乙醇的方法破壁提油，具体步骤如下：

预浓缩：称取发酵液（同实施例6）3007g，离心去除上清液，得到预浓缩发酵液，浓缩后发酵液中干物质：水=1:2.7。

预混合：按水：乙醇=3:1，向预浓缩的发酵液中添加乙醇。

破壁：采用砂磨机进行破壁处理，处理时间20min。

提油：对破壁后混合物进行离心分离，得到3相，其中上层为微生物油脂，中层为乙醇溶液，下层为藻粕。收集上层液得到藻油，回收率为56.37％。

上述结果显示，将发酵液先浓缩在添加低级醇（如乙醇）进行提油，也能获得良好的效果。

将实施例5-8中获得的毛藻油与正己烷回收的藻油进行比较（在实施例5和7中，分别以乙醇：水=1:2的混合物中回收获得的毛藻油为例），结果如表9所示。

表9、藻油常规指标比较

根据表9结果，实施例5-8中获得的乙醇-水溶液预浓缩发酵液提取的藻油的AV、PV、色泽均好于正己烷回收的藻油。

上述结果显示，直接向发酵液中加入乙醇进行提油，也能获得良好的效果，例如，其提取的藻油的AV、PV、色泽均好于正己烷回收的藻油；如果对发酵液或混合物先行浓缩，则其得率将能得到进一步的提高。

实施例9、不同低级醇的影响

按实施例7的方法，分别考察了向发酵液中加入甲醇或异丙醇的提油效果，其中发酵液中干生物质含量为27.03％，机械破壁后离心处理，比较离心后油脂状态，结果见表10和表11。

表10、不同浓度的甲醇-水溶液的抑制乳化效果

表11、不同浓度的异丙醇-水溶液的抑制乳化效果

根据上述结果，向藻类发酵液中加入低级醇，能有效回收藻油，特别是当形成的低级醇-水溶液的密度大于油脂密度时，其效果更优异，更优的为低级醇的加入量调节至使离心后的油脂层与低级醇-水层间无乳化层或仅有少量乳化层。

根据实施例5-9的结果，向藻类发酵液中加入低级醇，例如乙醇，能有效回收藻油，特别是当形成的低级醇-水溶液的密度大于油脂密度时，其效果更优异，更优的为低级醇的加入量调节至使离心后的油脂层与低级醇-水层间无乳化层或仅有少量乳化层。在上述操作过程中，如能能预先浓缩发酵液或在加入低级醇后浓缩混合物，提高用于破壁的混合物中干物质浓度，能进一步提高藻油的回收率。

本发明的方法具有以下优点：

（1）工艺简单。本发明无需萃取，将微生物原料、低碳链醇类、水按适当比例混合后，破壁离心后可直接得到微生物油脂。

（2）溶剂用量少。本发明所需溶剂为低碳链醇类（非萃取剂），可与水互溶，较为典型的如乙醇，在提取过程中用量少，离心后获得的低碳链醇类-水溶液可回收利用，降低了溶剂使用量，更环保，成本也更低。

（3）能耗更低。本发明无需混合油脱溶，可减少脱溶过程中的热能消耗。

（4）油脂品质更高。本发明采用低碳链醇类和水的混合物提取油脂，在固液分离过程中，大量色素和极性物质被极性层（低碳链醇类和水的混合物）带走，所获得的微生物油脂色泽浅、AV低。同时本发明无需脱溶步骤，微生物油脂无需经历高温处理，故氧化稳定性更好。

（5）提取效率高。在优选方案中，可通过控制低碳链醇类和水的比例，减少或避免乳化现象，通过单次离心操作即可获得微生物油脂，同时对分离条件的要求也较低。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (21)

1.一种提取微生物油脂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A）制备微生物生物质、低级醇和水的混合物；

B）将所述混合物破壁；和

C）将破壁后的混合物进行离心处理，收集油相。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物生物质来源于微生物干粉、微生物发酵液，及其混合物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物干粉通过将微生物发酵液进行喷雾干燥而制备获得。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物发酵液为经巴氏杀菌的微生物发酵液。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物发酵液为浓缩处理的微生物发酵液。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述浓缩为离心脱水浓缩。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低级醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇之一或其组合物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乙醇与水的比例为1:1.2～1:4，优选为1:1.4～1:3，更优选为1:1.4-1:2，更优选为1:1.8-1:2。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述异丙醇与水的比例为1:1～1:4，优选为1:2-1:3，更优选为1:2。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述甲醇与水的比例为1:1～1:4，优选为1:2-1:3，更优选为1:2。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤A）中所制备的混合物中微生物生物质含量低于40%，优选为40％～15％，更优选为30％～20％。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心为于20-60℃、2000g-6000g，离心2-6min。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括下述步骤：

D）收集离心沉淀，回收所述离心沉淀中残留的微生物油脂。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述离心沉淀中残留的微生物油脂使用正己烷回收。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述破壁为物理处理破壁、化学破壁和/或机械破壁。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述物理处理破壁为蒸煮或蒸汽爆破破壁，所述化学破壁为热碱或螯合剂破壁，所述机械破壁为压榨、均质或研磨破壁。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述机械破壁为使用砂磨机、高压均质机和/或高速剪切机破壁。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物为选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)的微生物、裂殖壶菌属(Schizochytrium)的微生物、被孢霉属（Mortierella）的微生物、Althornia属的微生物、Aplanochytrium属的微生物、Japonochytrium属的微生物、Labyrinthula属的微生物、Labyrinthuloides属的微生物、Crypthecodinium属的微生物，褐指藻属（Phaeodactylum）的微生物，微绿球藻属（Nanochloropsis）的微生物，裸藻属（Euglena）的微生物，四膜虫属（Tetrahymena）的微生物，螺旋藻属（Spirulina）的微生物，和吾肯氏壶藻属（Ulkenia）的微生物，隐甲藻属（甲藻）（Crypthecodinium（Dinofagellates））的微生物，以及它们的混合物。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属（甲藻）的微生物，以及它们的混合物。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述微生物为Schizochytrium sp.。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述微生物为ATCC20888和/或SR21。