CN101168501B - 一种从隐甲藻中提取并精制富含dha脂肪酸的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从隐甲藻中提取并精制富含DHA脂肪酸的工艺。该工艺先将隐甲藻Crypthecodinium cohnii发酵液絮凝处理再进行固液分离，通过碱破壁后再将细胞机械破碎，然后对破碎的菌体采用有机溶剂萃取，获得DHA粗油；DHA粗油经过脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到DHA精油。该方法操作简单，可降低DHA油脂的提取成本，操作过程中仅采用有机溶剂，最终无残留，经精制后提高了DHA油脂的质量，其提取物中DHA含量在40～50％左右，适合DHA规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种从隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)中提取并精制富含DHA脂肪酸的工艺。
背景技术
DHA(Docosahexaenoic acid，22：6△4.7.10.13.16.19，全名二十二碳六烯酸)是一种重要的长链多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，简称PUFA)，属于n-3系列。DHA作为细胞膜合成的必要成分，具有增强视力、促进脑细胞发育等作用，是婴幼儿大脑生长发育和成年人大脑正常功能维持的必要成分，被誉为“脑黄金”。DHA也可以降血脂、预防和治疗动脉硬化、抗炎、抗癌等作用。因而，DHA受到了食品界和医疗界的广泛关注。
传统的DHA生产原料主要来源于鱼油，但鱼的种类、季节、地理位置等因素的差异造成了油含量和油中不饱和脂肪酸含量的不稳定；鱼油提取获得的DHA胆固醇含量高，且含有大量的EPA(Eicosapetaenoic acid，22：5)及多种矿物质；再加上鱼油来源日渐紧缺，难以实现此种高价值产品在食品和医药行业中的广泛应用。为满足DHA不断增长的市场需求、克服从传统鱼油提取DHA的不足，近年来，科学工作者开展了利用海洋微生物发酵生产DHA的研究。常用的微生物包括隐甲藻、破囊弧菌、裂殖弧菌等，其中隐甲藻脂肪酸组成较为单一，总脂含量达20％，DHA占30-50％，其他不饱和脂肪酸百分率小于1％，是DHA高效的生产菌之一。
目前国内的专利主要集中在从鱼油中分离提取长链多不饱和脂肪酸，仅有两篇专利涉及微藻发酵生产长链多不饱和脂肪酸的方法(申请号：94106621.5和00135338.1)，但内容比较简单，没有对微藻中脂肪酸提取方法进行详细描述。
发明内容
本发明的目的是提供了一种采用有机溶剂高效萃取隐甲藻体内的脂肪酸并精制DHA的方法。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
一种从隐甲藻Crypthecodinium cohnii中提取并精制富含DHA脂肪酸的方法，该方法先将隐甲藻发酵液絮凝处理再进行固液分离，通过碱破壁后再将细胞机械破碎，然后对破碎的菌体采用有机溶剂萃取，获得DHA粗油(即富含DHA的粗油)；DHA粗油经过脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到DHA精油(即富含DHA的精制脂肪酸)。
所述的方法，其中絮凝处理采用的絮凝剂为明矾、硫酸铝、无水CaCl2、三氯化铁、聚合氯化铝(PAC)、聚合硫酸铁(PFS)或聚丙烯酰胺(PAM)。
所述的方法，其中絮凝剂的用量为隐甲藻发酵液质量的1-2％。
所述的方法，其中固液分离方法采用静置、添加酒精、离心的方法。
所述的方法，其中所用破壁碱液采用NaOH或KOH配制，pH为12-14。
所述的方法，其中机械破碎采用胶体磨和高压均质机破碎细胞。
所述的方法，其中萃取时按质量比为水∶物料(即破碎的菌体，下同)∶有机溶剂＝1∶1∶3～1∶1∶7的比例进行萃取，搅拌20～40min，静置分层，最下层为水，中层为料渣，上层为有机溶剂和DHA粗油，取上层溶液通过减压蒸发器将有机溶剂蒸出，获得DHA粗油。
所述的方法，其中萃取所用的有机溶剂为环己烷、正己烷、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、六号溶剂、四号溶剂。(四号溶剂为丙烷、丁烷混合物，六号溶剂汽油，其主要成分为正己烷和庚烷，是石油生产过程中的一种副产品。)
所述的方法，其中粗油精制时脱胶采用磷酸，碱炼采用NaOH，脱色采用活性炭和白土，脱臭采用过饱和蒸汽。
所述的方法，其中隐甲藻发酵液是通过下列方法获得的：
先将隐甲藻活化三代后进行种子培养，获得活力较高的藻种(即处于对数生长期的藻种)，在含有碳源、氮源、无机盐离子、微量元素的培养基中发酵，收获藻体。其中碳源优选葡萄糖，氮源优选酵母膏，无机盐离子可以是钠盐、镁盐、钾盐、磷酸盐、钙盐等，微量元素可以是Mn2+、Co2+、MnO4 2+、Ni2+、Fe2+等。
以下对本发明的方法作进一步的描述：
一、隐甲藻的培养
取一管保藏的菌体(Crypthecodinium cohnii ATCC 30556，购买于美国菌种保藏中心)，接种至装有50ml培养基的250ml的摇瓶中。在20～30℃的摇床中以150～200rpm的转速，培养36h，待葡萄糖浓度降为10g/l时完成第一代活化，然后取2ml菌液接种到上述新鲜培养基中，同法连续培养三代(均以培养基中葡萄糖浓度降为10g/l时作为一代活化完成)，得到具有较高活力的种子液(即处于对数生长期)；再以1～10％的接种量接种该种子液到5L的发酵罐中进行搅拌培养，搅拌转速在100～200之间，通气量在0.2-2vvm，通过控制转速使发酵罐中溶氧控制在20-100％之间(发酵罐开始培养时的溶氧定为1即100％)，采用0.3％(w/v)silicone SE-2作为消泡剂，通过自动添加2M HCL或NaOH维持pH在6～7之间。对糖浓度进行测定，当葡萄糖浓度降为10g/l左右时流加葡萄糖以延长菌体的产脂阶段，发酵5天，放罐。
上述方法中采用的培养基，包括碳源、氮源、无机盐离子、微量元素等，其中碳源优选葡萄糖，氮源优选酵母膏，无机盐离子可以是钠盐、镁盐、钾盐、磷酸盐、钙盐等，微量元素可以是Mn2+、Co2+、MnO4 2+、Ni2+、Fe2+等。
二、粗油的提取及精制
(1)发酵液固液分离
本发明中采用先絮凝后离心的固液分离方法。
絮凝工艺中向隐甲藻发酵液中按照隐甲藻发酵液质量比1～2％的比例添加絮凝剂，使细胞絮凝并沉淀，将上层的水除去；再添加酒精，降低溶液的密度，使得菌体的浮力减小，利于菌体的沉降，同样将上层液体除去。下层菌体离心，进一步除水。本发明中发酵液粘度太大，若对整个发酵液都采取离心，无法进行，一般采用滚动干燥器干燥。但是能耗太高，且高温使DHA部分氧化，降低油的质量。因此，先将发酵液中大部分水采用物理絮凝方法去除，具有创新性。
(2)细胞破碎
本发明采用机械破碎法对藻体进行破碎。
首先用NaOH配制pH为12～14左右的水溶液，将上步离心所得的细胞倒入该溶液中，碱性环境下进行破壁；然后将细胞送入胶体磨中，将物料磨成小颗粒状，送入均质机中高压破碎，获得破碎菌体。再次离心除去破碎菌体中的水份。
(3)粗油提取
本发明采用有机溶剂萃取法对脂肪酸进行抽提。
按照水∶物料∶有机溶剂(质量比)＝1∶1∶3～1∶1∶7的比例在萃取罐中进行萃取，搅拌30min左右，停止搅拌，静置分层。最下层为水，中层为料渣，上层为有机溶剂和粗油。取上层溶液通过减压蒸发器将有机溶剂蒸出，反复使用，获得DHA粗油。
(4)粗油精制
本发明通过脱胶、碱炼、脱色、脱臭对粗油进行精制，去除DHA粗油中的杂质、胶质、色素、脂肪酸等一些影响油脂质量的物质。
脱胶采用磷酸，碱炼采用NaOH脱酸，中和油脂中游离的脂肪酸；脱色采用活性炭和白土利用脱色及表面吸附性除去油脂中的色素及其他杂质，脱臭采用过饱和蒸汽除去油脂中的臭味。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种采用有机溶剂高效萃取隐甲藻体内脂肪酸并精制DHA的方法，该方法操作简单，可降低DHA油脂的提取成本，操作过程中仅采用有机溶剂，最终无残留，经精制后提高了DHA油脂的质量，其提取物中DHA含量在40～50％左右，适合DHA规模化生产。
附图说明
图1是本发明提取和精制DHA工艺流程图。
图2是本发明提取的DHA油脂的GC-MS图谱(各种脂肪酸峰面积图)。
图3是本发明提取的DHA油脂的GC-MS图谱(DHA质谱图)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明。这些实施例仅起说明的目的，而不作为限制本发明的界限。
一般性说明：
1、隐甲藻培养方法：
取一管保藏的菌体(Crypthecodinium cohnii ATCC 30556，购买于美国菌种保藏中心)，接种至装有50ml培养基的250ml的摇瓶中，在20-30℃的摇床中以150～200rpm的转速，培养36h，待葡萄糖浓度降为10g/l时完成第一代活化，然后取2ml菌液接种到上述新鲜培养基中，同法连续培养三代(均以培养基中葡萄糖浓度降为10g/l时作为一代活化完成)，得到具有较高活力的种子液(处于对数生长期)；再以1～10％的接种量接种该种子液到5L的发酵罐(发酵培养基装液量一般为发酵罐的60％，即3L，下同)，中进行搅拌培养，搅拌转速在100～200之间，通空气量在0.2～2vvm，通过控制转速使发酵罐中溶氧控制在20～100％之间(发酵罐开始培养时的溶氧定为1即100％)，采用silicone SE-2作为消泡剂，silicone SE-2在培养液中的浓度为0.3％(w/v)，通过自动添加2M HCL或NaOH维持pH在6～7之间。对糖浓度进行测定，当葡萄糖浓度降为10g/l左右时流加葡萄糖以延长菌体的产脂阶段，发酵5天(发酵温度25℃)，放罐。
所述方法中采用的培养基，包括碳源、氮源、无机盐离子、微量元素等，其中碳源采用葡萄糖，氮源采用酵母膏，无机盐离子包括钠盐、镁盐、钾盐、磷酸盐、钙盐等，微量元素包括Mn2+、Co2+、MnO4 2+、Ni2+、Fe2+等。
2、糖浓度的测定：SBA-40C生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所生产)测定。
3、菌体干重的测定：干重法，将一定量的培养液装入预先称重的滤纸中，5000r/min，离心10min，沉淀后用去离子水清洗三次，60℃真空干燥，冷却后称重，直至恒重。
4、脂肪酸检测方法：
本发明采用气质联用的方法对脂肪酸含量进行分析。
首先进行DHA油甲酯化处理：取0.3g DHA油，加入浓度为5％(w/v)的KOH的甲醇溶液1ml，置于10ml容量瓶中，于60℃水浴2～3小时进行皂化，冷却后加入2ml甲醇和1.5ml 45％(w/v)的三氟化硼-乙醚，60℃水浴10min。冷却后加3ml正己烷振荡后加1ml饱和食盐水静置，最后取1～2滴上清液加0.5ml正己烷稀释，加少量无水硫酸钠干燥后备用。
气质联用法分析：采用Thermo finnigan trace GC2000 DSQ色谱，FID检测器，DB-5MS毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；载气为氦气，流速：1mL/min，分流比：10/1，进样温度：250℃，检测温度：260℃，柱温采取程序升温：初始温度：200℃，以5℃/min的速度升温至225℃，停5min；继续以5℃/min的速度升温至250℃，停5min。进样量：1μL。
5、本发明提供的提取和精制DHA方法工艺流程图见图1。
实施例1 5L发酵罐发酵收获藻体的脂肪酸提取及精制
按照上述培养方法进行5L罐发酵，收获藻体。将发酵液倒入溶剂罐中，添加45g三氯化铁，使细胞絮凝沉淀，静置后，将上层溶液放出，向罐中加入800ml酒精，使更多的菌体沉降，同样放出上层液体，用离心机将上述获得的菌体离心，实现进一步的固液分离。用NaOH配制pH为14的水溶液，将上步得到的菌体倒入进行碱破壁，然后将细胞送入胶体磨中，将物料磨成小颗粒状，送入均质机中高压破碎，获得破碎的菌体。再次离心(转速8000rpm)除水，将破碎菌体倒入萃取罐，将其倒入萃取罐，按照质量比为水∶物料(破碎后的菌体)∶乙酸乙酯＝1∶1∶5.5的比例进行萃取，搅拌30min左右，停止搅拌，静置分层。取上层溶液通过减压蒸发器将乙酸乙酯蒸出，回收溶剂，获得DHA粗油。DHA粗油加入磷酸脱胶，NaOH碱炼脱酸，中和油脂中游离的脂肪酸，采用活性炭和白土脱色除去油脂中的色素及其他杂质，采用过饱和蒸汽除去油脂中的臭味，获得较DHA精油。
测定发酵液生物量(即菌体干重)、提取的总脂肪酸量、DHA含量(即DHA量/总脂肪酸量)，具体实验数据如下：
| 5L罐数据 | 生物量 | 总脂肪酸量 | DHA含量 |
| 235g | 108g | 42.85％ |
实施例2 5L发酵罐发酵收获藻体的脂肪酸提取及精制
按照上述培养方法进行5L罐发酵，收获藻体。将发酵液倒入溶剂罐中，添加45g硫酸铝，使细胞絮凝沉淀，静置后，将上层溶液放出；向罐中加入800ml酒精，使更多的菌体沉降，同样放出上层液体；用离心机将上述获得的菌体离心，实现进一步的固液分离。用NaOH配制pH为13的水溶液，将上步得到的菌体倒入进行碱破壁，然后将细胞送入胶体磨中，将物料磨成小颗粒状，送入均质机中高压破碎，获得破碎的菌体。再次离心(转速8000rpm)除水，将破碎菌体倒入萃取罐，将其倒入萃取罐，按质量比为水∶物料∶六号溶剂＝1∶1∶5的比例进行萃取，搅拌30min左右，停止搅拌，静置分层。取上层溶液通过减压蒸发器将六号溶剂蒸出，回收溶剂，获得DHA粗油。DHA毛油加入磷酸脱胶，NaOH碱炼脱酸，中和油脂中游离的脂肪酸，采用活性炭和自土脱色除去油脂中的色素及其他杂质，采用过饱和蒸汽除去油脂中的臭味，获得较高品质的DHA精油。
测定发酵液生物量(即菌体干重)、提取的总脂肪酸量、DHA含量(即DHA量/总脂肪酸量)，具体实验数据如下：
| 5L罐数据 | 生物量 | 总脂肪酸量 | DHA含量 |
| 245g | 130g | 41.67％ |
实施例35吨发酵罐发酵收获藻体的脂肪酸提取及精制
按照上述培养方法进行5吨罐发酵，收获藻体。将发酵液倒入溶剂罐中，添加50kg聚合氯化铝，使细胞絮凝沉淀，静置后，将上层溶液放出；向罐中加入15L酒精，使更多的菌体沉降，同样放出上层液体；用离心机将上述获得的菌体离心，实现进一步的固液分离。用NaOH配制pH为12的水溶液，将上步得到的菌体倒入进行碱破壁，然后将细胞送入胶体磨中，将物料磨成小颗粒状，送入均质机中高压破碎，获得破碎的菌体。再次离心(转速8000rpm)除水，将破碎菌体倒入萃取罐，将其倒入萃取罐，按照水∶物料∶正己烷＝1∶1∶6的比例进行萃取，搅拌30min左右，停止搅拌，静置分层。取上层溶液通过减压蒸发器将正己烷蒸出，回收溶剂，获得DHA粗油。DHA毛油加入磷酸脱胶，NaOH碱炼脱酸，中和油脂中游离的脂肪酸，采用活性炭和白土脱色除去油脂中的色素及其他杂质，采用过饱和蒸汽除去油脂中的臭味，获得较高品质的DHA精油。
测定发酵液生物量(即菌体干重)、提取的总脂肪酸量、DHA含量(即DHA量/总脂肪酸量)，具体实验数据如下：
| 5L罐数据 | 生物量 | 总脂肪酸量 | DHA含量 |
| 226kg | 129kg | 52.35％ |
实施例4 5吨发酵罐收获藻体的脂肪酸提取及精制
按照上述培养方法进行培养，通过一级、二级种子罐，进入5吨罐发酵，收获藻体。将发酵液倒入溶剂罐中，添加50kg CaCl2，使细胞絮凝沉淀，静置后，将上层溶液放出；向罐中加入15L酒精，使更多的菌体沉降，同样放出上层液体；用离心机将上述获得的菌体离心，实现进一步的固液分离。用NaOH配制pH为13的水溶液，将上步得到的菌体倒入进行碱破壁，然后将细胞送入胶体磨中，将物料磨成小颗粒状，送入均质机中高压破碎，获得粉末状细胞。再次离心(转速8000rpm)除水，将破碎菌体倒入萃取罐，将其倒入萃取罐，按照水∶物料∶环己烷＝1∶1∶5的比例进行萃取，搅拌30min左右，停止搅拌，静置分层。取上层溶液通过减压蒸发器将环己烷蒸出，回收溶剂，获得DHA粗油。加入磷酸脱胶，NaOH碱炼脱酸，中和油脂中游离的脂肪酸，采用活性炭和白土脱色除去油脂中的色素及其他杂质，采用过饱和蒸汽除去油脂中的臭味，获得DHA精油。DHA精油的GC-MS分析结果见图2、3，图2以峰面积计算见表1。
表1
注：图2中保留时间9.74和9.82处的峰均为DHA。
测定发酵液生物量(即菌体干重)、提取的总脂肪酸量、DHA含量(即DHA量/总脂肪酸量)，具体实验数据如下：
| 5吨罐数据 | 生物量 | 总脂肪酸量 | DHA含量 |
| 232kg | 128kg | 54.62％ |
Claims (7)
1.一种从隐甲藻Crypthecodinium cohnii中提取并精制富含DHA脂肪酸的方法，其特征在于先将隐甲藻发酵液絮凝处理，絮凝剂的用量为隐甲藻发酵液质量的1-2％，然后采用静置、添加酒精、再离心的方法进行固液分离；通过碱破壁后再将细胞机械破碎，破壁碱液采用NaOH或KOH配制，pH为12～14；然后对破碎的菌体采用有机溶剂萃取，萃取时按质量比为水∶破碎的菌体∶有机溶剂＝1∶1∶3～1∶1∶7的比例进行萃取，获得DHA粗油；DHA粗油经过脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到DHA精油。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于絮凝处理采用的絮凝剂为明矾、硫酸铝、无水CaCl2、三氯化铁、聚合氯化铝、聚合硫酸铁或聚丙烯酰胺。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于机械破碎采用胶体磨和高压均质机破碎细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于萃取时搅拌20～40min，静置分层，最下层为水，中层为料渣，上层为有机溶剂和DHA粗油，取上层溶液通过减压蒸发器将有机溶剂蒸出，获得DHA粗油。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于萃取所用的有机溶剂为环己烷、正己烷、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、六号溶剂、四号溶剂。
6.根据权利要求1中的方法，其特征在于粗油精制时脱胶采用磷酸，碱炼采用NaOH，脱色采用活性炭和白土，脱臭采用过饱和蒸汽。
7.根据权利要求1中的方法，其特征在于隐甲藻发酵液是通过下列方法获得的：
先将隐甲藻活化三代后进行种子培养，获得活力较高的藻种，在含有碳源、氮源、无机盐离子、微量元素的培养基中发酵，收获藻体。
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Application publication date: 20080430 Assignee: JIANGSU TIANKAI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: Nanjing Tech University Contract record no.: 2012320000908 Denomination of invention: Technique for extracting and refining DHA enriched fatty acid from Crypthecodinium cohnii Granted publication date: 20100407 License type: Exclusive License Record date: 20120724 |
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| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract |
Assignee: JIANGSU TIANKAI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: Nanjing Tech University Contract record no.: 2012320000908 Date of cancellation: 20141030 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model |