CN105670771A - 一种藻油dha提取制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种藻油DHA提取制备方法，其包含如下步骤：(1)将寇氏隐甲藻进行培养和发酵；(2)干燥；(3)破壁预处理；(4)微藻DHA提取；(5)尿素包合富集纯化；将步骤(4)得到的微藻油脂通过尿素包合法富集纯化DHA；得到微藻DHA藻油；(6)脱色除臭；将尿素包合富集纯化所得的微藻DHA藻油加入占油体质量3％的活性白土进行脱色，脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时抽真空并适度搅拌，过滤除去白土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度为85℃，真空度为0.30Kpa，脱臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢冷却，离心得藻油DHA成品。

Description

一种藻油DHA提取制备方法
技术领域
本发明涉及藻油DHA的提取方法，具体用于从微藻中提取DHA油脂。
背景技术
DHA在中枢神经系统、心血管系统和视觉神经系统等方面重要的生理功能，已得到广泛的社会认可，世界多国已规定DHA可作为营养强化剂和食品添加剂使用。目前，DHA已经被用于婴幼儿食品、乳品、饮料、豆奶及食用油脂等方面，市场需求很大，因此，DHA的生产蕴藏着巨大商机。
DHA的来源主要是鱼油和藻油。鱼油有较大的鱼腥味和高含量EPA，在食品添加上有一定的困难，食用人群也受到限制，并且鱼油资源有限。而大规模、高密度培养的微藻异养发酵，可以解决上述问题。寇氏隐甲藻是生产DHA的高产菌株，且脂肪酸组成简单，EPA较少，没有鱼腥味，具有非常广阔的应用前景。目前，世界很多国家已有藻油商业生产的成功先例，但在我国，对隐甲藻的研究还多停留在高产DHA藻株的筛选及发酵条件的优化上，大规模的工业化生产较少且多为外资企业。因此，利用寇氏隐甲藻高密度发酵生产DHA的研究，具有很大的经济效益和社会效应。
目前，现有微藻提取DHA的制备工艺较为落后，生产效率低，良品率低，不能够高效的实现大规模的工厂化生产制备。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，公开了一种藻油DHA提取制备方法，其通过发酵工艺、分离工艺及纯化工艺，从微藻中提取DHA油脂并富集纯化DHA，有利于工厂化高效生产的实现；本发明可以进一步将DHA藻油制成DHA藻油软胶囊，通过保健品的形式有助于人体健康水平的提高。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种藻油DHA提取制备方法，包含如下步骤：
(1)将寇氏隐甲藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养发酵，得到微藻原料；
(2)干燥；将步骤(1)得到的微藻原料进行干燥处理，得到微藻粉末；
(3)破壁预处理；将步骤(2)得到的微藻粉末采用超声处理法进行微藻破壁预处理，得到微藻干粉；
(4)微藻DHA提取；将步骤(3)得到的微藻干粉采用索氏提取法和/或超临界二氧化碳萃取法进行微藻DHA提取，得到微藻油脂；
(5)尿素包合富集纯化；将步骤(4)得到的微藻油脂通过尿素包合法富集纯化DHA；得到微藻DHA藻油；
(6)脱色除臭；将尿素包合富集纯化所得的微藻DHA藻油加入占油体质量3％的活性白土进行脱色，脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时抽真空并适度搅拌，过滤除去白土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度为85℃，真空度为0.30Kpa，脱臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢冷却，离心得藻油DHA成品。
本发明的优选实施方式和进一步的改进点如下：
一、
所述步骤(1)包含准备培养基以及异氧发酵的过程；
所述准备培养基包含,
(S11)固体培养基：
培养基组成：葡萄糖50g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；琼脂2％；
(S12)一级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖20g，味精10g，酵母膏2g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
(S13)二级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖40g，味精20g，酵母膏4g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
(S14)发酵培养基：
培养基组成：葡萄糖50g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
(S15)菌种保藏培养基：
所述固体培养基或发酵培养基中添加有青霉素，添加量为50～100mg/L，并低温保藏。
进一步的是：所述菌种保藏培养基为用于保藏寇氏隐甲藻的固体培养基。
进一步的是：所述异养发酵包含如下步骤，
(S21)一级种子培养：
从固体培养基的平板上取一定量纯的寇氏隐甲藻，接种到一级种子培养基，置于摇床上，28℃、120rpm条件下培养48小时，得到一级种子；
(S22)二级种子培养：
将一级种子按20％的接种量转接到二级种子培养基，28℃、150rpm条件下培养48小时，得到二级液体种子；
(S23)发酵培养：
取5L标准发酵罐，自动调控温度、pH、溶氧、搅拌速度、通风量和流加速度；发酵条件为：将二级液体种子按4％接种量接种于发酵培养基中，在25℃和4L/min的通气量下培养；每12h取样，测定葡萄糖浓度、生物量；每24h测定脂肪酸和DHA含量；通过流加2mol/LHCl或2mol/LNaOH自动控制发酵液pH。
二、
所述步骤(3)的具体执行过程如下：
(S31)将一定量微藻粉末置于烧杯中，加入少量提取溶剂，放入超声水浴中，在一定超声功率下进行超声预处理一定时间；
(S32)超声预处理之后，把烧杯中的微藻抽滤；
(S33)微藻粉末装入滤纸筒，滤液倒入圆底烧瓶，作为索氏抽提的提取溶剂，安装索氏提取器。
三、
所述索氏提取法中，采用的提取溶剂为单一提取溶剂或混合提取溶剂，所述单一提取溶剂为石油醚、环己烷、95％乙醇和无水甲醇中的一种；所述混合提取溶剂及含量比为正己烷/95％乙醇(1:1，v/v)或甲醇/氯仿/水体系(1:2:0.8，v/v)；索氏提取时间为12h，索氏提取器每缸吸一次时间约为15min；
所述超临界二氧化碳萃取法的夹带剂为95％乙醇。
四、
所述步骤(5)的尿素包合法富集纯化DHA包含如下步骤：
(S41)游离脂肪酸的制备；
(S42)取5g尿素于50ml乙醇中，60℃水浴加热搅拌至溶解；
(S43)称取5g上述步骤(S41)中的游离脂肪酸于烧杯中，将尿素乙醇溶液迅速加入含有游离脂肪酸的烧杯中，用玻璃棒搅拌直到室温，置入冰箱，在一定温度条件下开始包合反应；
(S44)一定时间后取出包合物，迅速抽滤，保留富集了不饱和脂肪酸的滤液；
(S45)将滤液蒸干，加入20ml水，滴加浓盐酸至pH为中性；加入20ml石油醚，静置分层，取醚层，用去离子水洗涂3次；
(S46)洗涤后的石油醚萃取物中加入无水硫酸钠，干燥5h，过滤、旋蒸得到包合后的多不饱和脂肪酸。
进一步的是：所述步骤(S41)的游离脂肪酸的制备包含如下步骤：
(S51)配制0.5mol/L的KOH-CH3OH溶液；
(S52)称取25g原料微藻油于烧瓶中，加入250ml0.5mol/L的KOH-CH30H洛液，55℃下水浴加热回流1h，直至油滴完全消失；
(S53)加入20ml蒸馏水及100ml石油醚以萃取出不皂化物，静置分层，弃去上层不皂化物；
(S54)取下层溶液，滴加浓盐酸至pH至1左右，分两次加入150ml石油醚，静置取醚层；
(S55)将醚层旋蒸至无溶剂蒸出，得到游离脂肪酸，倒入磨口玻璃瓶中冷冻保存。
本发明有益效果是：
本发明公开的一种藻油DHA提取制备方法，选用寇氏隐甲藻为藻种，对培养基、培养条件进行优化，从而大大提高微藻的生长速度和生物量；利用索氏提取法与超声强化超临界CO2萃取微藻中DHA，结合尿素包合法分离、富集DHA，使微藻中的DHA提取率大大增加并有效分离。
附图说明
图1为本发明的一种具体实施方式的流程图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
本发明公开的一种藻油DHA提取制备方法，包含如下步骤：
(1)将寇氏隐甲藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养发酵，得到微藻原料；
(2)干燥；将步骤(1)得到的微藻原料进行干燥处理，得到微藻粉末；
(3)破壁预处理；将步骤(2)得到的微藻粉末采用超声处理法进行微藻破壁预处理，得到微藻干粉；
(4)微藻DHA提取；将步骤(3)得到的微藻干粉采用索氏提取法和/或超临界二氧化碳萃取法进行微藻DHA提取，得到微藻油脂；
(5)尿素包合富集纯化；将步骤(4)得到的微藻油脂通过尿素包合法富集纯化DHA；得到微藻DHA藻油；
(6)脱色除臭；将尿素包合富集纯化所得的微藻DHA藻油加入占油体质量3％的活性白土进行脱色，脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时抽真空并适度搅拌，过滤除去白土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度为85℃，真空度为0.30Kpa，脱臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢冷却，离心得藻油DHA成品。
上述具体实施方式采用的具体原理如下：
整体技术原理：
本项目主要采用微藻异养发酵技术、微藻DHA提取技术以及DHA富集纯化技术，生产出较高含量和较高纯度的藻油DHA，并将藻油DHA制成具有改善记忆力功能的藻油DHA软胶囊健康食品。
本发明的微藻异养发酵技术原理如下：
微藻异养发酵是指在发酵设备中让微藻利用添加在培养基中的有机碳源和(或)有机氮源而不依赖于光照进行生长增殖的过程，以达到较高的细胞密度和较大的生物量。
本发明的索氏提取技术原理如下：
先使用某种或几种溶剂混合而成的溶剂对微藻原料进行提取，然后通过加入另一种溶剂或改变混合溶剂中各溶剂的含量使系统变成两相，并使目标产物进入其中的某一相，分离两相从而达到初步纯化的目的。
本发明的超临界CO2萃取技术原理如下：
超临界CO2萃取技术是分离富集多不饱和脂肪酸的一种新方法，它是利用各组分因碳数不同而在CO2中溶解度不同而进行分离的，当温度和压力变化时，CO2的溶解能力会随之发生变化。选择使多不饱和脂肪酸具有高溶解度的温度和压力进行萃取，然后改变温度和压力，形成较低压力的环境，改变CO2的溶解能力，从而使不同的多不饱和脂肪酸组分得以分开。
本发明的DHA富集纯化技术原理(尿素包合法)如下：
当尿素溶解于有机溶剂中，遇脂肪族化合物，尿素分子之间以氢键结合形成六面体结构。尿素六面体框架的自由空间最宽的地方约为O.6nm，最窄的地方约O.5nm，饱和脂肪酸直径接近O.45nm，小于尿素框架的自由空间，在结晶过程中直链饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸就能够进入管道内，被尿素包合于其六面体结晶框架中，形成尿素包合物析出。
多不饱和脂肪酸由于双键较多，碳链弯曲，具有一定的顺反空间结构，从而使分子体积增大，不易被尿素包合。因此，饱和脂肪酸较不饱和脂肪酸更容易与尿素形成稳定的包合物，单一双键较含两个或更多双键的脂肪酸更容易形成稳定包合物，利用这一性质通过过滤除去尿素包合结晶，可以使多不饱和脂肪酸得到富集，得到较高纯度的多价不饱和脂肪酸。
在一些优选实施例中，所述步骤(1)包含准备培养基以及异氧发酵的过程；
所述准备培养基包含,
(S11)固体培养基：
培养基组成：葡萄糖50g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；琼脂2％；
(S12)一级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖20g，味精10g，酵母膏2g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
(S13)二级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖40g，味精20g，酵母膏4g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
(S14)发酵培养基：
培养基组成：葡萄糖50g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
(S15)菌种保藏培养基：
所述固体培养基或发酵培养基中添加有青霉素，添加量为50～100mg/L，并低温保藏。在一些具体实施例中，我固体培养基和发酵培养基中的一个分别加入了50mg/L、80mg/L和100mg/L的青霉素，均获得了能够较长期限保藏的效果；
在一些优选实施例中，所述菌种保藏培养基为用于保藏寇氏隐甲藻的固体培养基。所述固体培养基的平板上保藏有寇氏隐甲藻。
在一些优选实施例中，所述异养发酵包含如下步骤，
(S21)一级种子培养：
从固体培养基的平板上取一定量纯的寇氏隐甲藻，接种到一级种子培养基，置于摇床上，28℃、120rpm条件下培养48小时，得到一级种子；
(S22)二级种子培养：
将一级种子按20％的接种量转接到二级种子培养基，28℃、150rpm条件下培养48小时，得到二级液体种子；
(S23)发酵培养：
取5L标准发酵罐，自动调控温度、pH、溶氧、搅拌速度、通风量和流加速度；发酵条件为：将二级液体种子按4％接种量接种于发酵培养基中，在25℃和4L/min的通气量下培养；每12h取样，测定葡萄糖浓度、生物量；每24h测定脂肪酸和DHA含量；通过流加2mol/LHCl或2mol/LNaOH自动控制发酵液pH。
我们在一些具体实施例中，还进行了培养基优化的工作；具体的，我们运用Design-Expert软件，对发酵培养基的葡萄糖、味精和酵母膏进行优化，其他无机盐和微量元素保持不变。运用Box-BehnkenDesign(BBD)实验设计方法，考察的因素和因素的低值、高值分别为葡萄糖(g/L):20，100；味精(g/L)：10，50；酵母膏(g/L)：2，10。选择的因变量为生物量、油脂产量和DHA产量。
在一些实施例中，我们针对性的进行了发酵条件的具体实施例，其中对温度和pH值进行不同的数值控制，获取更优选的技术方案效果；具体实施例如下：
(1)关于温度的实施例：
微藻生长和油脂积累的最适温度因种而异，将二级种子接入到发酵培养基之后，分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的温度条件下发酵，来研究不同温度对隐甲藻生物量及油脂含量的影响。
(2)关于pH值的实施例：
培养基的初始pH值是影响微藻生长速度的重要因子之一。有许多研究者发现，多种藻类在pH5-7左右生长速度最快，在极端酸性或碱性条件下较难生长。用HCl或NaOH溶液调整发酵培养基初始pH值分别为4.5、5.5、6.5、7.0、7.5，来研究不同初始pH值对隐甲藻生物量及油脂含量的影响。
在一些优选实施例中，所述步骤(3)的具体执行过程如下：
(S31)将一定量微藻粉末置于烧杯中，加入少量提取溶剂，放入超声水浴中，在一定超声功率下进行超声预处理一定时间；
(S32)超声预处理之后，把烧杯中的微藻抽滤；
(S33)微藻粉末装入滤纸筒，滤液倒入圆底烧瓶，作为索氏抽提的提取溶剂，安装索氏提取器。
在一些优选实施例中，所述索氏提取法中，采用的提取溶剂为单一提取溶剂或混合提取溶剂，所述单一提取溶剂为石油醚、环己烷、95％乙醇和无水甲醇中的一种；所述混合提取溶剂及含量比为正己烷/95％乙醇(1:1，v/v)或甲醇/氯仿/水体系(1:2:0.8，v/v)；索氏提取时间为12h，索氏提取器每缸吸一次时间约为15min；单一溶剂提取实验中，非极性的石油醚和环己烷作为提取溶剂时油脂提取率较低，极性溶剂提取得到的油脂提取率较高，但油脂中DHA含量相差不是很大，说明微藻油脂中极性脂类含量较大，并且各提取溶剂对DHA的选择性相差不大。混合溶剂体系中，经典Bligh-Dyer法得到的油脂提取率、油脂中DHA含量及DHA提取率明显提高.
上述的索氏提取法实施中，具体执行步骤可以采用下述实施例：
索氏提取法具体实施例：
(1)称取约5g微藻干粉，装入用大滤纸卷成的滤纸筒，待用。
(2)设定好提取温度。
(3)将装有原料的滤纸简放入抽提器中，加提取溶剂至完全浸没滤纸筒，安装索式提取装置，通冷凝水，实验开始。
(4)当有第一滴回流液滴下时，开始记时。
(5)提取完毕后，停止加热，关闭冷凝水，取下提取瓶。
(6)将提取液在60℃下真空旋转蒸发掉溶剂，真空干燥4h，得微藻粗油。
本发明的所述超临界二氧化碳萃取法的夹带剂为95％乙醇。
上述的超临界二氧化碳萃取法实施中，具体执行步骤可以采用下述实施例：
超临界二氧化碳萃取法具体实施例：
(1)精确称取5g左右的微藻干粉，按比例加入一定量的95％乙醇作为夹带剂，在烧杯中充分混合均匀。
(2)装填萃取柱
a.将柱体下端的螺栓拧紧，上端的螺栓拧下来，用一根填塞棒向柱体塞入脱脂棉，再在脱脂棉上装入少许粒径为3-4mm的玻璃珠。
b.将混合好的物料用小勺装入萃取柱中。
c.柱上端装入脱脂棉和玻璃珠，拧紧萃取柱上端螺栓。
(3)起临界CO2萃取设备的使用
a.开启SFE电源，打开CO2钢瓶阀并连通SFE主泵，开启冷却槽电源，保证冷却温度在0℃左右，冷却时间约30min。
b.将装填好原料的萃取柱放入恒温箱支架上，并接好管路。
c.开启恒温箱并设定好微调节阀、SFE箱体、萃取柱温度。
d.将微调节阀-萃出物接收瓶-流量计-CO2排出口连接好。
e.开启压缩机与SFE设备连通，旋转SFE主泵调压阀升压至10MPa左右，打开进口阀使CO2气体进入萃取柱，检查萃取柱计整个管路有无漏气并设法排漏。
g.待压力与温度稳定在期望值适当时间，打开出口阀，小心调节出口压力调节阀至期望的CO2流速，萃取过程开始。
h.实验结束后，切断恒温箱电源，关闭进口阀、出口阀，最后打开放空阀排除萃取柱内C02。关闭空压机总阀及电源，关闭CO2钢瓶总阀。待恒温箱及萃取柱冷却后取下萃取柱，用乙醇清洗管路。
在一些优选实施例中，所述步骤(5)的尿素包合法富集纯化DHA包含如下步骤：
(S41)游离脂肪酸的制备；
(S42)取5g尿素于50ml乙醇中，60℃水浴加热搅拌至溶解；
(S43)称取5g上述步骤(S41)中的游离脂肪酸于烧杯中，将尿素乙醇溶液迅速加入含有游离脂肪酸的烧杯中，用玻璃棒搅拌直到室温，置入冰箱，在一定温度条件下开始包合反应；
(S44)一定时间后取出包合物，迅速抽滤，保留富集了不饱和脂肪酸的滤液；
(S45)将滤液蒸干，加入20ml水，滴加浓盐酸至pH为中性；加入20ml石油醚，静置分层，取醚层，用去离子水洗涂3次；
(S46)洗涤后的石油醚萃取物中加入无水硫酸钠，干燥5h，过滤、旋蒸得到包合后的多不饱和脂肪酸。
针对尿素包合法富集纯化DHA，我们还进行了如下实施例，以此获取不同的因素对于尿素包合法富集纯化DHA效果的影响：
关于尿素/脂肪酸比例的实施例：
本研究以乙醇为包合溶剂，在包合温度为-10℃，包合时间为2h条件下，考察尿素/脂肪酸比例对富集产品中DHA含量及DHA富集率的影响。选择考察的尿素/脂肪酸质量比例分别为0.5:1，1:1,2:1,4:1和8:10。
关于包合时间的实施例：
本研究以乙醇为包合溶剂，在包合温度为-10℃，在确定尿素/脂肪酸比例的条件下，考察包合时间对富集产品中DHA含量及DHA富集率的影响。选择考察的包合时间分别为2h、5h、8h和20h。
关于包合温度的实施例：
本研究以乙醇为包合溶剂，在确定尿素/脂肪酸比例以及包合时间的条件下，考察包合温度对富集产品中DHA含量及DHA富集率的影响。选择考察的包合温度分别为-20℃、-10℃、O℃、10℃及25℃。
在一些优选实施例中，所述步骤(S41)的游离脂肪酸的制备包含如下步骤：
(S51)配制0.5mol/L的KOH-CH3OH溶液；
(S52)称取25g原料微藻油于烧瓶中，加入250ml0.5mol/L的KOH-CH30H洛液，55℃下水浴加热回流1h，直至油滴完全消失；
(S53)加入20ml蒸馏水及100ml石油醚以萃取出不皂化物，静置分层，弃去上层不皂化物；
(S54)取下层溶液，滴加浓盐酸至pH至1左右，分两次加入150ml石油醚，静置取醚层；
(S55)将醚层旋蒸至无溶剂蒸出，得到游离脂肪酸，倒入磨口玻璃瓶中冷冻保存。
上面结合附图对本发明优选实施方式作了详细说明，但是本发明不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，这些变化涉及本领域技术人员所熟知的相关技术，这些都落入本发明专利的保护范围。
不脱离本发明的构思和范围可以做出许多其他改变和改型。应当理解，本发明不限于特定的实施方式，本发明的范围由所附权利要求限定。

Claims (8)

1.一种藻油DHA提取制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)将寇氏隐甲藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养发酵，得到微藻原料；
(2)干燥；将步骤(1)得到的微藻原料进行干燥处理，得到微藻粉末；
(3)破壁预处理；将步骤(2)得到的微藻粉末采用超声处理法进行微藻破壁预处理，得到微藻干粉；
(4)微藻DHA提取；将步骤(3)得到的微藻干粉采用索氏提取法和/或超临界二氧化碳萃取法进行微藻DHA提取，得到微藻油脂；
(5)尿素包合富集纯化；将步骤(4)得到的微藻油脂通过尿素包合法富集纯化DHA；得到微藻DHA藻油；
(6)脱色除臭；将尿素包合富集纯化所得的微藻DHA藻油加入占油体质量3％的活性白土进行脱色，脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时抽真空并适度搅拌，过滤除去白土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度为85℃，真空度为0.30Kpa，脱臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢冷却，离心得藻油DHA成品。
2.如权利要求1所述的一种藻油DHA提取制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包含准备培养基以及异氧发酵的过程；
所述准备培养基包含,
(S11)固体培养基：
培养基组成：葡萄糖50g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；琼脂2％；
(S12)一级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖20g，味精10g，酵母膏2g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
(S13)二级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖40g，味精20g，酵母膏4g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
(S14)发酵培养基：
培养基组成：葡萄糖50g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁6g，无水氯化钙0.5g，碳酸氢钠0.2g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
(S15)菌种保藏培养基：
所述固体培养基或发酵培养基中添加有青霉素，添加量为50～100mg/L，并低温保藏。
3.如权利要求2所述的一种藻油DHA提取制备方法，其特征在于：所述菌种保藏培养基为用于保藏寇氏隐甲藻的固体培养基。
4.如权利要求2所述的一种藻油DHA提取制备方法，其特征在于：所述异养发酵包含如下步骤，
(S21)一级种子培养：
从固体培养基的平板上取一定量纯的寇氏隐甲藻，接种到一级种子培养基，置于摇床上，28℃、120rpm条件下培养48小时，得到一级种子；
(S22)二级种子培养：
将一级种子按20％的接种量转接到二级种子培养基，28℃、150rpm条件下培养48小时，得到二级液体种子；
(S23)发酵培养：
取5L标准发酵罐，自动调控温度、pH、溶氧、搅拌速度、通风量和流加速度；发酵条件为：将二级液体种子按4％接种量接种于发酵培养基中，在25℃和4L/min的通气量下培养；每12h取样，测定葡萄糖浓度、生物量；每24h测定脂肪酸和DHA含量；通过流加2mol/LHCl或2mol/LNaOH自动控制发酵液pH。
5.如权利要求1所述的一种藻油DHA提取制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体执行过程如下：
(S31)将一定量微藻粉末置于烧杯中，加入少量提取溶剂，放入超声水浴中，在一定超声功率下进行超声预处理一定时间；
(S32)超声预处理之后，把烧杯中的微藻抽滤；
(S33)微藻粉末装入滤纸筒，滤液倒入圆底烧瓶，作为索氏抽提的提取溶剂，安装索氏提取器。
6.如权利要求1所述的一种藻油DHA提取制备方法，其特征在于：所述索氏提取法中，采用的提取溶剂为单一提取溶剂或混合提取溶剂，所述单一提取溶剂为石油醚、环己烷、95％乙醇和无水甲醇中的一种；所述混合提取溶剂及含量比为正己烷/95％乙醇(1:1，v/v)或甲醇/氯仿/水体系(1:2:0.8，v/v)；索氏提取时间为12h，索氏提取器每缸吸一次时间约为15min；
所述超临界二氧化碳萃取法的夹带剂为95％乙醇。
7.如权利要求1所述的一种藻油DHA提取制备方法，其特征在于：所述步骤(5)的尿素包合法富集纯化DHA包含如下步骤：
(S41)游离脂肪酸的制备；
(S42)取5g尿素于50ml乙醇中，60℃水浴加热搅拌至溶解；
(S43)称取5g上述步骤(S41)中的游离脂肪酸于烧杯中，将尿素乙醇溶液迅速加入含有游离脂肪酸的烧杯中，用玻璃棒搅拌直到室温，置入冰箱，在一定温度条件下开始包合反应；
(S44)一定时间后取出包合物，迅速抽滤，保留富集了不饱和脂肪酸的滤液；
(S45)将滤液蒸干，加入20ml水，滴加浓盐酸至pH为中性；加入20ml石油醚，静置分层，取醚层，用去离子水洗涂3次；
(S46)洗涤后的石油醚萃取物中加入无水硫酸钠，干燥5h，过滤、旋蒸得到包合后的多不饱和脂肪酸。
8.如权利要求7所述的一种藻油DHA提取制备方法，其特征在于：所述步骤(S41)的游离脂肪酸的制备包含如下步骤：
(S51)配制0.5mol/L的KOH-CH3OH溶液；
(S52)称取25g原料微藻油于烧瓶中，加入250ml0.5mol/L的KOH-CH30H洛液，55℃下水浴加热回流1h，直至油滴完全消失；
(S53)加入20ml蒸馏水及100ml石油醚以萃取出不皂化物，静置分层，弃去上层不皂化物；
(S54)取下层溶液，滴加浓盐酸至pH至1左右，分两次加入150ml石油醚，静置取醚层；
(S55)将醚层旋蒸至无溶剂蒸出，得到游离脂肪酸，倒入磨口玻璃瓶中冷冻保存。
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