CN108486177A - 一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用藻油制备富含ω‑3脂肪酸磷脂的方法，所述方法包括：1)获取藻油；2)分离藻油磷脂：将上述获得的藻油，加入食品级丙酮，充分混匀，45～60min后，4000～5000rpm/min离心15～20min，所得沉淀物为藻油磷脂粗品；重复此步骤；3)磷脂酰胆碱的纯化：利用硅胶色谱柱用乙醇洗脱色谱柱分离去除含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸；然后再用乙醇洗脱色谱柱分离获得磷脂酰胆碱；4)富含ω‑3脂肪酸磷脂的合成：将提取的藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱与乙醇混合，再加入脂肪酶和适量的水，利用脂肪酶醇解反应制备得到富含ω‑3脂肪酸磷脂。采用本发明方法，以藻油磷脂粗品为合成原料时，以磷脂酰胆碱为合成原料时，酶催化反应后ω‑3脂肪酸的总含量可达70％以上。
Description
技术领域
本发明涉及保健食品技术领域，尤其涉及一种利用藻油制备富含ω-3脂肪 酸磷脂的方法。
背景技术
磷脂(phospholipid,PL)是一类具有疏水基团和亲水基团的非极性物质， 主要是由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、 磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PS)、溶血磷脂(由PE、PC、PS、PI和PS脱 去一个脂肪酸)等组成的混合物。根据磷脂的性质与功能，磷脂可作为乳化 剂、分散剂、抗氧化剂、润滑剂、营养剂等而广泛应用于食品、医药、化妆 品等领域。当前世界每年生产乳化剂的产量达25万吨以上，其中磷脂占总量 的20％左右。我国市售磷脂乳化剂主要来自大豆磷脂，存在产品种类单一、 缺乏必需脂肪酸、应用产品窄等缺点，直接或间接影响了食品、医药、饲料 等领域的发展。众所周知，ω-3脂肪酸(如亚麻酸(ALA,18:3n-3)、十八碳 四烯酸(SDA,18:4n-3)、二十碳五烯酸(EPA,20:5n-3)和二十二碳六烯酸 (DHA,22:6n-3)是人体的必需脂肪酸，它们具有促进婴幼儿生长发育、增强 人体免疫力、抗肿瘤、预防中风和痛风等方面的生物学功能。因此，开发富 含ω-3脂肪酸的磷脂作为乳化剂或添加剂应用到食品、医药等领域是当前研 发改性油脂领域的热门方向之一。
当前，生产富含ω-3脂肪酸磷脂的主要技术是化学催化法和酶催化法。ShijiHama等(ShijiHamaetal,2015)指出化学催化法用于生产ω-3脂肪酸磷脂， 具有反应慢和消耗昂贵的催化剂，而且高温下易导致油的氧化，进而产生副 产物、色变等现象。酶催化制备富含ω-3脂肪酸的功能性磷脂，可以克服化 学催化法的缺点，具有高效、专一、反应条件温和、副产物少、重复利用酶 等优点，将是当前研发和今后应用于工业化生产的首选技术。欧美、日本、 韩国等发达国家在油脂改性及其工业化应用的研究一直处于领先地位(HaraldssonandThorarensen,1998；Garciaetal,2008；Marsaourietal,2013；Zhaoetal,2014)。但这些发达国家的研究者主要利用大豆磷脂或磷脂酰胆碱和过量的高 纯度(高于78％)ω-3脂肪酸或纯的ω-3脂肪酸乙酯为原料，通过酶的酸解 反应或转酯化反应将ω-3脂肪酸替换磷脂上的脂肪酸；优化后，ω-3脂肪酸 含量可达12.3％-57.4％。在中试或规模化水平上，该方法是不可行的，主要原 因是原料中需要精制的ω-3脂肪酸成本过高。我国关于开发富含ω-3脂肪酸 的磷脂，暂处于起步阶段。如，南方科技大学的Li等(Lietal,2014)也是通 过上述方法获得ω-3脂肪酸含量为30.7％的大豆磷脂酰胆碱。因此，研究开发富含ω-3脂肪酸的功能性磷脂应用到食品、医药等领域，具有重要的意义。
富含ω-3脂肪酸的可食用油主要是鱼油和海洋微藻藻油。近年来，水产 养殖业消耗了全球83％的鱼油，人类直接食用鱼油仅占总量的6％。2015年6 月，FAOGlobefish已公布了鱼油的价格为2400$/吨，比去年鱼油价格高了300$/ 吨。高价格的鱼油直接制约了开发富含ω-3脂肪酸的功能性油脂。富含ω-3 脂肪酸的磷脂主要是虾油、海鱼鱼油和海洋微藻藻油。磷脂是组成动物组织 细胞膜的重要成分，其含量较低。此外，基于海洋食物链角度分析，海鱼富 集ω-3脂肪酸主要来自富含ω-3脂肪酸的海洋微藻。近年来，欧盟国家已利用等鞭金藻、微绿球藻、螺旋藻等藻粉作为添加剂，以提高意大利面和饼干 的营养价值。大量文献表明，微绿球藻具有生长速度快，油脂含量高，富含 ω-3脂肪酸，其中磷脂含量可达30％(Ryckeboschetal,2014；Yaoetal,2015)。 因此，富含ω-3脂肪酸的藻油是用来开发高营养价值的功能性磷脂的最佳油 源，可以克服当前油源短缺问题。
国内外对开发功能性磷脂还面临如何筛选具有专一性强、催化效率高、 绿色环保和富集高含量ω-3脂肪酸的脂肪酶。目前常用的商用脂肪酶有非选 择性的固定化脂肪酶(如，Novozyme435，CALA等)、1,3选择性的酶(如 TLIM，RMIM,等)和磷脂酶PLA1。寻找具有水解磷脂的饱和脂肪酸和单不 饱和脂肪酸的脂肪酶，是当前开发富含ω-3脂肪酶的功能性磷脂的难题。2011 年，丹麦奥胡斯大学的XuebingXu教授研究CALA脂肪酶的生物印记发现：在乙醇条件，该酶能水解油脂的8个碳链和油酸；但他们未进一步利用该酶 对其ω-3脂肪酸的选择性进行综合分析。因此，本专利以富含ω-3脂肪酸的 藻油磷脂为底物，从多种酶中筛选并研发出具有高效地富集ω-3脂肪酸的功 能性磷脂。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方 法，利用绿色环保的的脂肪酶催化法制备富含ω-3脂肪酸的磷脂。
为实现上述目的，本发明提供的一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂 的方法，所述方法包括如下步骤：
1)获取藻油；
2)分离藻油磷脂：
将上述获得的藻油，加入食品级丙酮，充分混匀，45～60min后， 4000～5000rpm/min离心15～20min，所得沉淀物为藻油磷脂粗品；重复此步骤；
3)磷脂酰胆碱的纯化：
利用硅胶色谱柱用乙醇洗脱色谱柱分离去除含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝 氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸；然后再用乙醇洗脱色谱柱分离获得磷脂酰胆碱；
4)富含ω-3脂肪酸磷脂的合成：
将上述提取的藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱与乙醇混合，再加入脂肪酶和 适量的水，利用脂肪酶醇解反应制备得到富含ω-3脂肪酸磷脂。
优选地，所述步骤4)之后还包括以下步骤：
5)富含ω-3脂肪酸磷脂的提纯：
将所述步骤4)中获取的富含ω-3脂肪酸磷脂与食品级正己烷按1:10的 体积比例混合提取3次，收集乙醇相，旋转蒸发去除乙醇和水后获得提纯后 的富含ω-3脂肪酸磷脂。
优选地，所述步骤1)之后还包括：
1a)脱色除臭；将所得的藻油加入占油体质量5％的活性白土进行脱色， 脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时抽真空并适度搅拌，过滤除去白 土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度为85℃，真空度为0.30Kpa，脱 臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢冷却，离心得藻油成品。
优选地，所述获取藻油的步骤包括：
1b)微藻干粉制备；
1c)藻油提取；
取微藻藻粉，以质量分数为60-100％乙醇作为萃取剂，利用加速溶剂萃 取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩 余物即为藻油。
优选地，所述的萃取温度为55～120℃，萃取时间25～85min，萃取次数 为2～5次；萃取结束后将萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发 后所得剩余物即为藻油。
优选地，所述的微藻包括裂殖壶藻、等鞭金藻、寇式隐甲藻、微绿球藻、 绿色巴夫藻、布朗葡萄藻、三角褐指藻、菱形藻、小球藻、栅藻或者杜氏藻。
优选地，所述微藻干粉制备的方法的步骤包括：
1d)选定微藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养发酵， 得到微藻原料；
1e)干燥；将步骤(1)得到的微藻原料进行干燥处理，得到微藻粉末；
1f)破壁预处理；将步骤(2)得到的微藻粉末采用超声处理法进行微藻破 壁预处理，得到微藻干粉。
优选地，所述富含ω-3脂肪酸磷脂的合成中，反应条件为：藻油磷脂粗 品或磷脂酰胆碱和乙醇的质量比1：1～4，脂肪酶的加入量占藻油磷脂粗品或 磷脂酰胆碱质量的5～18％，加水量占藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱质量的0～ 15％，反应温度25～55℃，反应时间为12h～60h，搅拌速度300～600r/min。
优选地，所述步骤2)中藻油与丙酮的体积比藻油：丙酮为1：10。
优选地，所述步骤1d)的方法具体为：
所述准备培养基包含,
步骤1d1)固体培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液 2ml，纯净水1000ml；琼脂2％；
步骤1d2)一级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖40g，味精35g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢 钾5g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.5g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤1d3)二级种子培养基：
培养基组成：培养基组成：葡萄糖50g，味精40g，酵母膏6g，氯化钠 10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.3g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤1d4)发酵培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾4g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤1d5)菌种保藏培养基：
所述固体培养基或发酵培养基中添加有青霉素，添加量为50～100mg/L， 并低温保藏。
本发明利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法包括1)获取藻油；2) 分离藻油磷脂：将上述获得的藻油，加入食品级丙酮，充分混匀，45～60min 后，4000～5000rpm/min离心15～20min，所得沉淀物为藻油磷脂粗品；此步骤 重复三次；3)磷脂酰胆碱的纯化：利用硅胶色谱柱用乙醇洗脱色谱柱分离去 除含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸；然后再用乙醇洗 脱色谱柱分离获得磷脂酰胆碱；4)富含ω-3脂肪酸磷脂的合成：将上述提取 的藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱与乙醇混合，再加入脂肪酶和适量的水，利用脂肪酶醇解反应制备得到富含ω-3脂肪酸磷脂。
采用本发明专利所述的工艺条件，以藻油磷脂粗品为合成原料时，以磷 脂酰胆碱为合成原料时，酶催化反应后ω-3脂肪酸的总含量可达70％以上。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限 定本发明。
实施例1：
1d)选定裂殖壶藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养 发酵，得到微藻原料；
1e)干燥；将步骤(1)得到的微藻原料进行干燥处理，得到裂殖壶藻粉末；
1f)破壁预处理；将步骤(2)得到的裂殖壶藻粉末采用超声处理法进行微 藻破壁预处理，得到裂殖壶藻干粉。
1c)藻油提取；
取10g裂殖壶藻藻粉，以质量分数为60-100％乙醇作为萃取剂，利用加 速溶剂萃取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发 后所得剩余物即为藻油。
1a)脱色除臭；将所得的藻油加入占油体质量5％的活性白土进行脱色， 脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时抽真空并适度搅拌，过滤除去白 土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度为85℃，真空度为0.30Kpa，脱 臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢冷却，离心得藻油成品。
2)分离藻油磷脂：
将上述获得的藻油，加入食品级丙酮，充分混匀，45min后，4000rpm/min 离心15min，所得沉淀物为藻油磷脂粗品；此步骤重复三次；
3)磷脂酰胆碱的纯化：
利用硅胶色谱柱用乙醇洗脱色谱柱分离去除含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝 氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸；然后再用乙醇洗脱色谱柱分离获得磷脂酰胆碱；
4)富含ω-3脂肪酸磷脂的合成：
将上述提取的藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱与乙醇混合，再加入脂肪酶和 适量的水，利用脂肪酶醇解反应制备得到富含ω-3脂肪酸磷脂
5)富含ω-3脂肪酸磷脂的提纯：
将所述步骤4)中获取的富含ω-3脂肪酸磷脂与食品级正己烷按1:10的 体积比例混合提取3次，收集乙醇相，旋转蒸发去除乙醇和水后获得提纯后 的富含ω-3脂肪酸磷脂。
其中，本实施例中的所述步骤1d)包含准备培养基以及异氧发酵的过程；
所述准备培养基包含,
步骤1d1)固体培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液 2ml，纯净水1000ml；琼脂2％；
步骤1d2)一级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖40g，味精35g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢 钾5g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.5g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤1d3)二级种子培养基：
培养基组成：培养基组成：葡萄糖50g，味精40g，酵母膏6g，氯化钠 10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.3g，A5溶液 1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤1d4)发酵培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾4g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤1d5)菌种保藏培养基：
所述固体培养基或发酵培养基中添加有青霉素，添加量为50～100mg/L， 并低温保藏。
本实施例中的所述脂肪酶是指固定化脂肪酶A-CALA或游离脂肪酶A；
所述的固定化脂肪酶A-CALA购自美国CODEIX公司，游离脂肪酶A购 自丹麦诺维信公司。
采用本发明实施例所述的工艺条件，酶催化反应后溶血磷脂中ω-3脂肪 酸的总含量达75％以上。
实施例2：
1d)选定寇式隐甲藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异 养发酵，得到微藻原料；
1e)干燥；将步骤(1)得到的微藻原料进行干燥处理，得到寇式隐甲藻粉 末；
1f)破壁预处理；将步骤(2)得到的裂殖壶藻粉末采用超声处理法进行微 藻破壁预处理，得到寇式隐甲藻干粉。
1c)藻油提取；
取13g寇式隐甲藻藻粉，以质量分数为75％乙醇作为萃取剂，利用加速 溶剂萃取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后 所得剩余物即为藻油。
1a)脱色除臭；将所得的藻油加入占油体质量5％的活性白土进行脱色， 脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时抽真空并适度搅拌，过滤除去白 土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度为85℃，真空度为0.30Kpa，脱 臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢冷却，离心得藻油成品。
2)分离藻油磷脂：
将上述获得的藻油，加入食品级丙酮，充分混匀，50min后，4500rpm/min 离心18min，所得沉淀物为藻油磷脂粗品；此步骤重复四次；
3)磷脂酰胆碱的纯化：
利用硅胶色谱柱用乙醇洗脱色谱柱分离去除含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝 氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸；然后再用乙醇洗脱色谱柱分离获得磷脂酰胆碱；
4)富含ω-3脂肪酸磷脂的合成：
将上述提取的藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱与乙醇混合，再加入脂肪酶和 适量的水，利用脂肪酶醇解反应制备得到富含ω-3脂肪酸磷脂
5)富含ω-3脂肪酸磷脂的提纯：
将所述步骤4)中获取的富含ω-3脂肪酸磷脂与食品级正己烷按1:10的 体积比例混合提取3次，收集乙醇相，旋转蒸发去除乙醇和水后获得提纯后 的富含ω-3脂肪酸磷脂。
其中，本实施例中的所述步骤1d)包含准备培养基以及异氧发酵的过程；
所述准备培养基包含,
步骤1d1)固体培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液 2ml，纯净水1000ml；琼脂2％；
步骤1d2)一级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖40g，味精35g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢 钾5g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.5g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤1d3)二级种子培养基：
培养基组成：培养基组成：葡萄糖50g，味精40g，酵母膏6g，氯化钠 10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.3g，A5溶液 1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤1d4)发酵培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾4g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤1d5)菌种保藏培养基：
所述固体培养基或发酵培养基中添加有青霉素，添加量为50～100mg/L， 并低温保藏。
本实施例中的所述脂肪酶是指固定化脂肪酶A-CALA或游离脂肪酶A；
所述的固定化脂肪酶A-CALA购自美国CODEIX公司，游离脂肪酶A购 自丹麦诺维信公司。
采用本发明实施例所述的工艺条件，酶催化反应后溶血磷脂中ω-3脂肪 酸的总含量达60％以上。
实施例3：
1d)选定等鞭金藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养 发酵，得到微藻原料；
1e)干燥；将步骤(1)得到的微藻原料进行干燥处理，得到等鞭金藻粉末；
1f)破壁预处理；将步骤(2)得到的裂殖壶藻粉末采用超声处理法进行微 藻破壁预处理，得到等鞭金藻干粉。
1c)藻油提取；
取15g等鞭金藻藻粉，以质量分数为60-100％乙醇作为萃取剂，利用加 速溶剂萃取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发 后所得剩余物即为藻油。
1a)脱色除臭；将所得的藻油加入占油体质量5％的活性白土进行脱色， 脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时抽真空并适度搅拌，过滤除去白 土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度为85℃，真空度为0.30Kpa，脱 臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢冷却，离心得藻油成品。
2)分离藻油磷脂：
将上述获得的藻油，加入食品级丙酮，充分混匀，45min后，4000rpm/min 离心15min，所得沉淀物为藻油磷脂粗品；此步骤重复三次；
3)磷脂酰胆碱的纯化：
利用硅胶色谱柱用乙醇洗脱色谱柱分离去除含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝 氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸；然后再用乙醇洗脱色谱柱分离获得磷脂酰胆碱；
4)富含ω-3脂肪酸磷脂的合成：
将上述提取的藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱与乙醇混合，再加入脂肪酶和 适量的水，利用脂肪酶醇解反应制备得到富含ω-3脂肪酸磷脂；
5)富含ω-3脂肪酸磷脂的提纯：
将所述步骤4)中获取的富含ω-3脂肪酸磷脂与食品级正己烷按1:10的 体积比例混合提取3次，收集乙醇相，旋转蒸发去除乙醇和水后获得提纯后 的富含ω-3脂肪酸磷脂。
其中，本实施例中的所述步骤1d)包含准备培养基以及异氧发酵的过程；
所述准备培养基包含,
步骤1d1)固体培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液 2ml，纯净水1000ml；琼脂2％；
步骤1d2)一级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖40g，味精35g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢 钾5g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.5g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤1d3)二级种子培养基：
培养基组成：培养基组成：葡萄糖50g，味精40g，酵母膏6g，氯化钠 10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.3g，A5溶液 1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤1d4)发酵培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾4g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤1d5)菌种保藏培养基：
所述固体培养基或发酵培养基中添加有青霉素，添加量为50～100mg/L， 并低温保藏。
本实施例中的所述脂肪酶是指固定化脂肪酶A-CALA或游离脂肪酶A；
所述的固定化脂肪酶A-CALA购自诺维信脂肪酶435，游离脂肪酶A购 自丹麦诺维信公司。
采用本发明实施例所述的工艺条件，酶催化反应后溶血磷脂中ω-3脂肪 酸的总含量达65％以上。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是 利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用 在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)获取藻油；
2)分离藻油磷脂：
将上述获得的藻油，加入食品级丙酮，充分混匀，45～60min后，4000～5000rpm/min离心15～20min，所得沉淀物为藻油磷脂粗品；重复此步骤；
3)磷脂酰胆碱的纯化：
利用硅胶色谱柱用乙醇洗脱色谱柱分离去除含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸；然后再用乙醇洗脱色谱柱分离获得磷脂酰胆碱；
4)富含ω-3脂肪酸磷脂的合成：
将上述提取的藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱与乙醇混合，再加入脂肪酶和适量的水，利用脂肪酶醇解反应制备得到富含ω-3脂肪酸磷脂。
2.根据权利要求1所述的利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法，其特征在于，所述步骤4)之后还包括以下步骤：
5)富含ω-3脂肪酸磷脂的提纯：
将所述步骤4)中获取的富含ω-3脂肪酸磷脂与食品级正己烷按1:10的体积比例混合提取3次，收集乙醇相，旋转蒸发去除乙醇和水后获得提纯后的富含ω-3脂肪酸磷脂。
3.根据权利要求1所述的利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法，其特征在于，所述步骤1)之后还包括：
1a)脱色除臭；将所得的藻油加入占油体质量5％的活性白土进行脱色，脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时抽真空并适度搅拌，过滤除去白土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度为85℃，真空度为0.30Kpa，脱臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢冷却，离心得藻油成品。
4.根据权利要求1所述的利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法，其特征在于，所述获取藻油的步骤包括：
1b)微藻干粉制备；
1c)藻油提取；
取微藻藻粉，以质量分数为60-100％乙醇作为萃取剂，利用加速溶剂萃取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油。
5.根据权利要求4所述的一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法，其特征在于，所述的萃取温度为55～120℃，萃取时间25～85min，萃取次数为2～5次；萃取结束后将萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油。
6.根据权利要求4所述的一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法，其特征在于，所述的微藻包括裂殖壶藻、等鞭金藻、寇式隐甲藻、微绿球藻、绿色巴夫藻、布朗葡萄藻、三角褐指藻、菱形藻、小球藻、栅藻或者杜氏藻。
7.根据权利要求4所述的利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法，其特征在于，所述微藻干粉制备的方法的步骤包括：
1d)选定微藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养发酵，得到微藻原料；
1e)干燥；将步骤(1)得到的微藻原料进行干燥处理，得到微藻粉末；
1f)破壁预处理；将步骤(2)得到的微藻粉末采用超声处理法进行微藻破壁预处理，得到微藻干粉。
8.根据权利要求1～7任一项所述的一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法，其特征在于，所述富含ω-3脂肪酸磷脂的合成中，反应条件为：藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱和乙醇的质量比1：1～4，脂肪酶的加入量占藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱质量的5～18％，加水量占藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱质量的0～15％，反应温度25～55℃，反应时间为12h～60h，搅拌速度300～600r/min。
9.根据权利要求1～7任一项所述的一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法，其特征在于，所述步骤2)中藻油与丙酮的体积比藻油：丙酮为1：10。
10.根据权利要求7所述的一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法，所述步骤1d)包含准备培养基以及异氧发酵的过程；
所述准备培养基包含,
步骤1d1)固体培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；琼脂2％；
步骤1d2)一级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖40g，味精35g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.5g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤1d3)二级种子培养基：
培养基组成：培养基组成：葡萄糖50g，味精40g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.3g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤1d4)发酵培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤1d5)菌种保藏培养基：
所述固体培养基或发酵培养基中添加有青霉素，添加量为50～100mg/L，并低温保藏。
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