JP5041790B2

JP5041790B2 - 多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンの製造方法

Info

Publication number: JP5041790B2
Application number: JP2006305787A
Authority: JP
Inventors: 幹也高本; 泰男梅原; 進之介横山; 誠船山
Original assignee: Nippon Suisan KK
Current assignee: Nippon Suisan KK
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2026-11-10
Also published as: JP2008118902A

Description

本発明は、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリン（以下、ＰＳと称することがある）を含む油脂組成物の製造方法に関する。

近年、多価不飽和脂肪酸（高度不飽和脂肪酸ともいう）、例えばドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡと称することがある）、エイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡと称することがある）を構成要素とするリン脂質の持つ生理機能の有効性が明らかにされてきた。このため、多価不飽和脂肪酸を高濃度に含有する材料、例えばイクラなどの魚卵、或いは魚油添加飼料で飼育した鶏の卵から、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするリン脂質を回収することが行われている。一方、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするリン脂質の物理化学的特性を生かして、単に乳化剤或いは分散剤としての利用のみならず、リポソーム等の基剤として薬剤運搬体への応用が近年注目されている。また、リン脂質自体が生理活性、薬理作用をもつ素材として、医薬品、化粧品、飼料等の分野だけでなく、一般加工食品或いは健康食品等の分野においても高度利用が検討されている。

他方、レシチンの一種であるＰＳは、天然動植物の組織、とりわけ大豆或いは牛脳等の組織における細胞膜構成物質として比較的多く存在している。従来は、牛脳等の動植物組織より抽出し、濃縮、分画及び分別等の精製処理を施して採取されていた。ＰＳは、生体内中では脳細胞のシナプス周辺に局在し、神経伝達物質の橋渡しに大きく寄与することが知られている。また、ＰＳは、近年、記憶力及び集中力を向上させるなどの脳の機能を維持、改善し得る栄養学的かつ医薬的に有望な素材として注目を集めており、ＰＳを経口的に１日１００〜３００ｍｇ摂取することで、加齢に伴う記憶障害或いは認知力を改善する効果が明らかになっている。また、一般にグリセロリン脂質を大量生産するために、出発物質のレシチンを化学的或いは酵素的にホスファチジル基を転移置換し、これから濃縮、分画等して精製する方法が提案されてきた（下記引用文献１〜６を参照）。

ホスホリパーゼＤを用いてホスファチジル基転移反応を利用し、レシチンの塩基部分を交換しようとする場合、一般的には、酵素、反応受容体、ｐＨ緩衝液、無機塩等を含む水相と、親油性であるレシチン等を含む有機溶媒相とを、攪拌、混合して接触させる酵素反応系（二相溶媒系）が利用されてきた。

このような二相溶媒系において、ホスファチジル基転移反応を促進させる有機溶媒として、石油エーテル、ジエチルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素、ｎ−オクタン、イソオクタン、酢酸エチル、ベンゼン等、或いはこれらの混合溶媒が知られている。しかし、これらの有機溶媒はレシチンを溶解することはできるが、転移反応を促進させる効果は十分でなく、また反応で得られたＰＳを食品等に利用しようとする場合には安全性などの点からこれら有機溶媒を使用することができない。

このように酵素反応を二相溶媒系で行う場合には、酵素と交換させる塩基性物質と、レシチンとを効率よく接触させる必要があり、親油性有機溶媒と、水或いは親水性溶媒との二相を使用することが必須条件であった。このため食品用途を考慮した場合、使用可能な安全性の高い反応溶媒という観点から使用可能な有機溶媒としてｎ−ヘキサン（以下、単にヘキサンという）とアセトンとがあるが、これら反応溶媒を用いたとしても食品として、さらに生産面での安全性等についての問題が残る。

また、乳化剤を加えて、無溶剤で酵素反応を行う方法もあるが、乳化剤の種類の適切な選択、さらに乳化を十分に行う必要性がある。

特開昭６３−３６７９１号公報特開平８−１３３９８４号公報特開平９−１２１８７９号公報特開平７−１７８５５号公報特開２００１−１８６８９８号公報特開２００２−２１８９９１号公報

このような実状に鑑み、本発明は、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンを食品等においても安全性を懸念することなく使用することができようにするために、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンの新たな製造方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、ホスホリパーゼＤのホスファチジル基転移活性を効率良く発現させることによって、食品用途をはじめとする各産業分野において使用できる多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンを得る方法を提供する。

本発明者らは前述の課題を解決するために検討を重ねた結果、ホスホリパーゼＤの存在下でレシチンとセリンを反応させて多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンを製造する方法において、ホスホリパーゼＤ、セリン、水及びレシチンを含む反応系を超臨界又は亜臨界二酸化炭素の存在下で上記反応を行うと、二相溶媒系或いは乳化剤を使用することなく、ホスファチジル基転移反応（塩基交換反応）が起こることを見出した。レシチンは水に溶けにくいために二相溶媒系或いは乳化剤を使用しない場合、ホスファチジル基転移反応が進みにくいが、本発明に従うホスファチジルセリンの製造方法では、上記反応系を超臨界又は亜臨界二酸化炭素の存在下で上記反応を行うことによって、二相溶媒系或いは乳化剤を必要とすることなくホスファチジル基転移反応が起こることは驚きである。これまで、超臨界又は亜臨界二酸化炭素を用いて、有効成分の抽出或いはリパーゼを用いての加水分解或いはエステル交換反応の研究が行われているが、レシチンの塩基交換反応によってホスファチジルセリンを合成することは報告されていない。また、従来、トリグリセライドと遊離脂肪酸のエステル交換反応のために超臨界装置を用いた例はあるが、係る場合において水を加えると加水分解が起こり目的とする物質が得られないため、水そのものを溶媒として加えることはない。

本発明では、上記反応系の容量が、反応槽の容量に対して好ましくは５〜５０％、より好ましくは１０〜４０％である。本発明では、上記反応系が、レシチン１ｇに対して好ましくは１０〜２００ｍｌの水、より好ましくは１０〜５０ｍｌの水を含む。アシル基として、ｎ−３系の多価不飽和脂肪酸残基を含むものが好ましい。ｎ−３系の多価不飽和脂肪酸として、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される１又は２種以上であることが好ましい。レシチンとして、海産物由来のものが挙げられる。海産物として、海産物組織、具体的にはイカ（イカミール）を挙げることができる。また、レシチンは、アシル基をもつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールのうちの少なくとも一つを含むことが好ましい。

本発明は以上説明したとおり、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするレシチンを基質とし、従来使用されてきた溶剤或いは乳化剤を使用しないで、多価不飽和脂肪酸を豊富に含有するＰＳをホスファチジル基転移反応で容易に製造することができる。また、本発明に従い製造されたＰＳは、溶媒として、超臨界又は亜臨界二酸化炭素及び水を用いるだけであることから、安全性の点で懸念がなく、食品分野等をはじめとして多くの分野で利用可能である。

本発明では、ホスホリパーゼＤを用いる酵素反応において、ホスホリパーゼＤ、セリン、水及びレシチンを含む反応系を超臨界又は亜臨界二酸化炭素の存在下で反応を行う。すなわち、本発明では、超臨界又は亜臨界二酸化炭素及び水を用いることを必須とする。

超臨界装置として、二酸化炭素の超臨界又は亜臨界状態を作れればどのような装置であってもよい。超臨界二酸化炭素とは、二酸化炭素の臨界温度である３１℃以上及び臨界圧力である７．３８ＭＰａ以上の超臨界条件下の二酸化炭素をいう。また、亜臨界条件すなわち臨界点付近の条件下の二酸化炭素である亜臨界二酸化炭素を用いうる。亜臨界二酸化炭素とは、圧力７．０ＭＰａ以上、かつ温度２５℃以上であって超臨界状態ではない二酸化炭素をいう。このように、超臨界状態又は亜臨界状態は、温度と圧力の関係によって作られる。超臨界装置は反応槽を有し、該反応槽に、ホスホリパーゼＤ、セリン、水及びレシチンを含む反応系を入れ、二酸化炭素を加えて超臨界又は亜臨界状態にする。超臨界又は亜臨界状態にする条件は、当業者によって適宜設定されうる。

反応系の容量は、上記反応槽の容量に対して好ましくは５〜５０％、より好ましくは１０〜４０％である。この範囲をはずれると、ホスホリパーゼＤによるホスファチジル基転移反応の効率が著しく低下するためである。二酸化炭素の量は、上記反応系を含む反応槽に二酸化炭素が導入されて超臨界又は亜臨界状態にされることから、反応槽及び反応系の容量によって決まる。

上記反応系は、レシチン１ｇに対して好ましくは１０〜２００ｍｌの水、より好ましくは１０〜５０ｍｌの水を含む。１０ｍｌ未満では原料基質を溶解した溶液の粘度が高くなって反応効率の低下を招く原因になり、一方２００ｍｌを超えると生産性の効率が悪くなるためである。

ホスファチジル基転移反応の温度は５〜５０℃で行うのがよく、より好ましくは２０〜５０℃、さらにより好ましくは３１〜５０℃であるが、超臨界を保つためにその都度圧力を調整、例えば７．３８ＭＰａ以上にする必要がある。当該反応の所要時間は、酵素量或いは反応温度により変動するが、おおむね２〜４８時間である。反応後、内容物から水相（酵素を含む）を除去することによって本発明の目的物である多価不飽和脂肪酸を構成要素とするＰＳを得ることができる。なお、得られたＰＳを、溶剤分別、クロマト分画等の処理によりさらに高純度に精製することも可能である。

レシチンはいかなる起源のものを用いてもよいが、アシル基を有するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールのうちの少なくとも一つを含むことが好ましい。用いる起源によっては、ホスファチジルセリンを元々含んでいる場合がある（例えば、下記実施例１のイカ由来のレシチン）。また、アシル基は不飽和結合の有無或いは炭素数は任意であるが、ｎ−３系の多価不飽和脂肪酸残基を含むものが好ましい。このような脂肪酸とし、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等を例示でき、これらの１又は２種以上を含むものが好適である。かかるレシチンの原料としては大豆等の植物由来の物、鶏卵、マグロ、イカ等の海産物由来の物、海産物由来の組織（海産物組織）から常法により採取したレシチンを用いることができる。また、合成品のレシチンでもさしつかえない。目的とするホスファチジルセリンの構成脂肪酸としてドコサヘキサエン酸を必要とする場合は、イカ、マグロ等の海産物組織から得られるドコサヘキサエン酸を高濃度に含む構成脂肪酸残基を有するレシチンを用いるのが好ましい。

セリンは、Ｄ−セリン又はＬ−セリンを使用できるが、ホスファチジル基転移の反応効率及び生体内活性の点からＬ−セリンが好ましい。

ホスホリパーゼＤは、キャベツ、米糠又は放線菌等から採取されるものを使用できる。とりわけストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物由来のホスホリパーゼＤが好適であり、一般に市販されているものを用いてもよいが、ホスホリパーゼＤを含む該微生物の培養液をそのまま反応に使用してもかまわない。

水はイオン交換水、精製水又は蒸留水を用いるのが好ましく、これに酢酸等でｐＨを弱酸性に調整したものを使用するのが好ましい。例えば、ｐＨ４〜６の酢酸緩衝液或いは同様のｐＨのリン酸緩衝液とするのがより好ましい。塩化カルシウムを５〜１００ｍＭ含む緩衝液を使用してもかまわない。

本発明によれば、ホスホリパーゼＤを用いるホスファチジル基転移反応において、水と水に溶解しないリン脂質とが、超臨界又は亜臨界二酸化炭素及び水を溶媒として反応することにより、レシチンが水中で反応しうる状態になる。

このようにして得られたＰＳは脳機能改善効果を有する。ＰＳによる脳機能改善効果のメカニズムは不明であるものの、多価不飽和脂肪酸の持つ効果が相乗され（投与期間が短くても効果がある）、従来製造されている、レシチン（ホスファチジルコリンなど）よりも優れた脳機能改善を有する。さらに、本発明に従う製造方法は安全性の点で懸念がなく、食品分野をはじめ各分野で利用可能な、生体機能性の高い多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンを効率よく製造することができる。

以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでない。また、以下の記載において、％は特に断らない限り、重量％を意味する。

リン脂質の分析及び定量方法を示す。リン脂質の分析方法は、公知のアセトン沈殿法によりリン脂質組成物からリン脂質を分別し、該分別したリン脂質について、基準油脂分析試験法（日本油化学会制定）（社団法人日本油化学会編集「基準油脂分析試験法」）に基づき、脂肪酸の組成のうちのＤＨＡ、ＥＰＡの量はガスクロマトグラフィーを用いて測定し、リン脂質中のホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン等の量は薄層クロマトグラフィーを用いて分析した。

本実施例で使用する超臨界装置として、インテリジェント超臨界ＣＯ２ポンプＳＣＦ−Ｂｐｇ型（日本分光株式会社製）、作動圧力プログラマブルバックプレッシャーレギュレータＳＣＦ−Ｇｅｔ型（同上）、晶析プログラム低温循環装置ＰＣＣ−７０００型（ＥＹＥＬＡ株式会社製）を用いた。

イカミールを定法で抽出し、該抽出物をアセトン分別して得たイカ由来のレシチン（ホスファチジルコリン：45.8％、ホスファチジルセリン：1.7％、構成脂肪酸のうちドコサヘキサエン酸：40.1％）0.1 ｇ、並びにＬ−セリン 1.07 ｇ、ホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製、1,500Ｕ／ｇ）6 ｍｇを含む0.2Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ 5.5）3 ｍｌを反応槽（１０ｍｌ）に入れ、炭酸ガス（純度９９．９５％以上）を反応槽に入れ（流速３ｍｌ／分）、圧力17.7 ＭＰａ、温度33℃の超臨界状態にし、その状態で６時間保った。その後、圧力を解放して二酸化炭素を除いた。内容物から水層（Ｌ−セリン及びホスホリパーゼＤを含む）を除き、残部を分析したところ、ホスファチジルセリンの量は、残部に対して34.9％であった。下記参考例１の有機溶媒を用いた系と比較して同等の反応率でホスファチジルセリンが得られた。

実施例１と同じレシチン 0.2 ｇ、並びにＬ−セリン 1.2 ｇ、塩化カルシウム 17 ｍｇ、酢酸ナトリウム 55 ｍｇ、酢酸 6 μｌ、及びホスホリパーゼＤ 6 ｍｇを含む精製水 2 ｍｌを反応槽（10ｍｌ）に入れ、実施例１と同条件で超臨界状態にし、その状態で４時間保った。その後、圧力を解放して二酸化炭素を除いた。内容物から水層（Ｌ−セリン、ホスホリパーゼＤ等を含む）を除き、残部を分析したところ、ホスファチジルセリンの量は、残部に対して35.9％であった。下記参考例１の有機溶媒を用いた系と比較して同等の反応率でホスファチジルセリンが得られた。

［参考例］
実施例１と同じレシチン 1.2 ｇを酢酸エチル 100 ｍｌに溶解し、これにＬ−セリン12.8 ｇを0.2Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ 5.5）40 ｍｌに溶解したものを加え、ホスホリパーゼＤ 72ｍｇを添加し、40℃で４時間攪拌した。その後、内容物から水層（ホスホリパーゼＤを含む）を除き、残部を分析したところ、ホスファチジルセリンの量は、残部に対して35.1％であった。

本発明の製造方法により製造されたホスファチジルセリンは、その製造過程において有機溶媒及び乳化剤、特に有機溶媒を使用していないことから食品用途をはじめとする各産業分野において安全性を懸念することなく使用することができる。

Claims

ホスホリパーゼＤの存在下でレシチンとセリンを反応させて多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンを製造する方法において、ホスホリパーゼＤ、セリン、水及びレシチンを含む反応系を超臨界又は亜臨界二酸化炭素の存在下で前記反応を行うことを特徴とする、前記方法。
前記反応系の容量が、反応槽の容量に対して５〜５０％である、請求項１に記載の方法。
前記反応系の容量が、反応槽の容量に対して１０〜４０％である、請求項１に記載の方法。
前記反応系が、レシチン１ｇに対して１０〜２００ｍｌの水を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記反応系が、レシチン１ｇに対して１０〜５０ｍｌの水を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
多価不飽和脂肪酸が、ｎ−３系の多価不飽和脂肪酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
多価不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸のうちの少なくとも一つである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
レシチンが、海産物組織より抽出されたレシチンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
レシチンが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールのうちの少なくとも一つを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。