JP2002218991A

JP2002218991A - ホスファチジルセリンの製造方法

Info

Publication number: JP2002218991A
Application number: JP2001014646A
Authority: JP
Inventors: Atsuro Nishina; 淳良仁科; Hideyuki Torada; 英之虎田; Ron Hashizume; 論橋爪
Original assignee: NOF Corp
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 2001-01-23
Filing date: 2001-01-23
Publication date: 2002-08-06

Abstract

(57)【要約】【課題】酵素触媒反応でホスファチジルコリンを塩基
交換してホスファチジルセリンを得るに際して、有機溶
媒を使用せず水系で、特定の界面活性剤を用いて、反応
率よく、また収率よくホスファチジルセリンを得る製造
方法を提供する。【解決手段】水系で界面活性剤の存在下、リン脂質中に
含有するホスファチジルコリンとセリンとのホスホリパ
ーゼＤを用いた塩基交換反応によるホスファチジルセリ
ンの製造方法において、界面活性剤がグリセリン脂肪酸
エステル、蔗糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エス
テルおよびレシチンからなる群より選択される１種また
は２種以上で、かつ、ＨＬＢが８〜１６であることを特
徴とするホスファチジルセリンの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ホスホリパーゼ酵
素による塩基交換反応を行うホスファチジルセリンの製
造方法に関する。さらに詳しくは、原料としてホスファ
チジルコリンを含有するリン脂質、塩基としてセリン
を、塩基交換触媒としてホスホリパーゼＤを用い、有機
溶媒を用いないで、水系で特定の界面活性剤を用いて、
ホスファチジルセリンを高い反応率で得る製造方法に関
する。さらに、前記の製造方法によって得られるホスフ
ァチジルセリンまたはその塩に関する。特に高収率、高
反応率で得られるホスファチジルセリンまたはその塩に
関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、酵素によるホスファチジルセリン
の製造方法として、原料となるリン脂質にホスホリパー
ゼＤの酵素（ＰＬ−Ｄと略す）をセリンの存在下に作用
させ、ホスファチジル基転移反応を利用して、ホスファ
チジルセリンを製造する技術は、すでに開示されている
（例えば、特開昭63−36190号公報、特開昭63−36191号
公報、特開昭63−36792号公報、特開平2−79990号公
報、特開平4−171976号公報、特開平9−1730923号公報
など）。

【０００３】一般に原料となるホスファチジルコリン
は、水に不溶性であり、従来、製造の際には、有機溶媒
を用いて原料のホスファチジルコリンを溶解し、セリ
ン、ホスホリパーゼＤを含む水溶液と混合して乳化状態
の系において、塩基交換反応を行うものが殆どである
（例えば、特開昭63−36190号公報、特開昭63−36191号
公報、特開昭63−36792号公報、特開平2−79990号公
報、特開平4−171976号公報、特開平9−1730923号公報
など）。しかし、酵素ホスホリパーゼＤは、合成触媒作
用と塩基交換触媒作用、さらに加水分解触媒作用も有す
るので、塩基交換反応よりも加水分解反応が早く進行す
る系の場合には、基質の加水分解物の生成が塩基交換反
応より優勢となり、目的とするホスファチジルセリンを
高濃度で得ることができず、その結果、物性、生理活性
面等で十分満足できるホスファチジルセリンを得ること
ができなかった。

【０００４】前記の特開昭63−36792号公報にはリン脂
質の塩基交換反応を行う際に反応溶媒として有機溶剤を
用い、界面活性剤を利用した技術が開示されているが、
やはり塩基交換反応よりも加水分解が優勢となり、目的
とするリン脂質を高濃度で得ることができず、結果、物
性、生理活性面等で十分満足できるリン脂質を製造する
ことができなかった。

【０００５】また、有機溶媒を用いてリン脂質を製造し
た後、反応溶液からリン脂質を得る際に、特にリン脂質
を取り出し、食品用途や医薬品等の用途に使用する場合
には、有機溶媒を完全に除去する必要があり、その際に
は、長時間加熱を必要とする場合等では、リン脂質の劣
化が引き起こされるなど問題があった。特開平9−17309
2号公報には、リン脂質の精製の際に、過剰のリン脂質
あるいは例えばホスフアチジルセリンのリン脂質の場
合、カルシウム塩等の塩型にして溶媒で精製し、さらに
他の塩型にする方法が開示されている。しかし、溶媒を
使用する等の問題や、反応率が２２％であり、まだ十分
でない等の問題があった。

【０００６】また、ホスファチジルセリンの塩基交換反
応を行う際に、有機溶媒を用いない水系で、特定の界面
活性剤を用いて反応効率を上げる技術が報告されている
［ＰａｕｌＣｏｍｆｕｒｉｕｓらＪ．Ｌｉｐｉｄ
Ｒｅｓ．３１、１７１９−１７２１（１９９０）］。さ
らに詳細には前記の文献には、塩基交換反応に有機溶媒
を用いず、乳化剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＨＬ
Ｂ＝４０）、デオキシコレートナトリウム（胆汁酸Ｎ
ａ、ＨＬＢ＝１８．９）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グル
コシド（ＨＬＢ＝６．７）を用い、ホスファチジルコリ
ンからホスファチジルセリンを調製する際の最高の反応
率がそれぞれ２５、２９、４６％であることが読みとれ
る。この方法の問題点として、使用した乳化剤は一般的
なもので食品添加物として認められていないので、得ら
れたホスファチジルセリンを含む生成物を食用等として
摂取することができない。また反応率や収率が十分に高
くなっていないことが挙げられ、工業的な生産方法とし
ては適さなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、酵素
触媒反応でホスファチジルコリンを塩基交換してホスフ
ァチジルセリンを得るに際して、有機溶媒を使用せず水
系で、特定の界面活性剤を用い、さらに反応率よく、ま
た収率よくホスファチジルセリンを得る製造方法を提供
することにある。また、反応時または反応後にカルシウ
ム塩を用いて、収率よくホスファチジルセリンのカルシ
ウム塩を得る製造方法を提供することにある。さらに、
本発明の目的は、前記の製造方法によって得られる、高
純度のホスファチジルセリンまたはその塩を提供するこ
とにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の問
題点に鑑み鋭意検討した結果、有機溶媒を使用せずに、
原料としてホスファチジルコリン、セリンおよび反応触
媒としてホスホリパーゼＤの酵素を用いて、ホスファチ
ジルセリンを製造する方法において、食品に使用できる
特定の界面活性剤を選択することにより高反応率で、収
率よくホスファチジルセリンを得ることができることの
知見を得て、本発明を完成するに至った。即ち本発明
は、次の［１］〜［６］である。［１］水系で界面活性剤の存在下、リン脂質中に含有
するホスファチジルコリンとセリンとのホスホリパーゼ
Ｄを用いた塩基交換反応よるホスファチジルセリンの製
造方法において、界面活性剤がグリセリン脂肪酸エステ
ル、蔗糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルお
よびレシチンからなる群より選択される１種または２種
以上で、かつ、ＨＬＢが８〜１６であることを特徴とす
るホスファチジルセリンの製造方法。

【０００９】［２］ホスホリパーゼＤが、微生物由来
のホスホリパーゼＤまたはキャベツ由来のホスホリパー
ゼＤである前記［１］のホスファチジルセリンの製造方
法。［３］得られた製品中にホスファチジルセリン１０重
量％以上を含有し、原料中のホスファチジルコリンの含
量に対する得られた製品中のホスファチジルセリンの含
量の比で示す反応率が、５０％以上で、かつ、原料にリ
ン脂質に対する得られた製品中のホスファチジルセリン
の量で示される収率が８５％以上である前記の［１］ま
たは［２］のホスファチジルセリンの製造方法。［４］反応温度が４０〜６０℃である前記の［１］〜
［３］のいずれかに記載のホスファチジルセリンの製造
方法。

【００１０】［５］水系で界面活性剤の存在下、リン
脂質中に含有するホスファチジルコリンとセリンとのホ
スホリパーゼＤを用いた塩基交換反応よるホスファチジ
ルセリンの製造方法において、界面活性剤がグリセリン
脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪
酸エステルおよびレシチンからなる群より選択される１
種または２種以上で、かつ、ＨＬＢが８〜１６である界
面活性剤を用い、さらに反応系中に無機塩を加えて反応
と同時に生成物を塩析することを特徴とするホスファチ
ジルセリンまたはその塩の製造方法。

【００１１】［６］前記の［１］〜［３］のいずれか
１項に記載のホスファチジルセリンを得た後、次いで、
反応液に無機塩を加えて塩析することを特徴とするホス
ファチジルセリンまたはその塩の製造方法。

【００１２】［７］前記の［１］〜［６］のいずれか
に記載のホスファチジルセリンの製造方法によって得ら
れたホスファチジルセリン若しくはホスファチジルセリ
ンのカルシウム塩であって、それらの純度で２０重量％
以上含有することを特徴とするホスファチジルセリンの
含有物またはホスファチジルセリンのカルシウム塩の含
有物。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明で原料として用いるホスフ
ァチジルコリンを含有するリン脂質は、ホスファチジル
コリンを含有しているリン脂質であれば天然資源から抽
出したもの、あるいは合成したものの如何を問わず使用
できる。すなわち、例えば、大豆、脱脂大豆、卵黄等か
ら抽出したホスファチジルコリンを挙げることができ
る。また、ホスファチジルコリンを含む大豆レシチン、
脱脂大豆レシチン、卵黄レシチン等またはこれらの混合
物等が挙げられる。また、市販のホスファチジルコリ
ン、または公知の方法で調製したホスファチジルコリン
を使用してもよい。本発明では、ホスファチジルセリン
を反応率よく得るために、用いるホスファチジルコリン
の含量としては、２０〜１００％程度に精製されたもの
を用いる方が望ましい。特に精製により、３０〜９５％
に純度を高めたものが原料としてより望ましい。使用す
る市販品としては、例えば、ツルーレシチン工業（株）
社品：商品名SLP−PCホワイト（純度30％）、同SLP−PC
55（純度55％）、同SLP−PC70（純度70％）、同SLP−PC
90（純度90％）；ナッタ−マン社製：商品名ホスフォリ
ポン100（純度95％）；日本油脂（株）社製：コートソ
ームNC−10S（純度95％）、同NC−21（純度90％）；ル
ーカスマイヤー社製：商品名エピクロン135F（純度35
％）等が好ましいものとして挙げられる。前記の原料は
単独または２種以上を混合して使用することができる。
以下原料としてホスファチジルコリンを含有するリン脂
質を、ホスファチジルコリンと称する場合もある。

【００１４】本発明に用いるセリンとしては、市販のＬ
−、Ｄ−セリンまたはラセミ体を使用することができ
る。また、天然界からの抽出セリン、合成セリンのいず
れも使用することができる。これらのセリンの使用量
は、前記のホスファチジルコリンの純度にもよるが、原
料ホスファチジルコリン／セリンの比率は、１／０．５
〜１／２０重量比である。より好ましくは、１／０．７
〜１／１０重量比、さらに好ましくは、１／０．８〜１
／５重量比である。原料ホスファチジルコリン／セリン
の比率が、１／０．５重量比よりセリンが少なくなると
反応速度が低下するので好ましくなく、１／２０重量比
よりセリンが多くなると添加量に見合う反応率の著しい
向上が認められないので好ましくない。

【００１５】本発明に用いる界面活性剤としては、食品
添加物で認められているグリセリン脂肪酸エステル、蔗
糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルおよびレ
シチンからなる群より選択される１種または２種以上
で、かつＨＬＢが８〜１６の範囲のものである。グリセ
リン脂肪酸エステルとしては、例えば、グリセリンモノ
オレエート、ヘキサグリセリンセスキステアレート、テ
トラグリセリンモノステアレート等が挙げられる。蔗糖
脂肪酸エステルとしては、例えば、蔗糖のモノエステル
やポリエステル等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エス
テルとしては、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソ
ルビタンモノミリスチレート等が挙げられる。これらの
市販品としては、例えば、坂本薬品（株）社品：商品名
ＳＹグリスターＭＣＡ−７５０（グリセリン脂肪酸エス
テル、ＨＬＢ＝１６），商品名ＳＹグリスターＭＯ−５
００（グリセリン脂肪酸エステル、ＨＬＢ＝１１），商
品名ＳＹグリスターＳＳ―５００（グリセリン脂肪酸エ
ステル、ＨＬＢ＝１０），商品名ＳＹグリスターＭＳ−
３１０（グリセリン脂肪酸エステル、ＨＬＢ＝８）；三
菱化学（株）社品：商品名リョートーシュガーエステル
Ｓ−１６７０（蔗糖脂肪酸エステル、ＨＬＢ＝１
６）；太陽化学（株）品：商品名サンレシチンＡ（酵素
分解大豆レシチン、ＨＬＢ＝１２）が好ましいものとし
て挙げられる。グリセリン脂肪酸エステルの市販品とし
ては例えば、デカグリセリンのモノカプリレート：坂本
薬品（株）社品、商品名ＳＹグリスターＭＣＡ−７５０
（ＨＬＢ＝１６），テトラグリセリンのモノオレエー
ト：坂本薬品（株）社品、商品名ＳＹグリスターＭＯ−
５００（ＨＬＢ＝１１），ヘキサグリセリンモノステア
レート：商品名ＳＹグリスターＳＳ―５００（ＨＬＢ＝
１０）、テトラグリセリンモノステアレート；坂本薬品
（株）社品、商品名ＳＹグリスターＭＳ−３１０（ＨＬ
Ｂ＝８）等が挙げられる。

【００１６】蔗糖脂肪酸エステルの市販品としては、例
えば、蔗糖の脂肪酸モノエステルおよびジエステルの混
合物で；三菱化学（株）社品商品名リョートーシュガー
エステルＳ−１６７０（ＨＬＢ＝１６）、Ｐ−１５７
０、また第一工業薬品社製、ＤＫエステルＦ−９０、Ｆ
−１１０、Ｆ−１４０、Ｆ−１６０等が挙げられる。ソ
ルビタン脂肪酸エステルの市販品としては例えば、ソル
ビタンモノラウリン（ＨＬＢ８．６）として理研ビタミ
ン（株）社製、ポエムＬ−３００、ソルビタンモノミリ
スチン（ＨＬＢ８．２）等が挙げられる。さらにレシチ
ンの市販品としては、例えば、酵素分解大豆レシチン；
太陽化学（株）品、商品名サンレシチンＡ（ＨＬＢ＝１
２）等が挙げられる。

【００１７】ここで、ＨＬＢは、親水性と疎水性の基の
バランスをしめす界面活性剤の性質の指標で、通常使用
される、Ｇｒｉｆｆｉｎの式やＤａｖｉｅｓの式が使用
される。また、ＨＬＢが既知の界面活性剤を使用し実験
により決定してもよい。一般的には、カタログ等に記載
されている数値を使用してもさほど違いはない。ここで
はカタログ値を使用したり、前記の計算式に基づいて、
算出した。（例えば、参考図書；「新版界面活性剤ハン
ドブック」、工学図書出版、第２２６頁〜２４４頁；吉
田、大垣、進藤、山中共著）

【００１８】前記の界面活性剤の使用量は、原料中のホ
スファチジルコリンに対して０．１〜２００重量％、好
ましくは１〜１０重量％、より好ましくは２〜７重量％
である。界面活性剤の量が、ホスファチジルコリンに対
して０．１重量％未満の場合では界面活性剤の効果が十
分でなく目的とする反応率が得られない。また、界面活
性剤の量が２００重量％よりも多い場合は、添加量に見
合った著しい効果の向上が得られない。

【００１９】本発明の反応系としては、原料のホスファ
チジルコリンを懸濁する溶媒として、また、セリン、酵
素を溶解する溶媒として、水または緩衝溶液を用いる。
緩衝溶液としては、例えばギ酸−ギ酸ナトリウム緩衝
液、グリシン一塩酸緩衝液、酢酸一酢酸ナトリウム緩衝
液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナト
リウム緩衝液等を所定のｐＨに調整して用いることが望
ましい。水若しくは緩衝液の配合比率は、反応中の系全
体における水分の含量表示では、およそ５０〜９９重量
％が好ましい。ここで、酵素は活性を発揮するための至
適ｐＨの範囲があり、後記の所定のｐＨの範囲で反応を
行うことが好ましい。

【００２０】本発明に使用するホスホリパーゼＤとして
は、例えば微生物由来のホスホリパーゼＤ、キャベツ等
の野菜由来のホスホリパーゼＤ、ピーナッツ等の豆類由
来のホスホリパーゼＤを挙げることができる。微生物由
来のホスホリパーゼＤとしては、例えばストレプトマイ
セス（放線菌）属由来のもの等が挙げられる。これらの
酵素は公知の方法で天然物から抽出、精製して使用す
る。また、市販品をそのまま用いてもよいし、精製して
用いてもよい。市販品としては、例えばキャベツ由来ホ
スホリパーゼＤ（ベーリンガー・マンハイム社製品）、
放線菌由来ホスホリパーゼＤ（旭化成工業（株）社品、
商品名ＰＬＤ−Ｐ）、ピーナッツ由来ホスホリパーゼＤ
（シグマ社社品）等を挙げることができる。これらのホ
スホリパーゼＤの酵素は、単独または２種以上を組み合
わせて使用してもよい。工業的な観点から、前記の酵素
は、活性が高いものや、入手が容易なものから選定する
ことが好ましく、キャベツ由来の酵素や、ストレプトマ
イセス（放線菌）属由来の酵素をより好ましく挙げるこ
とができる。酵素濃度は、塩基交換反応が促進する限り
は、特に限定されないが、通常、原料ホスファチジルコ
リンに対して０．００１〜１重量％であり、好ましく
は、原料ホスファチジルコリンに対して０．０１〜０．
２重量％である。

【００２１】酵素反応を行う際には、酵素の活性を高め
るために、カルシウム等のイオンを活性化剤として添加
することがより望ましい。カルシウムイオン源として
は、例えば塩化カルシウム等を挙げることができる。そ
の添加量としては、例えば原料のセリンの量に対して、
１〜２００重量％、より好ましくは２〜１００重量％が
挙げられる。例えば酵素ホスホリパーゼＤの反応では、
至適ｐＨは４〜８であり、至適温度は、４０〜６０℃で
あり、この範囲で反応することが望ましい。

【００２２】次に、反応方法について詳述する。原料と
してホスファチジルコリンを含有するリン脂質とセリン
を用いて、反応触媒として前記の酵素ホスホリパーゼＤ
を用いて反応を行うに際して、前記の界面活性剤、セリ
ン、酵素等を溶解した水または塩等の緩衝溶液に、原料
のホスファチジルコリンを直接加えて乳化してもよい。
また、原料のホスファチジルコリンを界面活性剤を用い
て予め所定の水に分散させたものを前記の緩衝溶液に加
えて反応してもよい。また、かき混ぜの条件は、かき混
ぜることによりＯ／Ｗ型のエマルションができれば特に
限定されないが、初期には、油滴の形成により表面積が
多くなることが望ましい。また、せん断力が強すぎる
と、転相して、反応中で酵素が極在化して反応が進まず
好ましくない。反応様式としては、容器に入れた反応液
を、攪拌し、前記のようなＯ／Ｗ型エマルションの系で
反応させることができればよく、循環式のかき混ぜ方
式、回転羽根によるかき混ぜ方式、超音波によるかき混
ぜ方式などあらゆる形式の反応様式が可能である。ホス
ファチジルコリンを乳化する方法としては、例えば水相
にホスファチジルコリンおよび界面活性剤を加えてか
ら、かき混ぜ機、または市販の均質化機を用いてもよ
い。市販の均質化機としては、例えば、ポリトロン（キ
ネマチカ社）、ソニフアイヤー（ブランソン社）、マイ
クロフルイダイザー（マイクロフルイド社）、ホモジナ
イザー（岩井機械社）等を挙げることができる。

【００２３】ここで、反応条件としては、前記のように
温度は、前記の酵素に適する温度範囲が好ましく、か
つ、リン脂質が加水分解や熱履歴により着色しない範囲
が好ましい。具体的には反応温度は、４０〜６０℃の範
囲が好ましく、リン脂質の構成脂肪酸の不飽和度が高い
場合には、できるだけ低温で反応を行うのが望ましい。
前記の反応温度が４０℃未満の場合は、反応速度が遅く
て反応効率が悪くなる傾向ににあり、前記の反応温度が
６０℃より高い場合は、反応中に酸化や加水分解が著し
くなる傾向にあるので好ましくない。また反応時間は反
応溶液の組成により異なるが、１０分〜１００時間であ
る。より好ましくは、３０分〜６０時間である。反応の
終点としては、反応液中のホスファチジルセリンの生成
量をチェックし、最高点で反応をとめることにより、最
大の収率を得ることが望ましい。

【００２４】反応後のホスファチジルセリンは、水系の
液状分散状態で用いても構わないが、分離して高濃度品
として得ることが望ましい。その際には、反応後のホス
ファチジルセリンを塩析によって油性成分を分離して得
る方法が挙げられる。塩析の方法としては、反応液に、
直接塩類を添加して所定の温度でかき混ぜた後に、静置
して、ホスファチジルセリンを水相と分離して行っても
よい。塩析に使用する塩類については、特に制限はない
が、塩析の効果は離液順列によって決めることができ
る。すなわち、陽イオンが同種の場合には、クエン酸イ
オン＞酒石酸イオン＞ＳＯ ₄ ^--＞ＣＨ₃ＣＯ₂ ^-＞Ｃｌ^-＞
Ｂｒ^-＞ＮＯ₃ ^-＞ＣｌＯ₃ ^-＞Ｉ^-＞ＳＣＮ^-の順に塩析力
が強くなる。また、陰イオンが同じ場合には、１価の陽
イオンではＬｉ⁺＞Ｎａ⁺＞Ｋ⁺＞Ｒｂ⁺＞Ｃｓ⁺の順、２
価のイオンではＭｇ⁺⁺＞Ｃａ⁺⁺＞Ｓｒ⁺⁺＞Ｂａ⁺⁺の順で
塩析力が強くなる。水溶液への溶解性や安全性の面から
考慮すると、前記塩析用の塩類のうち、ＮａＣｌ、Ｃａ
Ｃｌ₂等がより望ましい。塩類の濃度は、０．０１重量
％から飽和濃度までである。塩類の濃度が０．０１重量
％未満では塩析効果が殆ど認められない。また、飽和濃
度以上の塩類を加えても塩析効果は添加に見合うだけ高
くならない。より好ましくは、酵素の活性化も同時に行
えるＣａ⁺⁺を、具体的には例えば塩化カルシウムをセリ
ンに対して１〜２００重量％添加する。より好ましく
は、２〜１００重量％添加する。塩析を行う温度条件と
しては、０〜６０℃の範囲である。なお、原料の構成脂
肪酸の不飽和度が高い場合には、できるだけ低温で行う
ことが望ましい。塩析を行う温度は、より好ましくは、
２０〜５０℃の範囲である。また、前記のような塩類を
反応途中で既に共存させておいて順次塩を形成させる方
法でも構わない。

【００２５】また、前記反応において、生成したホスフ
ァチジルセリンを含有する反応物は、目的としてホスフ
ァチジルセリンのカルシウム塩型として得る場合には、
反応の系に直接カルシムウム塩を添加していてもよい
し、また反応後、カルシウム塩を加えて、ホスファチジ
ルセリンのカルシウム塩型にしてもよい。使用するカル
シウム塩としては、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、
リン酸カルシウム等が挙げられる。その添加量として
は、使用したセリンに対して１〜２００重量％であるの
が望ましい。より望ましくは１〜１００重量％である。

【００２６】

【発明の効果】本発明のホスファチジルセリンの製造方
法は、塩基構造が変換されたホスファチジルセリンを製
造するに際して、有機溶媒を使用せずに、また食品に使
用できる特定の界面活性剤を使用するので、食品用途に
使用可能な安全なホスファチジルセリンを得る製造方法
である。特に高反応率かつ高収率が得られる製造方法で
あり、原料のセリン、ホスホリパーゼＤ等の原料を、す
ベて水または緩衝溶液等の水溶液系で、また、原料ホス
ファチジルコリンを、界面活性剤を用いて水または緩衝
液に懸濁、分散させた状態で反応を行うので、高純度、
高収率で、ホスファチジルセリンを容易に得ることがで
きる製造方法である。またさらに、反応後にホスファチ
ジルセリンを得る際に、塩析を利用することにより加水
分解反応や加熱等の劣化を抑えて、収率よく容易にホス
ファチジルセリンを得ることができる。また得られたホ
スファチジルセリンを含むリン脂質は、食品に使用でき
る界面活性剤を使用しているので、高純度で、高収率で
得られるので、安全で健康食品用や飲料用等に適用でき
る。

【００２７】

【実施例】次に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説
明する。以下の記載において、「％」は特に断らない限
り「重量％」を意味する。次に、リン脂質の定量等用い
た測定方法を示す。１．リン脂質の測定；＜ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジル
セリン（ＰＳ）の定量方法＞＜装置および分析条件＞装置；高速液体クロマトグラフィー（ギルソン社製、機
種モデル３０３）固定相；シリカゲルカラム（径４．６ｍｍ×長さ２５０
ｍｍ）移動相（溶離液）；アセトニトリル：メタノール：１０
ｍＭリン酸二水素アンモニウムの混合溶媒（＝６１２：
２８９：１００ｖ／ｖ／ｖ）検出；紫外線ＵＶ波長２０２ｎｍにおける吸収を測定分離温度；４０℃ 試料量；５μｇ流出速度；１．５ｍｌ／分前記の条件により、原料、反応溶液および得られた製品
を用いて測定した。なお予め作成した検量線と試料の紫
外吸収強度を比較して、試料中のホスファチジルコリン
およびホスファチジルセリン含量（重量％）を求めた。
なお原料は試料１ｍｇを１ｍｌの前記の溶離液に溶解し
て分析した。なおまた、反応液の場合は、反応液１ｍｇ
に精製水５ｍｌ、ｎ−ヘキサン５ｍｌを添加し、１分間
撹拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
前記の上澄み液を１ｍｌを分離し、エバポレートで溶媒
を除去して不揮発成分の重量を求めた。濃度が１ｍｇ／
１ｍｌとなるように溶離液を加えて溶解したものを試料
として用いた。＜反応率の計算方法＞反応率は特に断らない限り次のよ
うにして算出した。原料中のホスファチジルコリン含有
量と得られた製品中のホスファチジルセリン含有量の比
（重量比）で示した。反応率（％）＝｛反応後の液中のホスファチジルセリン
（ＰＳ）含有量（ｇ）／原料中のホスファチジルコリン
（ＰＣ）含有量（ｇ）｝×１００＜収率の計算方法＞収率は原料として用いた油脂分と反
応後に得られた油脂分の比（重量比）を意味する。収率（％）＝｛原料として用いた油脂分／得られた油脂
分｝×１００

【００２８】実施例１酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）２０ｍｌにセリン（Ｓｅｒと
略す。）１０ｇ、塩化カルシウム０．２２２ｇ、界面活
性剤（坂本薬品（株）製品、グリセリン脂肪酸モノエス
テル、商品名：ＭＯ―７５０、ＨＬＢ＝１６）０．１
ｇ、ホスホリパーゼＤ（旭化成工業（株）製品、加水分
解活性は１００Ｕ／ｍｇ、以下ＰＬ−Ｄ１と略す）０．
１ｍｇを溶解し、原料のホスホリポン１００（ナッター
マン社製品、ホスホリルコリン純度９５％、前記の方法
により測定した原料中のホスファチジルセリンの含有量
は０％であった。表中、ＰＣ−１と略す。）、０．２ｇ
を加えて超音波乳化機（ソニファイヤー、ブランソン
社）で均質化した。反応温度４５℃の条件で反応を行っ
た。反応時に経時的にサンプリングして全リン脂質中の
ホスファチジルセリンの含量を前記の方法で測定しなが
ら、その値が平衡に近づく時間を確認して反応を行っ
た。即ちおよそ平衡に近づく時点が１時間であることを
確認し、さらに反応して１時間１５分で反応を終了し
た。その後、食塩４ｇを添加し溶解して塩析を行った
後、デカンテーションにより上層のみを分離し、真空凍
結乾燥機（２０℃、８時間）で上層に残った水分を蒸発
させてリン脂質０．１９４ｇを得た。この時、分層状態
は、明らかな界面ができ分離しやすかった。反応終了
後、得られた油脂リン脂質中のホスファチジルセリンの
反応率は、９３．７％となった。なお収率は、９７％で
あった。得られた製品中のホスファチジルセリン含量と
収率を求めた結果を表１に示す。図１に実施例１におけ
る経時的にサンプリングし、分析した結果を図示する。
なお、横軸は反応時間で、縦軸は反応液の油脂中のＰＳ
含量（％）で示した。

【００２９】実施例２〜５実施例１の原料の量、セリン量、界面活性剤の種類と
量、緩衝液量、反応条件等を表１のように変更した以外
は、実施例１と同様にして反応を行った。結果を表１に
示す。

【００３０】比較例１酢酸緩衝液（ＰＨ５．６）２０ｍｌにセリン（Ｓｅｒ）
１０ｇ、塩化カルシウム０．２２２ｇ、ホスホリパーゼ
Ｄ（＝ＰＬ−Ｄ１）０．１ｍｇを溶解し、原料のホスホ
リポン１００、０．２ｇを加えて超音波乳化機（ソニフ
ァイヤー、ブランソン社）で均質化した。反応温度４５
℃の条件で反応を行った。前記実施例１と同様にして反
応を行った。反応時間は、１９時間であった。その後、
実施例１と同様にして食塩４ｇを添加し、デカンテーシ
ョンにより上層のみを分離し、真空凍結乾燥機（２０
℃、８時間）で上層に残った水分を蒸発させてリン脂質
０．１９４ｇを得た。得られた製品中のホスファチジル
セリン含量と収率を求めた結果、反応率は、２５．２％
となった。収率は９７％であった。

【００３１】比較例２酢酸緩衝液（ＰＨ５．６）２０ｍｌにセリン１０ｇ、塩
化カルシウム０．２２２ｇ、界面活性剤（坂本薬品
（株）製品、ノルマルーオクチルーβ―Ｄ―グルコピラ
ノシド（シグマ社製品）０．１ｇ、ホスホリパーゼＤ
（旭化成工業（株）製品）０．１ｍｇを溶解し、原料の
ホスホリポン１００、０．２ｇを加えて超音波乳化機
（ソニファイヤー、ブランソン社）で均質化した。反応
温度４５℃の条件で反応を行った。実施例１と同様に行
い、反応時に全リン脂質中のホスファチジルセリンの含
量を測定し、反応を終了した。反応時間は１９５分（１
８０＋１５分）であった。ホスファチジルセリンの含量
は４１．１％となった。その後、１００ｍＬのメタノー
ルを加えて１０分間マグネチックスターラーで攪拌した
後、クロロホルムを１００ｍＬ添加しさらに１０分間マ
グネチックスターラーで攪拌した。２０００ｒｐｍで２
０分間遠心分離した後、ロータリーエバポレーターで溶
剤を蒸発させ反応物０．００８９２ｇを得た。収率は４
４．６％であった。得られた反応物中のホスファチジル
セリン含量と収率を求めた。結果を表２に示す。

【００３２】比較例３〜８比較例２の界面活性剤の種類と量を表２および表３のよ
うに変更した以外は、比較例２と同様にして反応を行っ
た。結果を表２および表３に示す。

【００３３】比較例９；＜ジオクチルスルホコハク酸ナ
トリウムを使用したもの＞原料のホスホリポン１００、０．１ｇ、特公平７−１６
４２６号公報の参考例３の方法で調製した精製ジオクチ
ルスルホコハク酸ナトリウム０．０９ｇを３ｍｌのｎ−
ヘキサンに溶解し、セリン０．１５８ｇ、ホスホリパー
ゼＤ（旭化成工業（株）社製品）０．０３６ｍｇを溶
解した精製水３６μＬを滴下し、超音波ホモジナイザー
で逆ミセルを形成した。３７℃で１０時間反応を行っ
た。反応物の回収はロータリーエバポレーター（４０
℃）で行ったが、有機溶媒を完全に除去し反応物を得る
までに２０時間を要した。得られた反応物中のホスファ
チジルセリン含量、収率、反応物中の脂肪酸含量を求め
た。結果を表３に示す。

【００３４】比較例１０；＜ｎ−ヘキサンのみを使用し
たもの＞原料のホスホリポン１００、０．１ｇを３ｍｌのｎ−ヘ
キサンに溶解し、セリン０．１５８ｇ、ホスホリパーゼ
Ｄ（旭化成工業（株）社製品）０．０３６ｍｇを溶解
した精製水３６μＬを滴下し、超音波ホモジナイザーで
逆ミセルを形成した。３７℃で１０時間反応を行った。
反応物の回収はロータリーエバポレーター（４０℃）で
行ったが、有機溶媒を完全に除去し反応物を得るまでに
２０時間を要した。得られた反応物中のホスファチジル
セリン含量、収率、反応物中の脂肪酸含量を求めた。結
果を表３に示す。

【００３５】試験例１；キャベツ由来のホスホリパーゼ
Ｄの調製キャベツ由来のＰＬ−Ｄを得るためにDavidsonらの方法
（Biochem．J．１０２，２０５−２１０頁(１９５８
年)）に準じて調製した。即ち、購入したキャベツ４０
０ｇに精製水６００ｍｌを加え、ミキサーで５分間均質
化し吸引ろ過し繊維分を取り除いた。濾液を遠心分離
（８０００ｒｐｍ、１５分間）し、上澄み液を５５℃で
５分間保持した。次いで、遠心分離（９０００ｒｐｍ、
２０分間）し、上澄み液に２倍容の冷アセトン（−１５
℃）を加え、−１５℃で１０分間保持した。さらに遠心
分離（３０００ｒｐｍ、２０分間）した後、沈殿物を真
空凍結乾燥機を用いて、固形化した。その結果、固形物
３．５ｇを得た。この固形物１ｍｇを用いて、キャベ
ツ由来の酵素のＰＬ−Ｄ活性としてリン脂質加水分解能
を調べた。得られたキャベツＰＬ−Ｄの活性を加藤らの
方法（ＦｏｏｄＳｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｓ．
６（１），２９−３３，（２０００年））で測定した結
果、０．３７Ｕ／ｍｇであった。

【００３６】実施例６；キャベツ由来ＰＬ−Ｄ使用表４に示したように前記の試験例１で得られたキャベツ
由来ＰＬ−Ｄを使用して反応を行った。即ち、実施例１
と同様にして、酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）４ｍｌにセリ
ン１．０ｇ、グリセリン型界面活性剤としてＳＳ−５０
０、０．０５ｇおよび試験例１のキャベツ由来のホスホ
リパーゼＤ（ＰＬ−Ｄ、加水分解活性は０．３７Ｕ／ｍ
ｇ、以下ＰＬ−Ｄ２と略す）４．０ｍｇを溶解し、原料
のホスホリポン１００（ナッターマン社製品、ホスホリ
ルコリン純度９５％、前記の方法により測定した原料中
のホスファチジルセリンの含有量は０％であった）、
０．１ｇを加えて超音波乳化機（ソニファイヤー、ブラ
ンソン社）で均質化した。反応温度５０℃の条件で反応
を行った。反応時に経時的にサンプリングして全リン脂
質中のホスファチジルセリンの含量を前記の方法で測定
しながら、その値が平衡に近づく時間を確認して反応を
行った。即ちおよそ平衡に近づく時点が１９時間である
ことを確認し反応を終了した。その後、食塩４ｇを添加
し溶解して塩析を行った後、デカンテーションにより上
層のみを分離し、真空凍結乾燥機（２０℃、８時間）で
上層に残った水分を蒸発させてリン脂質０．０９７ｇを
得た。この時、分層状態は、明らかな界面ができ分離し
やすかった。

【００３７】比較例１１、１２；キャベツ由来ＰＬ−Ｄ
使用表４に示したように前記の試験例１で得られたキャベツ
由来ＰＬ−Ｄを使用して反応を行った。なお比較例１１
はＮＯＤＧを使用し、比較例１２では界面活性剤を使用
しないで、表４の条件で行った。

【００３８】また、反応後、反応液に、塩析のため塩を
加えた状態を次に示す。即ち、実施例１〜５では、分離
状態がよく、下層の水相が透明性帯びていて、界面がハ
ッキリしているので、分層しやすい。比較例１、７およ
び８は、実施例１と同様に界面がハッキリしている。
しかし、比較例２〜６は、添加した塩によっても塩析が
十分でなく、デカンテーションの際に、乳化液等の状態
で、除去されて、収率が低くなっている。さらに実施例
６および比較例１２では、界面がハッキリしていて収率
が高くなっているが、比較例１１分層状態が悪く油相を
十分得ることができなかったため、収率が低くなってい
る。

【００３９】以上の結果から、本発明の微生物由来のホ
スホリパーゼＤを用いた実施例１〜５は、本発明の範囲
外の界面活性剤を用いた比較例１〜１０に比べて、反応
率、および収率がよいことがわかる。また本発明のキャ
ベツ由来のホスホリパーゼＤを用いた実施例６は、本発
明の範囲外の界面活性剤を用いた比較例１１および界面
活性剤を使用しない比較例１２に比べて、反応率、およ
び収率がよいことがわかる。

【００４０】実施例７；スケールアップの製造精製水９０リットルにセリン３０ｋｇ、塩化カルシウム
１ｋｇ、界面活性剤（坂本薬品（株）製品、グリセリン
脂肪酸エステル、商品名：ＭＣＡ―７５０、ＨＬＢ＝１
６）１０ｋｇ、試験例で調製したキャベツＰＬ−Ｄ、１
５０ｇを溶解し、原料のホスホリポン１００（ナッター
マン社製品）を１０ｋｇを加えてホモジナイザー（岩井
機械社）で均質化した。反応温度５０℃の条件で反応を
行った。反応時に全リン脂質中のホスファチジルセリン
の含量を測定し、その値が最高に達した時点で反応を終
了した。反応時間は、１４時間であった。反応後のホス
フアチジルセリンの含量は９２．４％であった。その
後、食塩２０ｋｇを添加し、デカンテーションにより上
層のみを分離し、真空凍結乾燥機（２０℃、８時間）で
上層に残った水分を蒸発させ反応物を得た。得られた反
応物中のホスフアチジルセリン含量と収率を求めた。そ
の結果、収率は９５％であった。

【００４１】実施例８〜１３および比較例１３〜１７；
スケールアップの製造実施例７の界面活性剤の種類を表５、表６および表７の
ように変更した以外は、実施例７と同様にして反応を行
った。結果を表５、表６および表７に示す。

【００４２】

【表１】

【００４３】

【表２】

【００４４】

【表３】

【００４５】

【表４】

【００４６】

【表５】

【００４７】

【表６】

【００４８】

【表７】

【００４９】なお、表中の略号は次のものを用いた。＜原料＞ＰＣ；ＰＣ−１；ナッターマン社製ホスホリポン１００
（ＰＣ９５％、ＰＳ０％、その他５％）Ｓｅｒ；Ｌ−セリン味の素（株）社製、商品名Ｌ−セリ
ンＦ、ＰＬ−Ｄ；ＰＬ−Ｄ１；旭化成工業（株）社製
ホスホリパーゼ、ＰＬ−Ｄ２；試験例１のキャベツ由来
のＰＬ−Ｄ。＜界面活性剤＞グリセリン型；ＭＯ−７５０；ＳＹグリスターＭＯ−７５０：坂本薬品
（株）社製商品名、ＳＳ−５００；ＳＹグリスターＳＳ−５００；坂本薬品
（株）社製商品名、レシチン型；Ａ−１；サンレシチンＡ：太陽化学（株）社製、商品
名、蔗糖エステル型；Ｓ−１１７０；リョートーシュガーエステルＳ−１１７
０：三菱化学（株）社製商品名。

【００５０】＜比較界面活性剤＞ＳＤＳ；ドデシル硫酸ナトリウム塩ＮＯＤＧ；ｎ−オクチル−β−Ｄ−グリコシド；シグマ
社販売、ＤＯＣ；デオキシコール酸（胆汁酸ナトリウム；和光純
薬工業社販売）、ＤＯＳＮａ；ジオクチルコハク酸ナトリウム；日本油脂
（株）ラピゾールＢ−９０を用いて精製したもの。＜緩衝液＞酢酸緩衝液；酢酸−酢酸ナトリウム；ｐＨ５．６または
ｐＨ３．２、グリシン緩衝液；グリシン−水酸化ナトリウム；ｐＨ１
１。＜乳化状態の記号＞記号；評価 ○；Ｏ／Ｗ型の乳化で外観が均一でクリーミング現象が認められない。 △；Ｏ／Ｗ型若しくはＷ／Ｏ型で分離現象が認められる。×；すぐ分離、２層に分離する。＜分析値の表示＞ＰＣ；ホスファチジルコリン、ＰＳ；ホスファチジルセリン、その他（％）＝１００−脂肪酸含量−ＰＣ含量−ＰＳ含
量なお脂肪酸含量（％）は、試料の酸価を測定し、酸の平
均分子量３０４．４を用いて計算した。

【００５１】以上の結果から、本発明の製造方法による
実施例７〜１３では、本発明の範囲外である比較例１３
〜１７に比べて反応率が高く、かつＰＳ含有量の高い製
品が多量に生産できることがわかる。即ち、比較例１
３、１４は、乳化が不十分であると反応が進まずＰＳの
生成量が少ない。また、比較例１５および１６は、請求
項の範囲の界面活性剤であるが酵素量が少なすぎるの
で、収率は高いが、反応率が低く、比較例１６はＨＬＢ
が７と請求範囲外のものであるため乳化状態が悪く、反
応率が低いことがわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１における経時的にサンプリン
グして分析した反応曲線を示す。

【００５１】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】水系で界面活性剤の存在下、リン脂質中に
含有するホスファチジルコリンとセリンとのホスホリパ
ーゼＤを用いた塩基交換反応によるホスファチジルセリ
ンの製造方法において、界面活性剤がグリセリン脂肪酸
エステル、蔗糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エス
テルおよびレシチンからなる群より選択される１種また
は２種以上で、かつ、ＨＬＢが８〜１６であることを特
徴とするホスファチジルセリンの製造方法。
【請求項２】ホスホリパーゼＤが、微生物由来のホスホ
リパーゼＤまたはキャベツ由来のホスホリパーゼＤであ
る請求項１記載のホスファチジルセリンの製造方法。
【請求項３】得られた製品中にホスファチジルセリン１
０重量％以上を含有し、原料中のホスファチジルコリン
の含量に対する反応後のホスファチジルセリンの含量の
比で示す反応率が、５０％以上で、かつ、原料に用いた
油脂分に対する得られた製品の量で示される収率が８５
％以上である請求項１または２記載のホスファチジルセ
リンの製造方法。
【請求項４】反応温度が４０〜６０℃である請求項１〜
３のいずれか１項に記載のホスファチジルセリンの製造
方法。
【請求項５】水系で界面活性剤の存在下、リン脂質中に
含有するホスファチジルコリンとセリンとのホスホリパ
ーゼＤを用いた塩基交換反応によるホスファチジルセリ
ンの製造方法において、界面活性剤がグリセリン脂肪酸
エステル、蔗糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エス
テルおよびレシチンからなる群より選択される１種また
は２種以上で、かつ、ＨＬＢが８〜１６である界面活性
剤を用い、さらに反応系中に無機塩を加えて反応と同時
に生成物を塩析することを特徴とするホスファチジルセ
リンまたはその塩の製造方法。
【請求項６】請求項１〜４のいずれか１項に記載のホス
ファチジルセリンを得た後、次いでさらに、反応液に無
機塩を加えて塩析することを特徴とするホスファチジル
セリンの製造方法。
【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項に記載のホス
ファチジルセリンの製造方法によって得られたホスファ
チジルセリンまたはホスファチジルセリンのカルシウム
塩であって、それらの純度で２０重量％以上含有するこ
とを特徴とするホスファチジルセリン含有物またはホス
ファチジルセリンのカルシウム塩の含有物。