CN103140587A - 含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物及其制造方法 - Google Patents

含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法,其包括:(a)在丝氨酸的存在下,使磷脂酶D作用于含有磷脂酰胆碱的原料,从而得到含有磷脂酰丝氨酸的组合物的工序、以及(b)在选自由下述(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下,使磷脂酶A1作用于含有磷脂酰丝氨酸的组合物,从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序,其中,(I)为选自由1价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐,(II)为树胶类,(III)为乳化剂。

Description

含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物及其制造方法
技术领域
本发明涉及含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物及其制造方法。
背景技术
在磷脂中,已知磷脂酰丝氨酸在脑中具有生理机能。作为制造磷脂酰丝氨酸的方法,已知有使磷脂酶D作用于磷脂酰胆碱从而得到磷脂酰丝氨酸的方法(专利文献1和专利文献2)。
另一方面,作为磷脂之一的溶血磷脂是指1个脂肪酸键合于甘油骨架而成的磷脂,由于溶血磷脂的分子量比一般磷脂小,可以认为其在体内的吸收性高。因此,具有溶血磷脂和磷脂酰丝氨酸这两者的结构的溶血磷脂酰丝氨酸在体内易于被吸收,可以期待其具有优异的生理活性。
在溶血磷脂中,2-酰基-溶血磷脂在甘油骨架的sn-1位不具有脂肪酸,仅在sn-2位具有脂肪酸。已知与仅sn-1位具有脂肪酸的1-酰基-溶血磷脂相比,2-酰基-溶血磷脂的界面张力、表面张力和乳化稳定性优异(例如,专利文献3)。
2-酰基-溶血磷脂通过将磷脂sn-1位的酯键水解、分离出脂肪酸而得到。作为进行sn-1位酯键的水解的酶,已知有磷脂酶A1,专利文献4中公开了使用提取自鱼类的卵巢中的磷脂酶A1,将磷脂转化为2-酰基-溶血磷脂的方法。另外,专利文献5中公开了使用由微生物产生的磷脂酶A1,将磷脂转化为2-酰基-溶血磷脂的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开平9-121879号公报
专利文献2:日本特开2002-218991号公报
专利文献3:日本特开平9-227895号公报
专利文献4:日本特开2006-197842号公报
专利文献5:日本特开2006-325485号公报
发明内容
发明要解决的问题
然而,使用磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸作为磷脂的情况下,存在以下问题:即使利用磷脂酶A1进行sn-1位的脂肪酸的水解反应,磷脂酶A1对磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的反应性也差、磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率)低。
因此,本发明的目的在于,在制造含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物时,提高利用磷脂酶A1由磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率)。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究,结果发现,通过改良磷脂酶A1的酶反应条件,磷脂酶A1对磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的反应性提高,可以提高溶血化率。
即,本发明提供一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法,其包括:(a)在丝氨酸的存在下,使磷脂酶D作用于含有磷脂酰胆碱的原料,从而得到含有磷脂酰丝氨酸的组合物的工序、以及(b)在选自由下述(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下,使磷脂酶A1作用于前述含有磷脂酰丝氨酸的组合物,从而得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序,其中,(I)为选自由1价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐,(II)为树胶(gum)类,(III)为乳化剂。
另外,本发明提供一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法,其包括:(c)在选自由下述(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下,使磷脂酶A1作用于含有磷脂酰胆碱的原料,从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物的工序、以及(d)在丝氨酸的存在下,使磷脂酶D作用于所述含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物,从而得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序,其中,(I)为选自由1价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐,(II)为树胶类,(III)为乳化剂。
根据这些方法,通过在选自(I)、(II)和(III)中的特定添加剂的存在下进行磷脂酶A1的酶反应,磷脂酶A1对磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的反应性提高,可以提高由磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率)。
优选的是,添加剂至少包含(I)、且1价阳离子的盐的浓度为0.25~2.0M。通过在盐浓度处于该范围的添加剂的存在下进行酶反应,可以进一步提高溶血化率。
另外,优选的是,添加剂至少包含(I)、且1价阳离子的硫酸盐为硫酸铵和/或硫酸钠。添加剂为硫酸铵和/或硫酸铵时,可以进一步提高溶血化率。
另外,优选的是,添加剂至少包含(II)、且树胶类为选自由黄原胶、瓜尔豆胶、罗望子胶、他拉胶、阿拉伯胶和刺槐豆胶组成的组中的一种以上。另外,优选的是,添加剂至少包含(III)、且乳化剂为选自由蔗糖脂肪酸酯系乳化剂、聚甘油脂肪酸酯系乳化剂和聚山梨酯系乳化剂组成的组中的一种以上。通过这些添加剂也可以进一步提高溶血化率。
另外,含有磷脂酰胆碱的原料优选衍生自海产品和/或衍生自植物。衍生自海产品的磷脂酰胆碱多是在sn-2位包含二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等高度不饱和脂肪酸而构成的,所得到的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸为在sn-2位键合有二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等高度不饱和脂肪酸而成的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸。另外,使用衍生自植物的磷脂酰胆碱作为原料时,可以提高溶血化率。
另外,本发明提供一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物,其中,相对于固体成分以质量基准计含有26~51%的溶血磷脂。更优选相对于固体成分以质量基准计含有37~51%的溶血磷脂。另外,含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物中的溶血磷脂相对于总磷脂的比例以质量基准计优选为40~73%,更优选为57~73%。另外,2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸优选为在sn-2位键合有高度不饱和脂肪酸的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸,该高度不饱和脂肪酸优选为二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸。二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸具有改善记忆学习能力等的生理活性,因此可以认为键合有这些脂肪酸的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸也具有同样的生理活性。这样的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物是根据上述制造方法首次得到的。
发明的效果
根据本发明的方法,在制造含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物时,可以提高利用磷脂酶A1由磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率)。
附图说明
图1是对本发明方法所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法进行说明的流程图。
具体实施方式
以下,适当参照所附的附图,对本发明的方法详细地进行说明。
图1是对本实施方式所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法进行说明的流程图。本实施方式的方法可以大致分为图1所示的途径1的方法和途径2的方法。
途径1和途径2在以下方面是共通的:它们都是使用含有磷脂酰胆碱的原料作为原料,使用磷脂酶A1(PLA1)和磷脂酶D(PLD)作为酶,得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物作为最终产物。不同点是进行PLA1和PLD的酶反应的顺序。也就是说,在途径1中,先进行PLD的酶反应(工序(a)),使PLA1对通过PLD的酶反应而生成的产物起作用(工序(b))。另外,在途径2中,先进行PLA1的酶反应(工序(c)),使PLD对通过PLA1的酶反应而生成的产物起作用(工序(d))。本说明书中只要没有特别说明,途径1和2中可以使用相同的原料,也可以使用相同的酶(PLD或PLA1)。以下,关于途径1和途径2的方法,首先从途径1的方法开始进行说明。
<关于途径1>
途径1的方法包括:(a)在丝氨酸的存在下,使PLD作用于含有磷脂酰胆碱的原料,从而得到含有磷脂酰丝氨酸的组合物的工序、以及(b)使PLA1作用于含有磷脂酰丝氨酸的组合物,从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序。
首先,对工序(a)进行说明。工序(a)中所用的含有磷脂酰胆碱的原料只要富含磷脂酰胆碱就没有特别限定。例如,可以使用作为一般的油脂制造原料而已知的大豆、菜种、亚麻、玉米、棉籽、向日葵、米胚芽、大麦、燕麦、红花等衍生自植物的原料,以及鱼油、鱼肉、鱼卵、鱼的内脏类、贝身、贝的内脏类、牛肉、牛脑、猪肉、鸡肉和蛋黄等衍生自动物的原料。进而,也可以将利用公知的方法由这些原料提取出的磷脂作为含有磷脂酰胆碱的原料而使用。原料所包含的磷脂酰胆碱优选在sn-2位键合有高度不饱和脂肪酸。作为该高度不饱和脂肪酸并没有特别限定,不饱和脂肪酸的碳原子数优选16以上,更优选18以上,进一步优选20以上。另外,不饱和脂肪酸的双键的数目优选2以上,更优选4以上,进一步优选5以上。另外,不饱和脂肪酸优选为n-3脂肪酸或n-6脂肪酸,更优选为n-3脂肪酸。具体而言,高度不饱和脂肪酸优选为二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA),更优选为DHA。作为包含具有DHA的磷脂酰胆碱的原料,例如可列举出由墨鱼、磷虾、金枪鱼、鲣鱼、鲭鱼、沙丁鱼、秋刀鱼、竹荚鱼、鲑鱼子、扇贝和贻贝等鱼类和贝类的组织提取而成的衍生自海产品的原料;由牛脑、基因重组猪和蛋黄等动物组织提取而成的原料;以及由产生DHA的海洋细菌、藻类(小球藻属等)等微生物提取而成的原料。因为墨鱼或磷虾的磷脂大量含有在sn-2位键合有DHA的磷脂酰胆碱,进一步优选衍生自墨鱼或磷虾的原料。上述原料可以单独使用或组合多种使用。
本发明的制造方法中,含有磷脂酰胆碱的原料可以溶解或悬浮于适合PLD的酶反应的溶剂后使用。作为这样的溶剂,例如可列举出氯仿、醚、水、乙酸乙酯、石油醚、己烷、四氢呋喃、吡啶、二氯甲烷和缓冲液。这些溶剂中,优选使用选自氯仿、水和醚中的至少一种。通常而言,据说在磷脂的酶反应中,醚具有活化磷脂酶的效果。然而,将目标产物用于食品用途的情况下,由于对生物体无害,进一步优选使用水。上述溶剂按照目标产物的用途等可以单独使用或适当组合多种而使用。
工序(a)中所用的磷脂酶D(PLD)对磷脂或溶血磷脂起作用,引起磷脂酰基转化反应,将键合于磷脂的磷酸基的胆碱转化为丝氨酸。PLD存在于放线菌以及圆白菜、菠菜、花生等植物中,对于本发明的制造方法,只要磷脂酰基转化反应的效率良好就没有特别限定,均可以使用。作为这样的PLD,具体而言,可列举出磷脂酶D(名糖产业公司制造)、磷脂酶D(Nagase ChemteXCorporation制造)、磷脂酶D(生化学工业公司制造)、Phospholipase D(旭化成公司制造)和PLD(BiomolInternational,Inc.制造)等。对于本发明,优选可列举出磷脂酶D(名糖产业公司制造)和Phospholipase D(旭化成公司制造)。
工序(a)中,为了在丝氨酸的存在下使PLD作用于含有磷脂酰胆碱的原料,例如,可以使含有磷脂酰胆碱的原料溶解于反应溶剂从而制作反应溶液,向该反应溶液中添加丝氨酸,向其中添加PLD。作为PLD的添加量,相对于1g含有磷脂酰胆碱的原料优选20~500单位,更优选50~200单位,进一步优选100单位。作为酶反应的反应条件并没有特别限定,例如,可以在酶的适合反应条件的范围内作用。例如,作为反应温度优选20~70℃,更优选30~50℃,进一步优选40℃。另外,例如,作为反应时间优选1~48小时,更优选8~24小时,进一步优选18小时。例如,作为反应溶剂可以从以上所说明的溶剂中选择。对于本发明,优选由水或缓冲液等水系溶剂和醚等有机溶剂构成的2层体系的反应,但在将目标产物用于食品用途的情况下,优选水或缓冲液等水系溶剂的反应体系。例如,反应pH优选pH4.5~7.0,更优选pH5.0~6.5,进一步优选pH5.5。另外,作为丝氨酸的添加量,相对于1g含有磷脂酰胆碱的原料可以优选使用0.5~2g,更优选使用0.7~1.5g,进一步优选使用1g。另外,也可以向反应溶液中加入PLD的反应活化剂。作为这样的反应活化剂,例如可列举出氯化钙。使用氯化钙作为反应活化剂的情况下,相对于1g含有磷脂酰胆碱的原料,氯化钙以氯化钙二水合物的形式,可以优选使用0.5~2g,更优选使用0.7~1.5g,进一步优选使用1g。
酶反应结束后,对反应溶液进行适当提取、浓缩、干燥等操作,可以由反应溶液得到含有磷脂酰丝氨酸的组合物。
接着,对工序(b)进行说明。本发明的(b)工序中所用的磷脂酶A1(PLA1)对磷脂起作用,水解磷脂sn-1位的酯键并使键合于sn-1位的脂肪酸游离,从而生成2-酰基-溶血磷脂。PLA1存在于动物的胰脏和肝脏、鱼类的卵巢、微生物等,对于本发明的制造方法,只要是水解sn-2位的酯键并使脂肪酸游离的情况较少、且能够以高收率得到2-酰基-溶血磷脂就没有特别限定,均可以使用。作为这样的PLA1,具体而言,可列举出Aspergillus属、Pseudomonas属、Shewanella属、Pseudoalteromonas属、Vibrio属和Serratia属微生物产生的PLA1,以及由鲣鱼、金枪鱼、鲭鱼、鲑鱼、鳟鱼和鳕鱼等鱼类的卵巢提取而成的PLA1。优选磷脂酶A1(三菱化学公司制造)、Lecitase Ultra(注册商标,Novozymes.Co.Ltd.制造)、Lecitase Novo(注册商标,Novozymes.Co.Ltd.制造)以及日本特开2006-325485号中记载的可以由Pseudomonas sp.(HFKI0020株)培养上清得到的PLA1等。
若相对于磷脂过量添加PLA1,则不仅磷脂中的sn-1位的酯键会水解,连sn-2位的脂肪酸的酯键也会水解,存在目标2-酰基-溶血磷脂的收量降低的可能,因此作为PLA1的添加量,相对于1g含有磷脂酰丝氨酸的组合物优选20~500单位,更优选50~200单位,进一步优选100单位。
工序(b)中,对于本发明的方法,通过在选自由下述的(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下,使PLA1作用,可以提高利用PLA1由磷脂转化为2-酰基-溶血磷脂的比例(溶血化率)。(I)为选自由1价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐,(II)为树胶类,(III)为乳化剂。
添加剂(I)为选自由1价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐,因为溶血化率变得更高,这些盐中特别优选1价阳离子的硫酸盐。1价阳离子的硫酸盐中,因为溶血化率进一步变高,添加剂(I)优选硫酸铵和/或硫酸钠。例如,使用硫酸铵作为添加剂(I)时,优选的是,硫酸铵在反应体系中的浓度优选约0.25~2.0M,更优选约1M。另外,例如,使用硫酸钠作为添加剂(I)时,优选的是,硫酸钠在反应体系中的浓度优选约0.25~2.0M,更优选约0.75M。通过加入这样高浓度的盐类,可以极大提高溶血化率。
添加剂(II)为树胶类。作为这样的树胶类,因为溶血化率变得更高,优选选自由黄原胶、瓜尔豆胶、罗望子胶、他拉胶、阿拉伯胶、刺槐豆胶组成的组中的一种以上。另外,若并用添加剂(I)和添加剂(II),与单独使用添加剂(I)或(II)的情况相比,可以进一步提高溶血化率,因此优选并用添加剂(I)和添加剂(II)。作为与添加剂(II)并用的添加剂(I),优选硫酸盐,更优选硫酸钠或硫酸铵。另外,作为并用的添加剂(II),优选阿拉伯胶。
添加剂(III)为乳化剂。作为这样的乳化剂,因为溶血化率变得更高,优选选自由蔗糖脂肪酸酯系乳化剂、聚甘油脂肪酸酯系乳化剂和聚山梨酯系乳化剂组成的组中的一种以上。另外,这些乳化剂优选HLB(亲水亲油平衡,Hydrophile-LipophileBalance)值为10以上。另外,若并用添加剂(I)和添加剂(III),与单独使用添加剂(I)或(III)的情况相比,可以进一步提高溶血化率,因此优选并用添加剂(I)和添加剂(III)。作为与添加剂(III)并用的添加剂(I),优选硫酸盐,更优选硫酸钠或硫酸铵。另外,作为并用的添加剂(III),优选聚甘油脂肪酸酯系乳化剂或聚山梨酯系乳化剂。
工序(b)中,为了在选自由(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下使PLA1作用于含有磷脂酰丝氨酸的组合物,例如,可以使(a)中所得到的含有磷脂酰丝氨酸的组合物溶解于反应溶剂从而制作反应溶液,向该反应溶液中添加上述添加剂,向其中添加PLA1。作为酶反应的反应条件并没有特别限定,例如,可以在酶的适合反应条件的范围内作用。例如,作为反应温度优选10~50℃,更优选30~50℃。关于反应时间,2-酰基-溶血磷脂产量随反应时间的延长而增加,若超过适宜的反应时间,则PLA1不仅会水解磷脂的sn-1位的酯键,还会引起sn-2位的酯键的水解,导致目标2-酰基-溶血磷脂的收率下降,因此优选在适宜的反应时间内使PLA1作用。适宜的反应时间是指1~24小时,更优选1~4小时。例如,作为反应溶剂可列举出由醚或乙酸乙酯等有机溶剂和水等水系溶剂构成的2层体系,或者水等水系溶剂的反应体系。特别优选使用醚作为溶剂,但在将目标产物用于食品用途的情况下,优选水等水系溶剂的反应体系。例如,反应pH优选pH4~8,更优选pH4.5~6.5,进一步优选pH6.5。
酶反应结束后,对反应溶液进行适当提取、浓缩、干燥等操作,可以由反应溶液得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物。
<关于途径2的方法>
接着,对途径2的方法进行说明。途径2的方法包括:(c)使磷脂酶A1(PLA1)作用于含有磷脂酰胆碱的原料,从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物的工序、以及(d)在丝氨酸的存在下,使磷脂酶D(PLD)作用于含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物,得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序。
工序(c)是利用PLA1由磷脂得到2-酰基-溶血磷脂的工序,可以使用与工序(b)相同的反应条件。也就是说,对于本发明的方法,在工序(c)中,通过在选自由(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下,使PLA1起作用,可以提高将磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率)。PLA1可以使用工序(b)的说明中所列举出的物质,添加剂(I)、(II)和(III)分别为工序(b)的说明中所列举出的添加剂(I)、(II)和(III)。另外,含有磷脂酰胆碱的原料可以使用工序(a)的说明中所列举出的原料。酶反应结束后,对反应溶液进行适当提取、浓缩、干燥等操作,可以由反应溶液得到含2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物。
工序(d)是将工序(c)中所得到的2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的磷酸基所键合的胆碱通过PLD的作用转化为丝氨酸的工序,可以使用与工序(a)相同的反应条件。例如,PLD、丝氨酸和反应活化剂可以分别使用工序(a)的说明中所列举出的物质。酶反应结束后,对反应溶液进行适当提取、浓缩、干燥等操作,可以由反应溶液得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物。
根据本发明的方法,使用途径1或途径2的任意方法,均可以提高PLA1对磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的反应性,可以提高磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率),以高收益得到目标2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸。需要说明的是,本说明书中的“溶血化率”可以根据实施例所记载的方法来决定。
本发明的方法中,为了得到含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物,可以使用途径1或途径2的任意方法。
<关于2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸>
根据上述方法而得到的含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物优选相对于固体成分的溶血磷脂含量较高。因为在脂质中溶血磷脂也具有优异的生理活性机能。例如,相对于固体成分以质量基准计含有26~51%的溶血磷脂,更优选含有37~51%。另外,优选组合物中的溶血磷脂相对于总磷脂的比例较高。例如,溶血磷脂相对于总磷脂的比例以质量基准计优选为40~73%,更优选为57~73%。需要说明的是,上述“溶血磷脂相对于总磷脂的比例”可以用(溶血磷脂的含量)/(总磷脂的含量)×100%来决定。“总磷脂的含量”和“溶血磷脂的含量”分别可以根据实施例所记载的方法来决定。
进而,组合物中所包含的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸优选包含具有特定生理活性机能的脂肪酸。作为这样的具有特定生理活性机能的脂肪酸,可列举出高度不饱和脂肪酸。高度不饱和脂肪酸作为体内的生理活性物质而发挥作用。高度不饱和脂肪酸更优选二十二碳六烯酸(DHA)和/或二十碳五烯酸(EPA)。已知这些高度不饱和脂肪酸各自具有改善记忆学习能力等的生理活性机能。这些高度不饱和脂肪酸中优选DHA。DHA多含于鱼类和贝类等海产品中,是生理活性机能特别优异的高度不饱和脂肪酸。
根据本发明的方法而提供的组合物所包含的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸等溶血磷脂作为生理活性物质而发挥作用。因此,配混根据本发明的方法所得到的组合物,可以提供赋予了生理活性机能的食品饮料和药品。该情况下,根据本发明的方法所得到的上述组合物的溶血磷脂在组合物中的含量较高,因此即使组合物的配混量为少量也可以得到较高效果。另外,DHA、EPA等高度不饱和脂肪酸键合于组合物中所包含的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的sn-2位时,可以提供赋予了改善记忆学习能力等优异的生理活性机能的食品饮料和药品。
实施例
以下,举出实施例来具体说明本发明,但本发明不受这些实施例的限定。需要说明的是,实施例中若无特别说明,则“%”表示“w/v%”。
以下所记载的总磷脂含量、溶血磷脂含量和溶血化率的分析方法是根据以下测定方法而得到的值。
1.<总磷脂含量的分析方法>
总磷脂含量根据以下方法来决定。
(A):试样溶液的测定波长为500nm下的吸光度
(B):总磷脂标准液的测定波长为500nm下的吸光度
总磷脂含量(质量%)=(A)/(B)×100(质量%)
将使试样溶解于盐酸甲醇并使其成为20mg/mL而成的溶液在65℃下加热30分钟。返回至室温后,向溶液中加入等量的水,接着加入等量的己烷,充分搅拌混合。将溶液离心分离(3000转,5分钟)后,将10μL溶液的下层添加至1.0mL下述组成的总磷脂分析用酶显色试剂中。使该溶液在37℃下显色20分钟后,对测定波长为500nm下的吸光度(A)进行测定。
总磷脂分析用酶显色试剂的组成:
Figure BDA00002998954300131
另一方面,将总磷脂标准液(使AVT公司制造的蛋黄磷脂酰胆碱溶解于盐酸甲醇并使其成为20mg/mL而成的溶液)作为试样,进行与上述相同的操作,测定吸光度(B)。总磷脂含量根据(A)/(B)×100(质量%)来求出。
2.<溶血磷脂含量的分析方法>
溶血磷脂含量根据以下方法来决定。
(C):试样溶液的测定波长为500nm下的吸光度
(D):溶血磷脂标准液的测定波长为500nm下的吸光度
溶血磷脂含量(质量%)=(C)/(D)×100(质量%)
将10μL使试样溶解于2%TritonX100并使其成为10mg/mL而成的溶液添加至1.0mL下述组成的溶血磷脂分析用酶显色试剂中,在37℃下反应20分钟后,对测定波长为500nm下的吸光度(C)进行测定。
另一方面,将溶血磷脂标准液(使AVT公司制造的蛋黄磷脂酰胆碱溶解于2%TritonX100并使其成为10mg/mL而成的溶液)作为试样,进行与上述相同的操作,测定吸光度(D)。溶血磷脂含量根据(C)/(D)×100(质量%)来求出。
溶血磷脂分析用酶显色试剂的组成:
0.1M Tris-HCl(pH8.0)
0.2% TritonX100
10mM 氯化钙
0.1% 苯酚
0.1% 4-氨基安替吡啉
4U/mL 溶血磷脂酶
0.2U/mL 甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶
5U/mL 甘油磷酸氧化酶
10U/mL 过氧化物酶
3.<溶血化率的分析方法>
溶血化率根据以下方法来决定。
(E):PLA1反应后的溶液的溶血磷脂的测定波长为500nm下的吸光度
(F):原料中的总磷脂的测定波长为500nm下的吸光度
溶血化率(摩尔%)=(E)/(F)×100(摩尔%)
向1.0mL溶解5%试样磷脂而成的0.1M乙酸缓冲液(pH5.5)中添加5μL磷脂酶A1(1000单位/mL)水溶液,在40℃下搅拌4小时,进行溶血化反应。反应后,加入1.0mL的己烷,进行磷脂的提取。提取10μL己烷相,在减压下去除己烷。向其中添加1.0mL上述溶血磷脂分析用酶显色试剂,在37℃下进行20分钟反应,对测定波长为500nm下的吸光度(E)进行测定。吸光度(E)与溶血磷脂的摩尔浓度成比例。
另一方面,将500μL所述己烷相转移至试管中,在减压下蒸馏去除己烷。向其中添加0.75mL盐酸甲醇,在65℃下进行30分钟反应。返回至室温后,加入0.75mL水,接着加入0.75mL己烷,提取脂质成分。将30μL下层添加至1.0mL上述总磷脂分析用酶显色试剂中,在37℃下显色20分钟后,对测定波长为500nm下的吸光度(F)进行测定。吸光度(F)与总磷脂的摩尔浓度成比例。溶血化率根据(E)/(F)×100(摩尔%)来求出。
[实施例1]
<磷脂酰丝氨酸的制备>
向对100g磷虾油进行丙酮处理而得到的磷脂(磷虾磷脂酰胆碱)50g中加入450mL纯化水并搅拌。向其中依次添加1M乙酸缓冲液(pH5.5)80mL、氯化钙35g、丝氨酸68g后使其溶解。向该溶液中追加200mL纯化水后,添加5000单位磷脂酶D(名糖产业公司制造),边在40℃下搅拌18小时边进行反应。向该反应液中添加800mL己烷,在室温下进行30分钟提取。收集己烷相后用旋转蒸发仪进行减压干固,得到42g含有磷脂酰丝氨酸(磷虾磷脂酰丝氨酸)的固体物质。
[实施例2]
<硫酸盐对PLA1引起的酶反应的影响>
向由0.1M乙酸缓冲液(pH5.5)、5%的阿拉伯胶或未添加阿拉伯胶、5%的实施例1中制备的含有磷脂酰丝氨酸的固体物质和1M的各种盐类制备而成的反应液1.0mL中添加5μL磷脂酶A1(1000单位/mL)水溶液,在40℃下搅拌4小时,进行酶反应。反应结束后,按照上述3.<溶血化率的分析方法>测定溶血化率。结果示于表1。在未添加阿拉伯胶的情况下,在硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、硝酸钠(NaNO3)、柠檬酸三钠(Na3-Citrate)、酒石酸二钠(Na2-Tartarate)的存在下溶血化率也高,可以确认到这些盐对PLA1引起的酶反应的促进效果。在添加了阿拉伯胶的情况下,特别是在硫酸铵和硫酸钠的存在下溶血化率变得更高,可以确认到优异的酶反应促进效果。
[表1]
Figure BDA00002998954300161
<硫酸盐的盐浓度对PLA1引起的溶血化反应的影响>
针对酶反应促进效果较高的硫酸铵和硫酸钠,对于盐浓度对溶血化率的影响进行研究。硫酸铵或硫酸钠以表2所示盐浓度、在与5%阿拉伯胶共存下进行PLA1引起的酶反应。结果示于表2。浓度在0.75~1.0M附近时,硫酸铵和硫酸钠都会有最大的酶反应促进效果。
[表2]
Figure BDA00002998954300171
[实施例3]
<树胶类对PLA1引起的酶反应的影响>
研究在未添加硫酸盐或硫酸盐存在下的、各种树胶类对溶血化率的影响。向由0.1M乙酸缓冲液(pH5.5)、1M的硫酸钠或未添加硫酸钠、5%的实施例1中制备的含有磷脂酰丝氨酸的固体物质和表3所示浓度的树胶类制备而成的反应液1.0mL中添加5μL磷脂酶A1(1000单位/mL)水溶液,在40℃下搅拌4小时,进行酶反应。反应结束后,按照上述3.<溶血化率的分析方法>测定溶血化率。如表3所示,可以看到黄原胶、瓜尔豆胶、罗望子胶、他拉胶、阿拉伯胶、刺槐豆胶等对酶反应的促进效果,在与硫酸盐共存下可以确认到更高的酶反应促进效果。
[表3]
Figure BDA00002998954300181
[实施例4]
<乳化剂对PLA1引起的酶反应的影响>
研究在未添加硫酸盐及硫酸盐的存在下的、各种乳化剂对溶血化率的影响。向由0.1M乙酸缓冲液(pH5.5)、1M的硫酸钠或未添加硫酸钠、5%的实施例1中制备的含有磷脂酰丝氨酸的固体物质和表4所示浓度的乳化剂制备而成的反应液1.0mL中添加5μL磷脂酶A1(1000单位/mL)水溶液,在40℃下搅拌4小时,进行酶反应。反应结束后,按照上述3.<溶血化率的分析方法>测定溶血化率。如表4所示,可以看到蔗糖脂肪酸酯系、聚甘油脂肪酸酯系、聚山梨酯系乳化剂对酶反应的促进效果,在与硫酸盐共存下能够得到更进一步的酶反应促进效果。
[表4]
Figure BDA00002998954300191
※对于在乙醇-水中分散的乳化剂,在表的浓度为“1%”的情况下,调整为乳化剂在反应液中成为1%的量来添加。
[实施例5]
<添加剂对各种磷脂的效果>
作为磷脂,使用实施例1中得到的磷虾磷脂酰丝氨酸和磷虾磷脂酰胆碱、基于实施例1制备而成的墨鱼磷脂酰丝氨酸和墨鱼磷脂酰胆碱以及大豆磷脂(磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的混合物)的各种磷脂,在硫酸铵和阿拉伯胶的存在下,进行PLA1引起的酶反应。需要说明的是,以磷虾磷脂酰胆碱和墨鱼磷脂酰胆碱作为原料的反应对应途径2。测定各反应产物的溶血化率。结果如表5所示,无论是衍生自含有丝氨酸的磷脂和衍生自含有胆碱的磷脂,都可以确认到添加剂对酶反应的促进效果。
[表5]
Figure BDA00002998954300201
[实施例6]
<溶血磷脂酰丝氨酸的制备和含量分析>
使42g实施例1中得到的含磷脂酰丝氨酸的固体物质溶解于800mL含有0.1M乙酸缓冲液(pH5.5)、1M硫酸铵、5%的阿拉伯胶的溶液中后,添加4000单位的PLA1(三菱化学公司制造),边在40℃下搅拌4小时边进行溶血化反应。向该反应液中添加800mL己烷,进行提取。回收己烷相并用旋转蒸发仪进行减压干固后,进行丙酮沉淀处理。将所得到的固体成分溶解于少量己烷后,用旋转蒸发仪进行减压干固,得到19g含有溶血磷脂酰丝氨酸的脂质。根据上述2.<溶血磷脂含量的分析方法>分析该脂质的溶血磷脂含量,结果为51.1质量%。进而根据1.<总磷脂含量的分析方法>测定总磷脂含量,结果为69.8质量%。因此,总磷脂中溶血磷脂所占的比例为73.2质量%。
[实施例7]
<各条件下的含量分析>
对在实施例2~6的各种条件下得到的反应产物中的总磷脂含量利用上述1.<总磷脂含量的分析方法>进行分析的结果、对溶血磷脂含量根据上述2.<溶血磷脂含量的分析方法>进行分析的结果,由以上两个值算出的总磷脂中溶血磷脂所占的比例示于表6。
[表6]
Figure BDA00002998954300211
[实施例8]
<DHA含量的分析>
实施例5中,对于墨鱼磷脂酰丝氨酸的脂肪酸部分、以及在1M硫酸铵和5%阿拉伯胶的存在下使PLA1作用于墨鱼磷脂酰丝氨酸而得到的含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的脂肪酸部分,利用气相色谱进行脂肪酸组成的分析。如表7所示,与PLA1引起的酶反应前的磷脂酰丝氨酸相比,酶反应后所生成的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的二十二碳六烯酸(DHA)被浓缩。
[表7]
Figure BDA00002998954300212

Claims (15)

1.一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法,其包括:
(a)在丝氨酸的存在下,使磷脂酶D作用于含有磷脂酰胆碱的原料,从而得到含有磷脂酰丝氨酸的组合物的工序、以及
(b)在选自由下述(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下,使磷脂酶A1作用于所述含有磷脂酰丝氨酸的组合物,从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序,其中,
(I)为选自由1价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐,
(II)为树胶类,
(III)为乳化剂。
2.一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法,其包括:
(c)在选自由下述(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下,使磷脂酶A1作用于含有磷脂酰胆碱的原料,从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物的工序、以及
(d)在丝氨酸的存在下,使磷脂酶D作用于所述含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物,从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序,其中,
(I)为选自由1价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐,
(II)为树胶类,
(III)为乳化剂。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法,其中,所述添加剂至少包含所述(I),所述1价阳离子的盐的浓度为0.25~2.0M。
4.根据权利要求1~3中的任一项所述的制造方法,其中,所述添加剂至少包含所述(I),所述1价阳离子的硫酸盐为硫酸铵和/或硫酸钠。
5.根据权利要求1~4中的任一项所述的制造方法,其中,所述添加剂至少包含所述(II),所述树胶类为选自由黄原胶、瓜尔豆胶、罗望子胶、他拉胶、阿拉伯胶和刺槐豆胶组成的组中的一种以上。
6.根据权利要求1~5中的任一项所述的制造方法,其中,所述添加剂至少包含所述(III),所述乳化剂为选自由蔗糖脂肪酸酯系乳化剂、聚甘油脂肪酸酯系乳化剂和聚山梨酯系乳化剂组成的组中的一种以上。
7.根据权利要求1~6中的任一项所述的制造方法,其中,所述含有磷脂酰胆碱的原料衍生自海产品和/或衍生自植物。
8.根据权利要求1~6中的任一项所述的制造方法,其中,所述含有磷脂酰胆碱的原料衍生自海产品。
9.一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物,其中,相对于固体成分以质量基准计含有26~51%的溶血磷脂。
10.根据权利要求9所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物,其中,相对于固体成分以质量基准计含有37~51%的溶血磷脂。
11.根据权利要求9或10所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物,其中,所述含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物中的溶血磷脂相对于总磷脂的比例以质量基准计为40~73%。
12.根据权利要求11所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物,其中,所述含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物中的溶血磷脂相对于总磷脂的比例以质量基准计为57~73%。
13.根据权利要求9~12中的任一项所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物,其中,所述2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸为sn-2位键合有高度不饱和脂肪酸的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸。
14.根据权利要求13所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物,其中,所述高度不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸。
15.根据权利要求9~14中的任一项所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物,其通过权利要求1~8中的任一项所述的方法得到。
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