KR20230148659A - 펩신 소화율이 우수한 고단백 미세조류 바이오매스, 배양 방법 및 이의 용도 - Google Patents

펩신 소화율이 우수한 고단백 미세조류 바이오매스, 배양 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 펩신 소화율이 우수한 고단백 미세조류 바이오매스, 배양 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서 제시하는 조성물은 단순히 단백질 함량만 높은 것이 아니라, 어분과 유사하게 유용 지방산인 오메가-3 지방산까지 함유되어 있어 사료 배합 시 어분을 직접적으로 대체할 수 있다. 나아가, 본 발명에서 제시하는 고단백 미세조류 바이오매스는 펩신 소화율 분석법으로 분석한 결과, 70% 이상의 높은 펩신 소화율을 나타내므로, 사료 내 배합 비율이 높아지더라도 전체 소화율에 부정적인 영향을 미치지 않으며, 미세조류를 기반으로 생산되는 단백질원이기 때문에 환경오염의 문제점이 없고, 외부 환경의 영향을 최소화하여 안정적으로 생산이 가능하다는 장점이 있다.

Description

펩신 소화율이 우수한 고단백 미세조류 바이오매스, 배양 방법 및 이의 용도{Microalgal biomass containing high protein with excellent pepsin digestibility, culturing method and use thereof}
본 발명은 펩신 소화율이 우수한 고단백 미세조류 바이오매스, 배양 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
어분(Fishmeal)은 양어 사료뿐만 아니라 다양한 축종의 사료에 폭넓게 사용되고 있는 단백원이다. 그러나, 최근 어획량 규제, 중금속 및 미세플라스틱 문제와 같은 환경오염 문제점이 제기됨에 따라 어분을 대체할 수 있는 새로운 단백질원의 개발이 요구되고 있다.
또한, 최근에는 양어 사료 분야에서 제기되는 FIFO(Fish in/Fish out) ratio를 줄이려고 하는 추세이며, 이와 더불어 정부 정책이나 기후에 따라 어획량이 달라지기 때문에 지속가능성 측면에서 개선된 단백질원에 대한 수요가 증가하고 있다.
현재까지 다양한 신규 단백질 원이 어분의 대체재로 제시되어 왔으나, 어분에 포함된 유효 물질인 오메가-3 지방산 등을 대체하지 못한다는 문제점이 있었다. 또한, 현재까지 제시된 녹조류 기반의 전체 세포 형태(whole cell type)의 단백질은 소화율이 크게 떨어져 사료 배합 비율 상 많은 비율이 포함되기에는 현실적으로 어렵다는 문제점이 있다. 이와 관련하여 한국 등록 특허 제1564829호는 미세조류 부산물을 함유하는 어류 양식용 배합사료 조성물에 대해 개시하고 있다.
이에, 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 트라우스토키트리드 (Thraustochytrid) 계열의 미세조류 발효를 통하여 생산된 유용 지방산인 오메가-3 지방산을 포함하는 새로운 단백질원을 개발하였다. 나아가, 펩신의 소화율이 우수한 조성물을 찾아내어, 지속 가능하며, 환경 친화적인 새로운 단백질원을 제시한다.
본 출원의 일 예는 바이오매스 건조 중량 대비 46% 이상의 총 아미노산을 포함하는 펩신 소화율이 우수한 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류 유래 바이오매스를 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스를 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 다른 예는 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류를 배양액 내의 잔류 탄소원 농도가 총 배양액 대비 6% 이하에서 유지되는 조건에서 배양하는 단계; 를 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류의 배양방법을 제공한다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 일 예는 바이오매스 건조 중량 대비 46 중량% 이상의 총 아미노산을 포함하는 펩신 소화율이 우수한 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류 유래 바이오매스를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "트라우스토키트리드(Thraustochytrid)"는 트라우스토키트리알레스 (Thraustochytriales) 목의 미세조류를 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.)"은 트라우스토키트리알레스 목의 트라우스토키트리아세애 (Thraustochytriaceae) 과에 속하는 속명 중 하나로, 용어 "스키조키트리움 속 (genus Schizochytrium)"과 혼용될 수 있다. 또한, 상기 용어 "미세조류(microalgae)"는 육안으로 볼 수 없어 현미경을 통해서만 볼 수 있는 수준의 작은 조류이며, 물 속에서 자유로이 부유하여 살아가는 생물을 의미한다. 상기 미세조류에는 다양한 종류가 있으며, 광합성이 불가능하여 종속영양으로만 생장하는 균주까지 포함한다.
상기 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류는 기탁번호 KCTC14345BP로 기탁된 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 CD01-5004 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오매스(biomass)"는 화학적 에너지로 사용 가능한 식물, 동물, 미생물 등의 생물체, 즉 바이오에너지의 에너지원을 의미하며, 생태학적으로 단위 시간 및 공간 내에 존재하는 특정 생물체의 중량 또는 에너지량을 의미하기도 한다. 또한, 상기 바이오매스는 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 세포 외 물질뿐만 아니라 세포 및/또는 세포 내 내용물을 함유하는 것일 수 있다. 본 출원에서 상기 바이오매스는 스키조키트리움 속 미세조류 그 자체, 이의 배양물, 이의 건조물, 이의 파쇄물, 또는 상기 미세조류를 배양하거나 발효하여 생산된 산물일 수 있으며, 또는 상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류의 "배양물"은 상기 미세조류를 배양하여 생성된 산물을 지칭하는 것으로, 구체적으로 미세조류를 포함하는 배양액 또는 상기 배양액에서 미세조류가 제거된 배양여액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 스키조키트리움 속 미세조류 배양물의 "건조물"은 상기 미세조류 배양물에서 수분이 제거된 것으로, 예를 들어 상기 미세조류의 건조 균체 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 건조물의 "파쇄물"은 상기 미세조류 배양물에서 수분이 제거된 건조물을 파쇄한 결과물을 총칭하는 것으로, 예를 들어 건조 균체 분말일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 스키조키트리움 속 미세조류의 배양물은 미세조류 배양 배지에 상기 미세조류를 접종하고, 당업계에 공지된 배양 방법에 따라 제조될 수 있고, 상기 배양물의 건조물 및 이의 파쇄물 역시 당업계에 공지된 미세조류 또는 배양액의 처리 또는 건조 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 바이오매스 건조 중량을 기준으로 46 중량% 이상, 48 중량% 이상, 49 중량% 이상, 50 중량% 이상, 또는 52 중량% 이상, 46 내지 60 중량%, 46 내지 55 중량%, 46 내지 53 중량%, 48 내지 53 중량%, 50 내지 55 중량%, 52 내지 55 중량%, 52 내지 53 중량%, 52.5 내지 55 중량% 또는 52.5 내지 53 중량%의 총 아미노산을 포함하는 것일 수 있고, 상한값은 80 중량% 이하, 75 중량% 이하, 70 중량% 이하, 또는 65 중량% 이하일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 바이오매스 건조 중량을 기준으로 60 중량% 이상, 64 중량% 이상, 67 중량% 이상, 또는 70 중량% 이상, 60 내지 85 중량%, 60 내지 80 중량%, 64 내지 80 중량%, 64 내지 78 중량%, 67 내지 80 중량%, 67 내지 78 중량%, 67 내지 75 중량%, 67 내지 70 중량%, 69 내지 80 중량%, 69 내지 78 중량%, 65 내지 70 중량% 또는 69 내지 70 중량%의 조단백을 포함하는 것일 수 있고, 상한값은 85 중량% 이하, 80 중량% 이하, 78 중량% 이하일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 바이오매스 건조 중량을 기준으로 5 중량% 이상, 7 중량% 이상, 9 중량% 이상, 10 중량% 이상, 14 중량% 이상, 20 중량% 이상, 1 내지 20 중량%, 4 내지 23 중량%, 9 내지 25 중량%, 9 내지 23 중량%, 5 내지 18 중량%, 10 내지 18 중량%, 10 내지 15 중량%, 12 내지 18 중량%, 12 내지 15 중량% 또는 13 내지 15 중량%의 조지방을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “조단백”은 “조단백질”과 혼용되어 사용될 수 있으며, 식품 및 사료의 일반분석에서 전체 질소를 측정하고, 이것에 6.25 (단백질의 평균적 질소함량의 역수, 1/0.16)를 곱하여 구하는 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “조지방”은 식품 및 사료의 일반분석에서 속슬렛 추출기를 이용하여 에테르로 추출되는 성분을 의미하고, “조지방 함량”은 “조지방량” 또는 “총 지질” 또는 “총 지방산”과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "도코사헥사엔산 (docosahexaenoic acid: DHA)"은 C22H32O2의 화학식을 갖는 다중불포화지방산 중 하나로, 알파-리놀렌산(α-linolenic acid: ALA) 및 에이코사펜타엔산 (eicosapentaenoic acid: EPA)과 함께 오메가-3 지방산에 해당하며, 관용명은 세르본산 (cervonic acid)이고, 약칭으로 22:6 n-3으로도 표기될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "에이코사펜타엔산 (eicosapentaenoic acid: EPA)"은 C20H30O2의 화학식을 갖는 다중불포화지방산 중 하나로, ALA 및 DHA와 함께 오메가-3 지방산에 해당하며, 약칭으로 20:5 n-3으로도 표기될 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 총 조지방 함량을 기준으로 39 중량% 이상, 40 중량% 이상, 41 중량% 이상, 45 중량% 이상, 49 중량% 이상, 50 중량% 이상, 39 내지 60 중량%, 39 내지 55 중량%, 39 내지 50 중량%, 42 내지 55 중량%, 42 내지 50 중량%, 43 내지 55 중량%, 43 내지 50 중량%, 45 내지 50 중량%, 47 내지 50 중량% 또는 49 내지 50 중량%의 도코사헥사엔산 (DHA)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 총 조지방 함량을 기준으로 0.5 중량% 이상, 1.0 중량% 이상, 1.5 중량% 이상, 2.0 중량% 이상, 2.1 중량% 이상, 3.5 중량% 이상, 0.5 중량% 내지 15.0 중량%, 0.5 중량% 내지 10.0 중량%, 0.5 중량% 내지 5.0 중량%, 0.5 중량% 내지 3.0 중량%, 1.0 중량% 내지 3.0 중량%, 1.9 중량% 내지 3.0 중량%, 1.9 중량% 내지 2.5 중량% 또는 1.9 중량% 내지 2.2 중량%의 에이코사펜타엔산 (EPA)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 총 조지방 함량을 기준으로 41 중량% 이상, 42 중량% 이상, 50 중량% 이상, 42 내지 55 중량%, 42 내지 52 중량%, 43 내지 55 중량%, 43 내지 52 중량%, 49 내지 55 중량% 또는 49 내지 52 중량%의 오메가-3 지방산을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 펩신 소화율이 68.7% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 73% 이상, 75% 이상, 77% 이상, 80% 이상, 83% 이상, 89% 이상, 69% 내지 95%, 69% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 90%, 73% 내지 95%, 또는 73% 내지 90%, 75% 내지 95%, 75% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 90%, 87% 내지 95%, 87% 내지 90%, 89% 내지 95% 또는 89% 내지 90%일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “펩신 소화율”은 동물성 단백질 원료의 품질 분석에 사용되는 것으로, 동물의 위에서 추출한 펩신을 이용하여 일정한 환경에서 얼마나 소화가 이루어졌는가를 비교할 수 있는 지표를 의미한다.
상기 바이오매스는 일 양상에 따른 스키조키트리움 속 미세조류의 배양방법에 의해 배양되는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 바이오매스 건조 중량 대비 46 중량% 이상의 총 아미노산을 포함하는 펩신 소화율이 우수한 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류 유래 바이오매스를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 펩신 소화율이 우수한 것을 특징으로 하는 것일 수 있으며, 식품 및/또는 사료 제조에 사용될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 바이오매스 건조 중량 대비 46 중량% 이상의 총 아미노산을 포함하는 펩신 소화율이 우수한 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류 유래 바이오매스를 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사료 조성물"은 동물에게 급여되는 먹이를 지칭한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명을 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 말한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는 필요한 영양성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조 가능하며, 구체적으로는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사료 첨가제"는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 포함한다. 본 출원의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 바이오매스 건조 중량 대비 46 중량% 이상의 총 아미노산을 포함하는 펩신 소화율이 우수한 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류 유래 바이오매스를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "식품 조성물"은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함하며, 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 출원의 조성물은 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물은 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 조성물을 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
본 출원의 조성물은, 예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 동결보호제, 또는 부형제 등을 함유할 수 있다. 상기 동결보호제는, 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 보존제, 안정화제, 또는 부형제는 상기 조성물에 포함되는 스키조키트리움 속 미세조류의 저하 (deterioration)를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다. 또한, 상기 동결보호제는 상기 조성물이 건조된 상태일 때 조성물에 포함되는 스키조키트리움 속 미세조류의 저하를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다.
상기 조성물은 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 출원의 조성물은 포유류, 조류, 어류, 갑각류, 두족류, 파충류 및 양서류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 포유류는 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물, 또는 애완 동물 등을 포함할 수 있고, 상기 조류는 가금류를 포함할 수 있고, 상기 가금류는 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 또는 메추라기 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 어류는 상업적 축양 어류 및 이의 치어류, 관상어 등을 포함할 수 있고, 상기 갑각류는 새우, 따개비 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 동물성 플랑크톤인 로티퍼(rotifer)의 식이에도 적용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류를 배양액 내의 잔류 탄소원 농도가 총 배양액 대비 6% 이하에서 유지되는 조건에서 배양하는 단계; 를 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류의 배양방법을 제공한다.
상기 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류는 기탁번호 KCTC14345BP로 기탁된 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 CD01-5004 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "배양"은 상기 미세조류를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미세조류에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “배양액”은 미세조류를 배양하는 배지를 의미할 수 있으며, 미세조류를 배양하는 배지에 미세조류 및/또는 미세조류가 생산하는 산물을 더 포함하는 것을 의미할 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 배양 조건은 구체적으로, 배양액 내의 잔류 탄소원 농도가 총 배양액 대비 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 또는 2% 이하에서 유지되는 조건에서 수행될 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 스키조키트리움 속 미세조류의 배양은 종속영양 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "종속영양"은 에너지원 또는 영양원을 체외에서 얻어낸 유기물에 의존하는 영양 방식으로, 독립영양에 대응되는 용어이며, 용어 '암배양'과 혼용될 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본 출원의 미세조류의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미세조류의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 미세조류를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 5 내지 8)를 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지는 MJW01배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에 포함되는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 말토오스, 갈락토오스, 만노오스, 수크로오스, 아라비노오스, 자일로오스 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 글루코오스 (glucose), 프럭토오스 (fructose) 및 수크로오스 (sucrose)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에 포함되는 질소원은 요소 (urea), 암모니아수, 황산 암모늄 (ammonium sulfate, (NH4)2SO4), 효모 추출물, 펩톤 (peptone), 질산 나트륨 (sodium nitrate, NaNO3)으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 미세조류를 배양하는데 사용되는 질소원이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에, 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유염 등을 개별적으로 포함하거나 또는 혼합하여 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지는 효모 추출물 0.01 내지 5 g/L, KH2PO4 1.0 내지 3.0 g/L, K2HPO4 5 내지 20 g/L를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 배양온도는 20 내지 45℃ 또는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 70시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 방법은 배양액 내의 잔류 탄소원의 농도를 총 배양액 대비 최대 6% 이하 범위에서 유지되도록 공급하여 미세조류 바이오매스 건조 중량 대비 총 아미노산 함량을 증가시켜 펩신 소화율을 높일 수 있다.
본 발명은 미세조류 기반 발효 공정을 통해 어분을 대체할 수 있는 대체 단백질원을 개발하였다. 본 발명에서 제시하는 조성물은 단순히 단백질 함량만 높은 것이 아니라, 어분과 유사하게 유용 지방산인 오메가-3 지방산까지 함유되어 있어 사료 배합 시 어분을 직접적으로 대체할 수 있다. 나아가, 본 발명에서 제시하는 고단백 미세조류 바이오매스는 펩신 소화율 분석법으로 분석한 결과, 70% 이상의 높은 펩신 소화율을 나타내므로, 사료 내 배합 비율이 높아지더라도 전체 소화율에 부정적인 영향을 미치지 않으며, 미세조류를 기반으로 생산되는 단백질 원이기 때문에 환경오염의 문제점이 없고, 외부 환경의 영향을 최소화하여 안정적으로 생산이 가능하다는 장점이 있다.
도 1은 배양 조건 별 미세조류 건조 바이오매스의 펩신 소화율과 바이오매스 내 조지방 함량 사이의 상관계수를 나타낸 도이다 (평균 ± 표준편차, n=4).
도 2는 배양 조건 별 미세조류 건조 바이오매스의 펩신 소화율과 바이오매스 내 조단백 함량 사이의 상관계수를 나타낸 도이다 (평균 ± 표준편차, n=4).
도 3은 배양 조건 별 미세조류 건조 바이오매스의 펩신 소화율과 바이오매스 내 조지방 중량 대비 오메가-3 지방산 함량 사이의 상관계수를 나타낸 도이다 (평균 ± 표준편차, n=4).
도 4는 배양 조건 별 미세조류 건조 바이오매스의 펩신 소화율과 바이오매스 내 총 아미노산 함량 사이의 상관계수를 나타낸 도이다 (평균 ± 표준편차, n=4).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<미세조류 균주의 종균 배양>
트라우스토키트리드 (Thraustochytrid) 계 미세조류에 속하는 기탁번호 KCTC14345BP로 기탁된 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-5004 균주를 이용하였다. 상기 균주를 멸균된 MJW01 배지 (Glucose 30 g/L, MgSO4·7H2O 3.0 g/L, Na2SO4 10 g/L, NaCl 1.0 g/L, 효모추출물 9.0 g/L, MSG·1H2O 1.0 g/L, NaNO3 1.0 g/L, KH2PO4 0.1 g/L, K2HPO4 0.5 g/L, CaCl2 0.5 g/L, 비타민 혼합 용액 10 ml/L)가 포함된 250 mL 플라스크 (flask)에서 26℃, 200 rpm 조건으로 30 시간 동안 배양하였다.
비교예 1. 균주를 배양액 대비 탄소원 농도를 7~9% (w/v 비율) 조건에서 배양한 바이오매스의 제조
상기 종균 배양한 균주를 멸균된 MJW01 배지(Glucose 30 g/L, MgSO4·7H2O 3.0 g/L, Na2SO4 10 g/L, NaCl 1.0 g/L, 효모추출물 0.5 g/L, MSG·1H2O 1.0 g/L, NaNO3 5.0 g/L, KH2PO4 1.5 g/L, K2HPO4 10 g/L, CaCl2 0.5 g/L, 비타민 혼합 용액 10 ml/L)가 들어 있는 5L 배양기 (fermenter)에 분주하여 28℃, 300 rpm, 0.6 vvm, pH 6.8 조건에서 배양을 진행하였다. 배양이 진행되는 동안 (45 시간) 배양액 내의 잔류 탄소원 농도가 총 배양액 대비 7~9% (w/v 비율) 범위에서 유지되도록 공급하였다. 배양을 개시한 직후부터 배양 종료 시점까지 질소원을 공급하며 배양을 지속하였다. 적정 질소원 농도 유지를 위하여 질소원의 공급은 on/off를 반복하며 배양액에 공급하였다. 상기 탄소원은 글루코오스 (glucose)가 사용되며, 질소원은 황산 암모늄 (ammonium sulfate)을 사용하였다. 배양 종료 후 균체 배양액을 동결 건조 또는 드럼 건조(Drum dry)하여 대조군인 비교예 1의 건조 바이오매스 (dry biomass)를 확보하였다.
실시예 1. 균주를 배양액 대비 탄소원 농도를 0~2% (w/v 비율) 조건에서 배양한 바이오매스의 제조
상기 비교예 1의 배양 조건 (control 조건, 대조군) MJW01 배지의 조성을 유지한 상태로 배양이 지속되는 동안 (45 시간) 배양액 내의 잔류 탄소원 농도가 총 배양액 대비 0~2% (w/v 비율) 범위에서 유지되도록 공급 하였다. 나머지 배양 조건은 비교예 1과 동일한 방법으로 배양하여 실시예 1의 건조 바이오매스 (dry biomass)를 확보하였다.
실시예 2. 균주를 배양액 대비 탄소원 농도를 최대 2~5% (w/v 비율) 조건에서 배양한 바이오매스의 제조
상기 비교예 1의 배양 조건 (control 조건, 대조군)에서 MJW01 배지의 조성을 유지한 상태로 배양이 지속되는 동안 (45 시간) 배양액 내의 잔류 탄소원 농도가 총 배양액 대비 2~5% (w/v 비율) 범위에서 유지되도록 공급하였다. 나머지 배양 조건은 비교예 1과 동일한 방법으로 배양하여 실시예 3의 건조 바이오매스 (dry biomass)를 확보하였다.
실시예 3. 균주를 배양액 대비 탄소원 농도를 최대 4~7% (w/v 비율) 조건에서 배양한 바이오매스의 제조
상기 비교예 1의 배양 조건 (control 조건, 대조군)에서 MJW01 배지의 조성을 유지한 상태로 배양이 지속되는 동안 (45 시간) 배양액 내의 잔류 탄소원 농도가 총 배양액 대비 4~7% (w/v 비율) 범위에서 유지되도록 공급하였다.
실험예 1. 배양 조건 별 미세조류 건조 바이오매스의 성분 분석
1-1. 미세조류 건조 바이오매스의 조지방 함량 및 지방산 함량 분석
상기 비교예 1, 실시예 1 내지 실시예 3에서 확보된 각 건조 바이오매스의 조지방 함량 및 지방산 함량을 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 비교예 1, 실시예 1 내지 실시예 3의 각 미세조류 건조 균체 2g에 8.3M 염산 용액을 가하여 80℃에서 가수분해반응을 수행하였다. 그런 다음, 에틸 에테르 (Ethyl ether) 30 mL와 석유 에테르 (Petroleum ether) 20 mL를 첨가한 후, 30초 동안 섞어 주고 원심분리하는 과정을 3회 이상 반복하였다. 분리된 용매층을 미리 무게를 측정한 라운드 플라스크에 옮긴 뒤, 질소 퍼징을 통해 용매 및 잔여 수분을 제거한 용기에 넣어 건조하였다. 용매를 건조시키고 남은 오일의 무게를 측정하여 총 오일 함량을 계산하였으며, 오일 중에 포함된 오메가-3 (DHA 및 EPA) 함량은 메탄올성 0.5N NaOH 및 14% 트리플루오로보란메탄올 (BF3)로 전처리를 진행한 뒤 기체 크로마토그래피법으로 측정하였다.
1-2. 미세조류 건조 바이오매스의 조단백 함량 분석
상기 비교예 1, 실시예 1 내지 실시예 3에서 확보된 각 건조 바이오매스의 조단백 함량을 분석하기 위하여 킬달자동분석기 활용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 비교예 1, 실시예 1 내지 실시예 3에서 확보된 각 미세조류 건조 바이오매스 시료를 킬달 장치 (Kjeldahl system, Kjeltec 2100) 분석용 튜브에 담고, 황상 및 촉매제를 넣어 분해기에서 분해 후, 분해 튜브를 오토 샘플러에 장착하였다. 킬달 장치 내에서 가성소다와 스팀으로 가열 증류하여 발생하는 기체 암모니아를 냉각 포집한 후, 이를 염산으로 적정하여 자동으로 질소 함량을 계산하는 방식으로 미세조류 건조 바이오매스 (dry biomass)의 조단백 함량을 측정하였다.
1-3. 미세조류 건조 바이오매스의 아미노산 함량 분석
상기 비교예 1, 실시예 1 내지 실시예 3에서 확보된 각 건조 바이오매스의 아미노산 함량을 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 비교예 1, 실시예 1 내지 실시예 3의 각 미세조류 건조 균체 0.5-1 g을 산가수분해한 뒤, 액체크로마토그래피를 이용하여 토탈 아미노산 분석을 수행하였다. 개별 아미노산의 분석 결과는 사용된 미세조류 건조 균체 양으로 표준화하여 건조 균체 내 개별 아미노산의 함량비를 산출하였고, 분석 결과 검출된 모든 아미노산의 함량비를 합하여 균체 내 총아미노산 함량비를 계산하였다.
1-4. 배양 조건 별 미세조류 건조 바이오매스의 성분 분석 결과
상기 실험예 1-1 내지 실험예 1-3의 방법으로 비교예 1, 실시예 1 내지 실시예 3에서 확보된 각 건조 바이오매스의 구성 성분을 분석한 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
　 조단백
/biomass 		총아미노산
/biomass 		조지방
/biomass 		DHA
/조지방 		EPA
/조지방 		오메가-3 지방산
/조지방
비교예 1 70.50% 45.75% 8.50% 46.25% 1.77% 48.02%
실시예 1 64.10% 48.10% 22.80% 40.51% 1.86% 42.37%
실시예 2 69.90% 52.78% 14.40% 49.40% 2.11% 51.51%
실시예 3 77.20% 52.18% 12.20% 42.47% 1.06% 43.53%
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 비교예 1과 실시예 1을 비교하였을 때, 실시예 1은 배양 과정에서 배양액 내 잔류 탄소원의 농도를 0~2%의 낮은 범위에서 유지시킴으로써 미세조류 바이오매스 내 총 아미노산 함량을 증가시킬 수 있었지만, 조지방 함량이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 2에서는 배양이 진행되는 동안 배양액 내 잔류하는 탄소원의 농도 범위를 2~5% 로 조정하였다. 비교예 1 및 실시예 2의 구성 성분 함량을 비교하였을 때, 실시예 2에서 탄소원의 농도를 2~5% 범위로 유지할 경우, 조단백 함량이 70% 수준으로 유지되었으며, 조지방 함량은 비교예 1과 실시예 1의 중간 범위로 나타나는 것을 확인하였다. 특히, 바이오매스 내 총 아미노산 함량이 52.78%로 배양 조건 중 가장 높은 값을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 3에서는 배양이 진행되는 동안 배양액 내 잔류하는 탄소원의 농도를 4~7% 범위로 유지시켰다. 실시예 3에서 탄소원의 농도를 4~7% 범위로 유지할 경우, 조단백 함량이 77.20%, 총 아미노산 함량이 52.18%, 조지방 함량이 12.20%로 나타나 배양 조건 중 가장 높은 조단백 함량을 나타낸 것을 확인하였다.
실험예 2. 배양 조건 별 미세조류 건조 바이오매스의 펩신 소화율 분석
사료 및 식품으로 미세조류 바이오매스를 사용하기 위해서는 단백질의 소화율이 중요한 지표이므로, 펩신 소화율 분석법에 따라 분석을 진행하였다. 배양 조건 별 미세조류 건조 바이오매스의 펩신 소화율을 분석하기 위하여, 상기 비교예 1, 실시예 1 내지 실시예 3에서 확보된 각 건조 바이오매스의 펩신 소화율을 Association of Official Analytical Chemists, 1990, Official Method of Analysis 971.09에 기재된 방법으로 측정하여 하기 계산식 1을 이용하여 펩신 소화율을 도출하였다.
구체적으로, 각 건조 바이오매스 시료 1 g에 42 내지 45℃로 미리 가열한 0.2% 펩신 염산 용액 150 mL를 가하고, 45℃ 항온수조에서 흔들어 주면서 16시간 동안 소화시킨 다음 No. 2A 여과지로 여과하였다. 불소화물을 온수로 세척한 뒤, 불소화물과 여과지의 조단백질 함량을 킬달 분석법으로 구하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
계산식 1의 킬달 질소 함량은 실험예 1-3의 킬달자동분석기 활용 조단백 분석에 기재된 방법으로 진행하여 구하였다.
[계산식 1]
펩신소화율 (%) = 100 * (A-B)/A
*A:　% 원 샘플의 킬달 질소의 함량 (Kjeldahl nitrogen in the original sample)　
*B: %　산성 펩신 용액에 불용성인 킬달 질소의 함량 (Kjeldahl nitrogen insoluble in acid pepsin solution)
펩신소화율
비교예 1 68.59%
실시예 1 73.40%
실시예 2 89.62%
실시예 3 83.2%
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 비교예 1의 미세조류 건조 바이오매스의 펩신 소화율은 68.6%로 비교적 낮은 편인 것으로 나타났다. 그러나, 배양 조건을 변경하여 바이오매스 구성 성분비를 변경시킨 결과, 실시예 1의 미세조류 건조 바이오매스의 펩신 소화율은 73.40%, 실시예 2의 미세조류 건조 바이오매스의 펩신 소화율은 89.62%, 실시예 3의 미세조류 건조 바이오매스의 펩신 소화율은 83.20% 및 높은 펩신 소화율을 나타냄을 확인하였다.
실험예 3. 배양 조건 별 미세조류 건조 바이오매스의 펩신 소화율과 총 아미노산 함량과의 상관관계 확인
상기 실험예 2에서 배양 조건의 변화를 통해 바이오매스 구성 성분비를 변경시킨 결과, 펩신 소화율이 높아짐을 확인하였으므로, 바이오매스의 구성 성분 중 어떤 지표가 펩신 소화율과 상관관계를 가지는지를 확인하였다.
구체적으로, 비교예 1, 실시예 1 내지 실시예 3에서 확보된 각 건조 바이오매스의 조지방 함량, 조단백 함량, 오메가-3 지방산/조지방 함량 및 총 아미노산 함량과 펩신 소화율 간의 상관계수를 도출하여 그 결과를 도 1 내지 도 4에 나타내었다.
그 결과 도 1 내지 도 3에 나타난 바와 같이, 바이오매스 구성 성분 중 조지방 함량, 조단백 및 조지방 중량 대비 오메가-3 지방산 함량은 펩신 소화율과 유의미한 상관관계가 없는 것으로 나타났다. 반면, 도 4에 나타난 바와 같이 바이오매스 내 총 아미노산 함량과 펩신 소화율 사이에는 유의미한 상관관계가 있는 것으로 나타났다(R2=0.9527). 일반적으로 총 아미노산은 조단백 함량 내 포함되는 개념이기 때문에 조단백 함량과 총 아미노산은 비례하여 변동되는 값으로 알려져 있지만, 본 발명에서 기재된 바와 같이 조단백 함량이 비슷하더라도 발효 조건에 따라 총 아미노산 함량을 변화시킬 수 있고, 바이오매스 내 총 아미노산 함량이 증가함에 따라 펩신 소화율이 증가함을 확인할 수 있다.
한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC) KCTC14345BP 20201026

Claims (19)

  1. 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류를 배양액 내의 잔류 탄소원 농도가 총 배양액 대비 7% 이하에서 유지되는 조건에서 배양하는 단계; 를 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류는 기탁번호 KCTC14345BP로 기탁된 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 CD01-5004 균주인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 MJW01 배지에서 수행하는 것인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배지의 탄소원은 글루코오스 (glucose), 프럭토오스 (fructose) 및 수크로오스 (sucrose)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배지는 질소원으로 요소 (urea), 암모니아수, 황산 암모늄 (ammonium sulfate), 효모 추출물, 펩톤 (peptone) 및 질산 나트륨 (sodium nitrate)으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 배지는 효모 추출물 0.01 내지 5 g/L, KH2PO4 1.0 내지 3.0 g/L, K2HPO4 5 내지 20 g/L를 포함하는 것인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 배양은 10 내지 70 시간 동안 수행되는 것인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 미세조류 배양방법은 미세조류 건조 중량 대비 총 아미노산 함량을 증가시켜 펩신 소화율을 높이는 것인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 펩신 소화율은 70% 이상인 것인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  10. 제1항의 제조방법으로 제조된 펩신 소화율이 우수한 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류 유래 바이오매스.
  11. 제10항에 있어서, 상기 스키조키트리움 (Schizochytrium) 속 미세조류는 기탁번호 KCTC14345BP로 기탁된 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 CD01-5004 균주인, 바이오매스.
  12. 제10항에 있어서, 상기 바이오매스는 바이오매스 건조 중량 대비 60 중량% 이상의 조단백을 함유하는 것인, 바이오매스.
  13. 제10항에 있어서, 상기 바이오매스는 바이오매스 건조 중량 대비 4 중량% 내지 23 중량%의 조지방을 함유하는 것인, 바이오매스.
  14. 제10항에 있어서, 상기 바이오매스는 총 조지방 중량 대비 40 중량% 이상의 도코사헥사엔산 (docosahexaenoic acid)을 함유하는 것인, 바이오매스.
  15. 제10항에 있어서, 상기 바이오매스는 총 조지방 중량 대비 0.5 중량% 이상의 에이코사펜타엔산 (eicosapentaenoic acid)을 함유하는 것인, 바이오매스.
  16. 제10항에 있어서, 상기 바이오매스는 총 조지방 중량 대비 41 중량% 이상의 오메가-3 지방산을 함유하는 것인, 바이오매스.
  17. 제10항에 있어서, 상기 바이오매스는 펩신 소화율이 70% 이상인, 바이오매스.
  18. 제10항의 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스를 포함하는 사료 조성물.
  19. 제10항의 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스를 포함하는 식품 조성물.
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