KR101847551B1 - 카로티노이드 계열의 항산화 색소 및 dha를 포함한 바이오오일을 고생산하는 돌연변이 미세조류인 스키조키트리움 속 shg104 균주 및 이의 용도 - Google Patents

카로티노이드 계열의 항산화 색소 및 dha를 포함한 바이오오일을 고생산하는 돌연변이 미세조류인 스키조키트리움 속 shg104 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카로티노이드 계열의 항산화 색소 및 DHA를 포함한 바이오오일을 고생산하는 돌연변이 미세조류인 스키조키트리움 속 SHG104 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 고품질의 바이오오일인 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 오메가-3 오일 및 팔미트산의 바이오오일과 강력한 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔을 동시에 생산할 수 있고, 우수한 생산수율을 보이는 것으로 나타나 생산 비용 절감 효과를 제공할 수 있다. 또한, DHA를 포함한 오메가-3 오일 및 팔미트산 바이오오일과 강력한 카로티노이드계 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴 항산화 기능성물질 등을 동시에 활용함으로써 고부가가치 산업과 바이오오일 산업의 시장 경쟁력을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

카로티노이드 계열의 항산화 색소 및 DHA를 포함한 바이오오일을 고생산하는 돌연변이 미세조류인 스키조키트리움 속 SHG104 균주 및 이의 용도{Mutant microalgae Schizochytrium sp. SHG104 strain having high productivity of carotenoid-type antioxidant pigment and bio-oil containing DHA and uses thereof}
본 발명은 카로티노이드 계열의 항산화 색소 및 DHA를 포함한 바이오오일을 고생산하는 돌연변이 미세조류인 스키조키트리움 속 SHG104 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
해양 생태 먹이사슬의 최하위 계급을 차지하는 유기종속영양 미세조류인 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 DHA(docosahexaenoic acid)를 비롯한 다양한 다중불포화지방산(polyunsaturated fatty acid)을 고농도로 함유하는 트리아실글리세롤(Triacylglycerol)의 공급원으로 중요한 역할을 수행하는 것으로 잘 알려져 있다. 특히 다중불포화지방산 DHA는 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동신경능력 개발에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 치매 환자 뇌에서는 그 양이 현저하게 줄어드는 것으로 보고되었으며, 노안의 황반 변성 억제 등 다양한 항노화 기능들이 새롭게 밝혀지고 있다. 사람을 비롯한 대부분의 고등 동물은 정상적인 생체기능에 필요한 다중불포화지방산을 자체적으로 원활하게 합성하지 못하기 때문에 다중불포화지방산을 필수 영양소로 반드시 섭취하여야 하며, 세계보건기구는 하루 1g 이상의 DHA 함유 다중불포화지방산을 꾸준히 섭취할 것을 권장하고 있다.
전통적으로 DHA 다중불포화지방산의 공급원은 참치, 연어와 같은 해양 생태환경의 상위를 차지하는 심해성 어류들이다. 하지만, 해양환경의 오염이 심해지면서 심해성 어류의 체내에 수은을 비롯한 중금속, 환경호르몬, 방사성물질 등 오염물질의 축적으로 인해 심해어류 섭취에 대한 위험이 커지고 있다. 따라서 DHA 다중불포화지방산 오일을 안전하고, 안정적으로 공급할 수 있는 새로운 수단으로 트라우스토키트리드 미세조류가 주목을 받고 있다.
카로테노이드(Carotenoid)는 40개의 탄소 원소로 이루어진 파이토엔(phytoene)으로부터 합성되는 터페노이드(Terpenoid) 계열의 색소로 미세조류, 박테리아 등의 미생물이나 곰팡이, 버섯과 같은 균계류 및 고등식물에서 생산된다. 카로테노이드는 특유의 색 때문에 사료나 식품 첨가물로 많이 이용되었다. 한편 카로테노이드는 긴 이중결합 사슬과 케톤기(C=O) 또는 수산화기(-OH)를 가지고 있기 때문에 강한 항산화제 효과를 가지고 있어 최근 의약품 및 건강식품으로서의 관심이 증가하고 있다. 현재 대부분의 카로테노이드는 화학적 합성을 통해 생산되고 있지만 의약품 및 건강식품으로의 활용과 더불어 자연적 합성에 대한 관심이 높아지고 있는 추세이다.
2003년에 처음으로 트라우스토키트리드를 카로테노이드 생산 플랫폼으로서 제안하였다(Aki et al. 2003. J Am Oil Chem Soc, 80 : 789-794). 트라우스토키트리드는 베타카로틴 및 칸타잔틴을 거쳐 아스타잔틴까지 합성을 할 수 있는 것으로 밝혀졌으며 아스타잔틴의 생산 능력은 1.5 mg/L/day로 분석되었다. 이는 다른 아스타잔틴 생산균주인 해마토코커스 프루비아리스(1.9 mg/L/day)나 파피아 로도지마(0.9-2 mg/L/day)과 비슷한 양을 생산할 수 있는 것으로 분석되었다. 2003년 트라우스토키트리드가 카로테노이드 생산균주로서의 가능성이 발견된 이후 주로 배양 공정을 통해 아스타잔틴 생산능력을 높이려는 노력이 많이 이루어졌다. 트라우스토키트리드 또한 해마토코커스와 같이 UV, 청색광 LED 등 단파장 빛에 의한 스트레스, 질소원 고갈에 의한 스트레스 등에 아스타잔틴 생산이 영향을 받는 것으로 보이며, 다양한 폐수를 이용한 연구도 지속적으로 이루어지고 있다. 그 외에도 헤모글로빈 유전자 발현을 통해 산소 포집능력을 증가시켜 아스타잔틴의 생산 능력을 증가시킨 연구도 진행되었다.
2011년 BCC 보고가 발표한 카로테노이드 시장 보고서에 따르면 2010년 카로테노이드 시장 규모는 12억 달러이며 오는 2018년에는 14억 달러에 달한 전망이다. 세계 카로테노이드 시장은 총 10개의 제품군으로 분류할 수 있으며 이는 베타 카로틴(Beta-carotene), 루테인(Lutein), 아스타잔틴(Astaxanthin), 캡산틴(Capsanthin), 아나토(Annatto), 칸타잔틴(Canthaxanthin), 라이코펜(Lycopene), 베타-아포-8-카로테날(Beta-apo-8-carotenal), 제아잔틴(Zeaxanthin), 베타-아포-8-카로테날-에스터(Beta-apo-8-carotenal-ester)이다. 이 중 베타 카로틴, 루테인과 아스타잔틴이 2억 달러 이상의 시장 가치를 지니고 있어 주로 연구가 많이 이루어지고 있다. 그 외의 나머지 10개 제품군은 1억 5천만 달러 이하의 시장 가치를 지니고 있다. 특히 베타 카로틴과 루테인은 2018년에 3억 달러 규모 이상으로 증가할 것으로 예상되며 아스타잔틴의 경우 2억 5천 300만 달러 규모로 증가할 것으로 전망되어 향후에도 추가적인 생산 연구가 많이 이루어질 것으로 예상된다. 현재 베타 카로틴이나 아스타잔틴과 같은 주요 카로테노이드 상품들은 화학적인 합성법이 개발되어 시간이 지남에 따라 화학적 합성으로 생산된 이 상품들의 가격은 지속적으로 하락하고 있는 추세이다. 그러나 이러한 카로테노이드 상품의 시장가치가 지속적으로 증가하는 이유는 기존의 포화된 사료, 식료품 시장과 차별화된 천연 카로테노이드를 이용한 의약품이나 화장품의 고부가가치 시장이 새롭게 생성되었기 때문이다. 이러한 천연 카로테노이드를 생산하는 주 플랫폼으로 현재 사용되고 있는 것이 미세조류이다. 현재 미세조류에서 주로 생산되고 있는 카로테노이드 상품으로는 베타 카로틴, 루테인, 아스타잔틴 등이 있다.
베타 카로틴은 식품, 의약품, 사료, 화장품의 순서로 시장을 형성하고 있으며 그 비율은 각각 2010년 기준으로 51, 35, 8, 3.6%로서 식품과 의약품이 가장 높은 비율을 차지하고 있다.
Figure 112016107881860-pat00001
[베타 카로틴의 화학 구조]
카로테노이드는 산소 원자의 결합 유무에 따라 카로틴(Carotene)과 잔토필(Xanthophyll)로 분류된다. 아스타잔틴은 잔토필 합성대사에서 최종생산물로서 베타 카로틴의 벤젠 링에 두 개의 산소가 케톤기와 수산화기로 결합되어 있는 형태를 가지고 있다. 생산 초기에는 연어나 송어 등 특유의 붉은색을 더 좋게 만드는데 사료로 사용되었다. 그러나 아스타잔틴의 항산화능력이 우수하다는 것이 밝혀지면서 의약품이나 화장품 등의 고부가소재로 사용되기 시작했다.
Figure 112016107881860-pat00002
[아스타잔틴의 화학구조]
아스타잔틴의 항산화능력은 2013년 발표된 유엔 미래포럼에 따르면 비타민 C의 6천배, 비타민 E의 550배, 비타민B의 54배, 코엔자임Q10의 800배, 녹차의 550배 효능이 있다고 알려져 있다. 특히 사람이 아스타잔틴을 활용할 경우 자외선 차단, 면역성 강화, 신진대사 강화, 시력 강화, 세포 건강, 노화 방지, 심혈관 질병 예방, 치매 뇌건강 증진, 알츠하이머 질병 치료, 염증 치료, 통증 치료, 암 예방, 당뇨병 치료, 암세포 치료, 천식 치료, 정력제, 위염 치료에 효과를 볼 수 있다. 현재 아스타잔틴은 크게 화학 합성법과 천연 합성법에 의해 생산되고 있는데 2011년 BCC 보고에 따르면 화학 합성이 전체 생산의 80%를 차지하고 나머지 천연 합성법이 20%를 차지하고 있다. 화학적으로 합성된 아스타잔틴은 대부분이 인공색소로 사용되고 있는데 화학적으로 합성될 경우 생산되는 아스타잔틴에는 거울상 이성질체가 섞여있기 때문에 인체에 해로운 영향을 줄 수 있는 것으로 연구되어 사람이 섭취하는 것들에는 주로 천연으로 생산되는 아스타잔틴이 사용된다. 이 중 미세조류에 의한 생산은 7%를 차지하며 해마다 증가하고 있는 추세이다. 게다가 합성 아스타잔틴의 가격은 매년 떨어져 2010년 기준 1100 달러/kg까지 감소한 것에 비해 미세조류에서 생산된 아스타잔틴은 3,000에서 4,500 달러/kg으로 굉장히 고가이기 때문에 높은 시장 가치를 지니고 있다.
아스타잔틴을 단독으로 생산할 수 있는 균주 중에 가장 높은 아스타잔틴 함량을 보이는 종은 해마토코커스 프루비아리스(Haematococcus pluvialis)로 담수에서 서식하는 미세조류이다. 이 미세조류는 평소에는 초록색을 띄고 있지만 외부 스트레스에 노출되면 붉은색(red stage)으로 변하게 된다. 해마토코커스는 아스타잔틴을 바이오매스의 3% 이상을 축적할 수 있으며 이는 아스타잔틴을 축적하는 생물들 중에서 가장 높다. 해마토코커스는 강한 햇빛, 영양분 고갈 등의 스트레스에 노출되었을 때만 아스타잔틴이 축적되기 때문에 산업 생산 공정은 바이오매스를 최대한 확보하는 성장 단계와 스트레스에 노출시켜 아스타잔틴 생산을 유도하는 단계로 나뉘어서 진행된다. Olaizola et al(Olaizola, M. 2000 J Appl Phycol 12: 499-506)은 아스타잔틴 생산을 위해 25,000L 규모 광배양기(PBR)를 이용하여 해마토코커스를 연속 공정을 통해 생산하면서 세포농도가 최고가 되었을 때 옥외 배양장으로 세포를 내보내어 강한 햇빛 아래에 5일간의 숙성단계를 거쳐 13 g m-2 d-1의 아스타잔틴 생산속도를 확보하였다. 하지만 이처럼 높은 생산량을 보임에도 불구하고 아스타잔틴 생산 공정이 옥외 배양을 통해 이루어진다는 점 때문에 기후 변화나 공기 오염 여부에 따라 아스타잔틴 생산 효율에 영향을 미치고, 과도한 스트레스에 노출되면 세포가 하얗게 변색되어 사멸되어 버리는 문제 때문에 전 세계적으로 미세조류를 이용한 아스타잔틴 생산에 성공한 기업은 극히 드물다. 현재 아스타잔틴을 생산하고 있는 회사로는 ADM/Igene, 시아노테크(Cyanotech), 알지테크(Algaetech), 심바이오틱스(Symbiotics) 등이 있다. 해마토코커스를 이용한 아스타잔틴 생산은 높은 생산량에도 불구하고 외부 환경에 높은 의존도를 가지기 때문에, 이를 대체할 수 있는 효모나 영양요구성 미세조류를 이용한 카로테노이드 생산 연구가 필요한 상황으로 높은 카로테노이드 생산이 가능한 영양 요구성 미세조류를 확보하고, 이의 개량을 통해 아스타잔틴의 생산량을 높이는 연구가 시행되어야 한다.
또한, 그 외에 카로테노이드 항산화물질로서 칸타잔틴은 4,4'-Ddeoxy-β-carotene으로 자연계에 널리 분포하고 있는 카로티노이드 색소의 일종으로 미국에서는 식품 및 약품의 첨가색소로 지정되어 있다. 시판되는 β-카로틴을 합성할 때의 중간체이며, 트랜스형:보라색의 결정이다. 또 다른 카로티노이드의 하나인 에키네논(echinenone)으로 크산토필계 카로틴 색소의 한 종류로 유글레나류에서 발견되었고, 성게의 생식소와 남조류에서 확인된다. 프로비타민 A 작용을 가지며, 본 발명에 이용된 미세조류에서도 생산이 확인되었다(도 3).
Thraustochytriaceae 균주는 부등편모조류 (heterokont algae)에 속하는 해양 유래의 단세포 미생물로서, 식약처 식품원재료로 등재되어 있으며, Thraustochytriaceae family 중 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 균주는 GRAS 균주로서 이 균주가 생성하는 유지는 미국 FDA로부터 GRAS로 승인되었다 (GRN000137; GRN 000160). Thraustochytriaceae 균체의 주요 구성 성분은 지질 (60%)와 단백질 (20%)로 이루어져 있어, 효과적인 영양원으로 기능을 할 수 있으며, 트라우스토키트리드 미세조류의 오일은 DHA와 같은 고기능 다중불포화지방산의 함량이 높은 특성과 함께 다양한 생리활성 소재들을 함유하고 있다.
한편, 한국등록특허 제1480051호에서는 '트라우스토키트리드 미세조류의 리보좀 단백질 코딩하는 유전자 변이체를 이용한 형질전환체 선별마커'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1147450호에서는 '신규 유지성 미세조류 ＫＲＳ１０１ 균주 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법'이 개시되어 있고, 또한, 한국등록특허 제1185596호에서는 'DHA 생산성을 향상시킨 스키조키트리움 속 JBF-06 균주와 이를 이용한 DHA 생산방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '카로티노이드 계열의 항산화 색소 및 DHA를 포함한 바이오오일을 고생산하는 돌연변이 미세조류인 스키조키트리움 속 SHG104 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 우리나라 서남해안 연안으로부터 분리한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH104 균주를 대상으로 감마선 조사에 의한 돌연변이를 유발시켜 균주색상이 노랑색-주황색 계열의 항산화물질 생산성이 향상되는 등 배양 특성이 개선된 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 변이균주 SHG104를 분리할 수 있었다.
본 발명의 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 변이균주 SHG104는 모균주보다 강력한 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴(Beta-carotene), 에키네논(Echinenone), 칸타잔틴(Canthaxanthin) 및 아스타잔틴(Astaxanthin) 함량이 증가되었을 뿐만 아니라, 무엇보다도 모균주와는 달리 베타카로틴의 생성을 배양과정 동안 노랑색-주황색 계열의 색상변화를 가시적으로 확인할 수 있었고, 이에 따라 모균주보다 제한시간 안에 다중불포화지방산(DHA)을 포함하는 외에 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴을 동시에 생산할 수 있는 장점을 가지는 큰 차이가 있으므로, 본 발명을 통해 고기능의 오메가-3 다중불포화지방산 및 카로티노이드계 항산화물질 생산이 동시에 가능한 고품질 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 변이균주 SHG104를 제공할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 카로티노이드 계열의 항산화 색소 및 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 바이오오일을 고생산하는 돌연변이 미세조류인 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SHG104 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 LED 백색광 조사하에서 26~30℃에서 1~3일 배양한 후 18~22℃에서 1~3일 배양하는 온도 변환(shift) 단계를 포함하는 카로티노이드 계열의 항산화 색소의 대량생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 카로티노이드 계열의 항산화 색소 생산용 미생물제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 어류용 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 카로티노이드 계열의 항산화 색소를 분리하는 것을 특징으로 하는 카로티노이드 계열의 항산화 색소의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항산화용 기능성식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 바이오오일 생산용 미생물제제를 제공한다.
본 발명의 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 오메가-3 오일 및 팔미트산 바이오오일과 강력한 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴(Beta-carotene), 에키네논(Echinenone), 칸타잔틴(Canthaxanthin) 및 아스타잔틴(Astaxanthin) 등을 고농도로 포함한 바이오오일 고생산 미세조류인 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 돌연변이 SHG104 균주는 단시간(36-40시간) 배양을 통해 높은 균체 생산성을 보이면서 동시에 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 오메가-3 오일 및 팔미트산 바이오오일과 강력한 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴 생산이 우수하다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 균주는 고품질의 바이오오일인 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 오메가-3 오일 및 팔미트산의 바이오오일과 강력한 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔을 동시에 생산할 수 있고, 우수한 생산수율을 보이는 것으로 나타나 생산 비용 절감 효과를 제공할 수 있다.
또한, DHA를 포함한 오메가-3 오일 및 팔미트산 바이오오일과 강력한 카로티노이드계 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴 항산화 기능성물질 등을 동시에 활용함으로써 고부가가치 산업과 바이오오일 산업의 시장 경쟁력을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 감마선 조사에 의한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 변이균주 SHG104에 대한 모균주인 SH104의 분류학적 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 감마선 조사에 의한 스키조키트리움 속 변이균주 SHG104(B)와 모균주인 스키조키트리움 속 SH104 균체(A)의 전자현미경 결과를 나타내었고, (C)는 감마선 조사에 의한 스키조키트리움 속 변이균주 SHG104(2) 및 모균주인 SH104(1)의 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴 생산을 가시적 색상변화를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 카로티노이드 계열의 항산화색소 조성 분석을 위하여 균체를 4-8일간 배양한 후, 회수하여 클로로포름 및 메탄올 혼합물(2:1 v/v)의 용매로 추출하여 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴의 생산을 액체크로마토그래피로 분석에 의하여 확인한 결과이다.
도 4는 스키조키트리움 속 SH104 모균주 및 SHG104 변이균주에서 일반배양을 통해 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴의 생산량 변화(A) 및 균체성장률(B)을 조사한 결과이다.
도 5는 스키조키트리움 속 SHG104 변이균주의 카로티노이드 계열의 항산화색소 생산향상을 위해 이용된 LED 조사에 의한 배양 결과를 나타낸다.
도 6은 스키조키트리움 속 SH104 모균주 및 SHG104 변이균주의 카로티노이드 계열의 항산화색소 생산향상을 위해 LED 조사에 의한 배양 후 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴의 생산량 변화(A), 균체성장률(B) 및 SH104 모균주 대비 SHG104 변이균주의 베타카로, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴 함량 증가율(C)을 나타낸 것이다.
도 7은 감마선 조사에 의한 스키조키트리움 속 변이균주 SHG104의 온도 변환(shift)에 의한 배양방법에 따라 카로티노이드계 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴 항산화물질 생산이 증가된 결과를 육안으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 스키조키트리움 속 SH104 모균주 및 SHG104 변이균주의 카로티노이드 계열의 항산화색소 생산향상을 위해 LED 조사 조건에서 온도 변환 배양 후 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴의 생산량 변화(A), 균체성장률(B), 총 지질생산량(C) 및 SH104 모균주 대비 SHG104 변이균주의 베타카로, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴 함량 증가율(D)을 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카로티노이드 계열의 항산화 색소 및 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 바이오오일을 고생산하는 돌연변이 미세조류인 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SHG104 균주를 제공한다.
상기 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SHG104 균주는 모균주인 SH 104 균주를 대상으로 감마선 조사에 의한 돌연변이를 유발시켜 균주색상이 노랑색-주황색 계열의 항산화물질 생산성이 향상되는 것을 확인하고 분리하였는데, 특히, 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴(Beta-carotene), 에키네논(Echinenone), 칸타잔틴(Canthaxanthin) 및 아스타잔틴(Astaxanthin) 함량이 증가되었으며, 고품질의 바이오오일인 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 오메가-3 오일 및 팔미트산의 바이오오일 생산성이 향상되는 등 배양 특성이 개선된 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 돌연변이 균주를 분리하였고, 이를 스키조키트리움 속 SHG104로 명명하였다. 본 발명에서 분리한 상기 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SHG104 균주를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2016년 8월 29일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC13089BP).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 카로티노이드 계열의 항산화 색소는 베타카로틴(Beta-carotene), 에키네논(Echinenone), 칸타잔틴(Canthaxanthin) 및 아스타잔틴(Astaxanthin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 LED 백색광 조사하에서 26~30℃에서 1~3일 배양한 후 18~22℃에서 1~3일 배양하는 온도 변환(shift) 단계를 포함하는 카로티노이드 계열의 항산화 색소의 대량생산 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 LED 백색광은 일반적인 파장의 LED 백색광으로, 특정 파장으로 한정되지 않는다.
본 발명에서는 빛의 조사(LED 백색광 파장)하에서 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.) 변이균주 SHG104의 카로티노이드 계열의 항산화색소의 온도 변환(shift)에 의한 생산향상 확인을 위해 28℃에서 2일간 배양한 후, 20℃에서 온도를 낮추어 2일간 배양한 뒤 배양균체의 베타카로틴을 포함한 칸타잔틴, 에키네논 및 아스타잔틴의 생산을 분석한 결과 변이균주는 모균주에 비해 아스타잔틴의 경우 5.6배, 칸타잔틴 14.7배, 에키네논 15.9배, 베타카로틴의 경우 10.8배 그리고 총카로티노이드 계열은 8.2배 이상 생산하는 것을 확인하였고, 배양기간도 많이 단축되는 결과를 확인하였다(도 7, 도 8 및 표 4). 따라서, 본 발명을 통해 LED 조사 및 온도 변환(shift)에 의한 배양방법은 매우 간단하지만 카로티노이드 계열의 항산화색소 생산 향상을 위한 극대의 효과를 얻을 수 있는 공정방법인 점을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 카로티노이드 계열의 항산화 색소 생산용 미생물제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SHG104 균주를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 카로티노이드 계열의 항산화 색소의 생산에 효과적으로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 어류용 사료 첨가제를 제공한다. 본 발명의 상기 어류는 관상어를 포함한 어류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다.
상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 카로티노이드 계열의 항산화 색소를 분리하는 것을 특징으로 하는 카로티노이드 계열의 항산화 색소의 생산 방법을 제공한다.
상기 균주는 LED 백색광 조사하에서 26~30℃, 1~3일 배양한 후 18~22℃, 1~3일 배양하는 방법이 바람직할 수 있으며, 상기 균주 배양액으로부터 카로티노이드 계열의 항산화 색소를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항산화용 기능성식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SHG104 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 균주는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SHG104 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 바이오오일 생산용 미생물제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SHG104 균주를 유효성분으로 포함할 수 있으며, DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 바이오오일의 생산에 효과적으로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조 방법을 제공한다. 상기 균주는 LED 백색광 조사하에서 26~30℃, 1~3일 배양한 후 18~22℃, 1~3일 배양하는 방법이 바람직할 수 있으며, 상기 균주 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 감마선 조사 방법에 의한 스키조키트리움 속 ( Schizochytrium sp.) 변이균주 SHG104 의 분리
남서해 연안지역의 해수 시료를 50㎖ 팔콘 튜브를 이용하여 채취하고, 생리식염수 10㎖을 가하여 현탁한 후 희석하여 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 미세조류 분리용 B1 배지 (1 g/l 효모 추출물, 1 g/l 펩톤, 10 g/l 아가를 300 ㎎/l 페니실린 G와 500 ㎎/l 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate)를 첨가한 천연해수 1 l에 녹임)에 도말하였다. 28℃에서 200rpm으로 2-4일간 배양하여 얻어진 콜로니들을 B1 배지에 재접종하여 순수분리한 후 현미경으로 관찰하여 트라우스토키트리드 균주의 전형적인 특징인 유주자(zoospore) 낭을 형성하는 콜로니를 분리하였다. 분리한 콜로니들을 50㎖ 기본배지 (탄소원 포도당 20 g/l, 질소원 효모 추출물 10 g/l, 인공해수염 5 g/l, KH2PO4 9 g/l) (250㎖ 플라스크)를 이용하여 28℃에서 빛의 조사(LED 블루 파장)하에서 120rpm으로 3일간 배양한 후, 균체를 회수하여 클로로포름 및 메탄올 혼합물 (2:1 v/v)의 용매로 추출하여 강력한 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔의 생산을 액체크로마토그래피 분석에 의하여 확인하였다. 이외에 건조 균체를 5% 메탄올-황산 (methanolic sulfuric acid) 용액 6㎖에 재현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 생성된 지방산에스테르를 0.2㎖의 헥산으로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하여, 다중불포화지방산을 포함하는 지질의 함량도 동시에 매우 높은 특성을 보이는 것으로 분석하였다. 분리한 콜로니의 분자생물학적 동정을 위하여 18S rRNA 유전자 염기서열 상동성 분석 결과, 스키조키트리움 속과 가장 높은 상동성을 보이는 것으로 나타났으며, 도 1에 나타낸 바와 같이 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.) SH104 균주로 명명하였다.
상기 분리된 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.) SH104 균주의 감마선 조사 변이에 의하여 항산화색소 생산이 보다 향상된 균주를 분리하고자 하였다. 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.) SH104 균주를 50㎖ 플라스크에서 48시간 배양 후 균체를 회수하여 PBS 버퍼 10㎖에 현탁하여 감마선을 1~5 Kgy 선량으로 1시간 조사 후 50㎖ 기본 배지 (탄소원 포도당 30 g/l, 질소원 효모 추출물 10 g/l, 인공해수염 5 g/l, KH2PO4 9g/l) (250㎖ 플라스크)를 이용하여 28℃에서 120 rpm으로 2일간 배양한 후, 사멸률이 99%일 때 현탁한 균체를 적당히 희석하여 기본배지(탄소원 포도당 30 g/l, 질소원 효모 추출물 10 g/l, 인공해수염 5 g/l, KH2PO4 9g/l, 아가 20g/l)에 도말하였다. 도말한 플레이트에서 빛이 조사되는 조건의 배양기에서 배양한 후 콜로니 색깔이 노랑에서 오렌지계열의 색소를 생산하는 콜로니를 선별하여 플라스크 배양을 실시하였다. 도 2는 모균주(A)와 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.) SH104 균주의 감마선 조사 변이에 의하여 항산화색소 생산이 보다 향상된 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.) SHG104 변이균주(B)의 전자현미경 사진(A 및 B) 및 색소생성 결과(C)이다(도 2).
실시예 2. 스키조키트리움 속 ( Schizochytrium sp .) 변이균주 SHG104 의 카로티노이드 계열의 항산화물질 및 오메가-3를 포함하는 바이오오일 조성 분석
카로티노이드 계열의 항산화 물질인 베타카로틴 외에 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴 계열의 항산화색소 조성 분석을 위하여 28℃에서 빛의 조사하에서 130rpm으로 4-8일간 배양한 후, 균체를 회수하여 클로로포름 및 메탄올 혼합물 (2:1 v/v)의 용매로 추출하여 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴의 생산을 액체크로마토그래피 분석에 의하여 확인하였다 (도 3 및 표 1). 표 1에서와 같이 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.) SH104 균주의 감마선 조사 SHG104 변이균주는 모균주(S. sp SH104)보다 향상된 카로티노이드 계열의 항산화 물질인 베타카로틴 외에 에키네논, 칸타잔틴, 아스타잔틴계열의 항산화색소 생산을 확인하였다. 아스타잔틴의 경우 변이균주에서 모균주보다 약 5.1배 생산이 증가하였고, 베타카로틴의 경우 약 5.6배, 총 카로티노이드는 약 5.3배 이상 생산하는 결과를 확인하였다.
Figure 112016107881860-pat00003
항산화색소 외에도 지방산 조성분석을 위하여 원심분리법으로 회수한 균체를 PBS 버퍼(phosphate buffered saline, pH 7.2)로 3회 세척한 후 동결 건조기에서 12시간 건조하여 건조 균체 중량을 측정하고 5% 메탄올-황산 (methanolic sulfuric acid) 용액 6㎖에 재현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 생성된 지방산에스테르를 0.2㎖의 헥산으로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하였다. 전체 오일 함량은 수정된 Bligh-Dyer법에 의하여 분석되었다. 10ml 배양액의 건조 균체에 클로로포름 3.125㎖, 메탄올 6.25㎖, 50 mM K2HPO4 버퍼 (pH 7.4) 2.5㎖을 가하여 28℃에서 200 rpm으로 1시간 동안 반응한 후, 클로로포름 3.125㎖, K2HPO4 버퍼 3.125㎖을 첨가하여 30회 정도 섞어준 후 4,000rpm에서 10분간 원심분리 후, 오일이 함유된 유기용매층으로 분리되도록 하였다. 미리 무게를 측정해둔 알루미늄 접시로 클로로포름 층을 조심스럽게 옮긴 후 90℃에서 30분 동안 건조한 후 오일의 무게를 측정하였다. 전체 오일 함량은 아래와 같이 산출하였다.
총 오일함량 (%, 오일 g/건조균체량 100 g) = (WL-WD) × VC × 100/VP × WS
WL: 알루미늄 접시 + 지질의 무게, WD: 알루미늄 접시의 무게, VC: 클로로포름의 총 부피, VP: 알루미늄 접시에 옮긴 클로로포름의 부피, WS: 사용한 균체의 무게 (건조중량)
하기 표 2와 같이 카로티노이드계 항산화물질인 베타카로틴, 에키네논, 칸타잔틴 및 아스타잔틴 외에도 고기능성 오메가-3 오일(DHA)을 생산함을 확인하였다(표 2). 또한, SHG104의 변이균주의 경우 모균주와 비교하여 균체성장이 크게 감소하지 않았고, 균체량 대비 총 오일 함량도 크게 감소하지 않았으므로, 항산화색소 생산 균주로서의 장점을 가지고 있음을 보여주었다(도 4).
Figure 112016107881860-pat00004
실시예 3 : 스키조키트리움 속 ( Schizochytrium sp .) SH104 의 카로티노이드 계열의 항산화색소 생산향상을 위한 배양 : LED 조사에 의한 배양
카로티노이드 계열의 항산화색소 생산에 영향을 미치는 요소로서 pH, 산소공급량, 온도, 빛 등 여러 영향인자가 관여하는 것으로 알려져 있다. 먼저 빛, LED 조사에 의해 카로티노이드 계열의 항산화색소 생산에의 영향을 조사하기 위하여, 기본배지 (탄소원 포도당 20 g/l, 질소원 효모 추출물 10 g/l, 인공해수염 5 g/l, KH2PO4 9 g/l) (250㎖ 플라스크)를 이용하여 28℃에서 빛의 조사(LED 백색광 파장)하에서 165 rpm으로 배양한 후, 4, 8, 12일 배양균체의 베타카로틴을 포함한 칸타잔틴, 에키네논 및 아스타잔틴의 생산을 분석한 결과, 배양기간도 많이 단축되고 생산량도 훨씬 증가한, 4일 배양된 균체에서 생산이 가장 많이 향상된 결과를 확인하였다(도 5, 도 6 및 표 3).
도 5, 도 6 및 표 3에서 변이균주는 모균주에 비해 아스타잔틴의 경우 5.6배, 칸타잔틴 5.2배, 에키네논 5.6배, 베타카로틴의 경우 6.4배 그리고 총카로티노이드계열은 6.1배 이상 가까이 생산하는 결과를 확인하였다. 이러한 배양방법, 즉 카로티노이드 계열의 항산화색소 생산향상을 위한 LED 조사에 의한 배양방법은 카로티노이드 계열의 항산화색소 종류에 따라서도 향후 다양하게 응용할 수 있을 것으로 분석되었다(도 5, 도 6 및 표 3). 반면 성장이 크게 감소하지 않아 오일생산량에도 거의 변함이 없음을 확인할 수 있었다.
Figure 112016107881860-pat00005
실시예 4. 스키조키트리움 속 ( Schizochytrium sp .) 변이균주 SHG104 의 카로티노이드 계열의 항산화색소 생산향상을 위한 배양 : 온도 변환(shift)에 의한 배양
카로티노이드 계열의 항산화색소 생산에 영향을 미치는 요소 중 온도 특히 배양온도의 변환(shift)에 의하여 생산증가 공정을 개발하려고 하였다. 빛의 조사(LED 백색광 파장)하에서 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.) 변이균주 SHG104의 카로티노이드 계열의 항산화색소의 온도 변환(shift)에 의한 생산향상 확인을 위해 28℃에서 2일간 배양한 후, 20℃에서 온도를 낮추어 2일간 배양한 뒤 카로티노이드 계열의 항산화색소 생산에의 영향을 조사하였다. 배양균체의 베타카로틴을 포함한 칸타잔틴, 에키네논 및 아스타잔틴의 생산을 분석한 결과, 배양기간도 많이 단축되고 생산량도 많이 향상된 결과를 확인하였다(도 7, 도 8 및 표 4). 하기 표 4는 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.) 변이균주 SHG104의 온도 변환에 의한 카로티노이드 계열의 항산화색소 생산 조성결과이다.
LED 조사하에서 온도 변환에 의한 배양에 따라 변이균주는 모균주에 비해 아스타잔틴의 경우 5.6배, 칸타잔틴 14.7배, 에키네논 15.9배, 베타카로틴의 경우 10.8배 그리고 총카로티노이드 계열은 8.2배 이상 생산하는 결과를 확인하였다. LED 및 온도 변환 배양방법의 변화가 각각의 항산화물질에 생산증가에 미치는 효과는 정도의 차이가 있기는 하지만 전체적으로 크게 생산량이 향상된 효과를 얻을 수 있었다. 반면 성장율이 모균주와 비슷한 점을 확인하였는데, 이는 오일생산량에도 거의 변함이 없음을 의미하므로, 이러한 배양방법, 즉 카로티노이드 계열의 항산화색소 생산 향상을 위한 LED 조사 및 온도 변환(shift)에 의한 배양방법은 매우 간단하지만 극대의 효과를 얻을 수 있는 공정적 방법으로 향후 다양하게 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
Figure 112016107881860-pat00006
한국생명공학연구원 KCTC13089BP 20160829

Claims (8)

  1. 베타카로틴(Beta-carotene), 에키네논(Echinenone), 칸타잔틴(Canthaxanthin) 및 아스타잔틴(Astaxanthin)인 카로티노이드 계열의 항산화 색소 중 베타카로틴 생산량이 가장 높고, 지방산 총 중량 기준으로 40~45% DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 바이오오일을 고생산하는 돌연변이 미세조류인 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SHG104 균주(기탁번호: KCTC 13089BP).
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주를 LED 백색광 조사하에서 26~30에서 1~3일 배양한 후 18~22에서 1~3일 배양하는 온도 변환(shift) 단계를 포함하는 베타카로틴(Beta-carotene), 에키네논(Echinenone), 칸타잔틴(Canthaxanthin) 및 아스타잔틴(Astaxanthin)의 카로티노이드 계열의 항산화 색소의 대량생산 방법.
  4. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 베타카로틴(Beta-carotene), 에키네논(Echinenone), 칸타잔틴(Canthaxanthin) 및 아스타잔틴(Astaxanthin)의 카로티노이드 계열의 항산화 색소 생산용 미생물제제.
  5. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 어류용 사료 첨가제.
  6. 제1항의 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 베타카로틴(Beta-carotene), 에키네논(Echinenone), 칸타잔틴(Canthaxanthin) 및 아스타잔틴(Astaxanthin)의 카로티노이드 계열의 항산화 색소를 분리하는 것을 특징으로 하는 베타카로틴(Beta-carotene), 에키네논(Echinenone), 칸타잔틴(Canthaxanthin) 및 아스타잔틴(Astaxanthin)의 카로티노이드 계열의 항산화 색소의 생산 방법.
  7. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항산화용 기능성식품 조성물.
  8. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 포함한 바이오오일 생산용 미생물제제.
KR1020160146423A 2016-11-04 2016-11-04 카로티노이드 계열의 항산화 색소 및 dha를 포함한 바이오오일을 고생산하는 돌연변이 미세조류인 스키조키트리움 속 shg104 균주 및 이의 용도 KR101847551B1 (ko)

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