WO2023080399A1 - 세포 내 오일 추출이 용이한 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법 - Google Patents

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schizochytrium
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정아영
곽준석
강혜원
유애진
김지영
신원섭
장성훈
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    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the present application relates to a novel Schizochytrium sp. strain, which is easy to extract intracellular oil, and a method for producing oil containing omega 3 using the same.
  • Thraustochytrid survives and distributes in various environments in nature. It adheres to organisms and lives symbiotically, or floats in marine environments or freshwater and brackish water environments, and survives by distributing to various sedimentary terrain layers. These thraustochytrids belong to the lowest tier of the marine ecological food chain, and are also classified as organoheterotrophic protist microalgae as phytoplankton. Thraustochytrids in the natural environment are functionally responsible for the circulation and purification of natural circulating elements such as sulfur, nitrogen, phosphorus, and potassium.
  • PUFA polyunsaturated fatty acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid are essential fatty acids for the brain, eye tissue and nervous system, and are known to play an important role in the development of the nervous system, such as vision and motor nerve ability in infants, and prevention of cardiovascular diseases. It is the most abundant component of the structural lipids of the brain.
  • the main source of polyunsaturated fatty acids is fish oil extracted from the oil of blue fish such as mackerel, saury, tuna, horse mackerel, sardine, and herring, which is also very useful as a fish feed such as saltwater fish initial feed.
  • the extraction and intake of polyunsaturated fatty acids from fish oil has been developed industrially, but there are also disadvantages.
  • the quality of fish oil varies depending on the species, season, and fishing location, and it is difficult to supply it continuously because it is generated through fishing.
  • there are limitations in the manufacturing process and production volume due to contamination by heavy metals and organic chemicals contained in fish oil, fishy smell peculiar to fish oil, and oxidation of double bonds during the processing process.
  • microalgae can provide several advantages over fish oil in addition to their ability to naturally synthesize fatty acids anew. It is possible to supply stably through industrial scale cultivation, and it is possible to manufacture biomass having a relatively constant biochemical composition. Unlike fish oil, lipids produced by microalgae do not have any unpleasant odor. It also has a simpler fatty acid composition compared to fish oil, which facilitates the steps to isolate the major fatty acids.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • ARA arachidonic acid
  • DPA docosapentaenoic acid
  • DPA docosapentaenoic acid
  • ⁇ -linolenic acid a kind of marine microalgae.
  • Polyunsaturated fatty acids are produced by microorganisms of the genus Thraustochytrium and Schizochytrium.
  • a method for producing omega-3 polyunsaturated fatty acids using PTA10208 (Schizochytrium sp. PTA10208) has been disclosed (U.S. Patent No. 5,130,242), and additionally, a microorganism of the genus Trauzochytrium, Trauzochytrium sp.
  • a method for producing docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid using ATCC10212 Thraustochytrium sp. PTA10212
  • the novel microalgae of the genus Skizochytrium may be CD01-2147 microalgae (Accession No. KCTC14661BP) of the genus Skizochytrium.
  • Another example of the present application provides biomass or bio-oil derived from microalgae of the genus Schizochytrium.
  • feed composition comprising biomass, bio-oil, or a combination thereof derived from microalgae of the genus Schizochytrium.
  • Another example of the present application provides a food composition comprising biomass, bio-oil, or a combination thereof derived from microalgae of the genus Schizochytrium.
  • Another example of the present application provides a method for producing biomass or bio-oil derived from microalgae of the genus Schizochytrium.
  • Another example of the present application provides a use for producing biomass or bio-oil of the microalgae of the genus Schizochitrium.
  • Another example of the present application provides a use for preparing a feed composition or food composition of the microalgae of the genus Schizochitrium.
  • One example of the present application provides a novel Schizochytrium sp. microalgae.
  • Thraustochytrid refers to microalgae of the order Thraustochytriales.
  • Schizochytrium sp is one of the genus names belonging to the Thraustochytriaceae family of the Thraustochytriales order, and the term “ Schizochytrium sp.")" and can be mixed.
  • microalgae is a small algae that cannot be seen with the naked eye and can only be seen through a microscope, and refers to living organisms that freely float in water. There are various types of microalgae, including strains that cannot photosynthesize and grow only as heterotrophs.
  • a wild-type CD01-1821 strain of the genus Schizochytrium is irradiated with gamma rays to generate mutations, and among the mutant strains, a strain with improved production ability of polyunsaturated fatty acid-containing oil is selected, and this strain is selected from the genus Schizochytrium sp.
  • CD01-2147 and on August 23, 2021, it was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, an international depository institution under the Budapest Treaty (Korean Collection for Type Cultures: KCTC), and was given accession number KCTC14661BP.
  • the novel genus Schizochytrium ( Schizochytrium sp.) Microalgae may be CD01-2147 microalgae (Accession No. KCTC14661BP) of the genus Schizochytrium.
  • the wild-type strain of the genus Schizochytrium may have the 18s rRNA nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the microalgae of the genus Schizochytrium is a nucleotide sequence showing at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 It may have 18S rRNA constituting, but is not limited thereto.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • ALA alpha-linolenic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • EPA is one of polyunsaturated fatty acids having a chemical formula of C 20 H 30 O 2 , and corresponds to omega-3 fatty acids together with ALA and DHA, It may also be abbreviated as 20:5 n-3.
  • the microalgae of the genus Schizochytrium may produce and/or contain 35 to 60% by weight of DHA based on the total weight of fatty acids.
  • the microalgae of the genus Schizochitrium are 40 to 60% by weight, 45 to 60% by weight, 50 to 60% by weight, 35 to 58% by weight, 40 to 58% by weight, 45 to 60% by weight based on the total weight of fatty acids. 58% by weight, or 48 to 52% by weight of DHA.
  • the microalgae of the genus Schizochytrium may produce and/or contain 0.1 to 2% by weight of EPA based on the total weight of fatty acids.
  • the microalgae of the genus Schizochitrium are 0.2 to 2% by weight, 0.2 to 1.5% by weight, 0.2 to 1% by weight, 0.3 to 2% by weight, 0.3 to 1.5% by weight, 0.3 to 1.5% by weight based on the total weight of fatty acids. 1 wt%, 0.4 to 2 wt%, 0.4 to 1.5 wt%, 0.4 to 1 wt% or 0.4 to 0.7 wt% EPA.
  • the CD01-2147 microalgae of the genus Schizochytrium may be composed of glutamic acid, phenylalanine, lysine, alanine, valine, arginine, methionine, aspartic acid, glycine, leucine, isoleucine and serine.
  • microalgae of the genus Skizochytrium the culture of the microalgae, the dried product of the culture, or the biomass or bio-oil derived from microalgae of the genus Skizochytrium, including the lysate of the dried product to provide.
  • microalgae of the genus Schizochytrium are as described above.
  • biomass refers to living organisms such as plants, animals, and microorganisms that can be used as chemical energy, that is, an energy source of bioenergy, and ecologically refers to a specific energy source that exists within a unit time and space. It also means the weight or energy amount of living things.
  • the biomass includes, but is not limited to, compounds secreted by cells, and may contain cells and/or intracellular contents as well as extracellular materials.
  • the biomass may be a product produced by culturing or fermenting the microalgae itself, a culture thereof, a dried product thereof, a lysate thereof, or the microalgae of the genus Skizochytrium, or a concentrate of the biomass or It may be a dried product, but is not limited thereto.
  • the "culture” of microalgae in the genus Schizochytrium refers to a product produced by culturing the microalgae, specifically, it may be a culture medium containing microalgae or a culture filtrate from which microalgae are removed from the culture medium, It is not limited thereto.
  • the "dried product" of the microalgae culture of the genus Schizochytrium is one from which moisture is removed from the microalgae culture, for example, it may be in the form of a dry cell cell of the microalgae, but is not limited thereto.
  • the "crushed material" of the dried material is a generic term for the result of crushing the dried material from which moisture is removed from the microalgae culture, and may be, for example, dry cell powder, but is not limited thereto.
  • the culture of microalgae of the genus Schizochytrium may be prepared by inoculating the microalgae in a microalgae culture medium and culturing methods known in the art, and dried products of the culture and lysates thereof are also known in the art. It can be prepared according to the treatment or drying method of microalgae or culture medium.
  • the biomass derived from microalgae of the genus Skizochytrium is 40 to 85% by weight, 45 to 80% by weight, 50 to 75% by weight, 50 to 70% by weight, based on the total weight of biomass, 54 to 66% by weight of crude fat It may contain.
  • the biomass derived from microalgae of the genus Skizochytrium may contain 1 to 20% by weight, 3 to 17% by weight, 5 to 15% by weight, or 7 to 13% by weight of crude protein based on the total weight of biomass. .
  • the biomass derived from microalgae of the genus Schizochytrium may contain 35% by weight or more, or 35 to 60% by weight of DHA based on the total weight of fatty acids, and 0.1% by weight or more, or 0.1% by weight based on the total weight of fatty acids. to 2% by weight of EPA, and 30 to 40% by weight or more of palmitic acid based on the total weight of fatty acids.
  • the biomass derived from microalgae of the genus Schizochytrium may have an oil recovery rate of 55 to 95%, 55 to 90%, 57 to 88%, or 59 to 88% based on the total weight of biomass, but is limited thereto no.
  • the oil recovery rate can be measured by treatment with protease, cellulase, pectinase or chitinase, preferably by treatment with Alcalase. However, it is not limited thereto.
  • the oil recovery rate means the amount of oil that can be extracted when oil is extracted through an experiment among the intracellular oil content, that is, the crude fat content.
  • the “crude fat content” may be used interchangeably with “crude fat content” or “total lipids” or “total fatty acids” or “TFA” or “oil content”.
  • the biomass may be produced by a method for producing biomass derived from microalgae of the genus Schizochytrium according to one aspect.
  • compositions comprising CD01-2147 microalgae of the genus Schizochytrium sp., a culture of the microalgae, a dried product of the culture, and a lysate of the dried product.
  • the composition may include biomass, bio-oil, or a combination thereof derived from microalgae of the genus Schizochytrium.
  • Another aspect of the present application provides a feed composition comprising biomass derived from CD01-2147 microalgae of the genus Schizochytrium sp., or a concentrate or dried product of the biomass.
  • microalgae of the genus Schizochytrium, biomass, the culture of the microalgae, the dried product of the culture, and the lysate of the dried product are as described above.
  • the concentrate or dried product of the biomass may be prepared according to methods for treating, concentrating, or drying microbial biomass known in the art.
  • bio-oil refers to oil obtained from biomass by biological, thermochemical and physicochemical extraction processes, and the bio-oil prepared in this application contains polyunsaturated fatty acids. It may be one, and may specifically contain DHA and EPA, but is not limited thereto.
  • the bio-oil may include an extract of biomass.
  • a method for producing the bio-oil extract a method of utilizing enzymes such as protease, cellulase, pectinase or chitinase according to the method of disrupting or dissolving cell membrane or cell wall components, homogenizer, sonicator, bead treatment
  • a method of physically disrupting cell membranes or cell wall components by using a method, a method of directly adding a solvent and permeating into cells for extraction, and a solventless extraction step of separating through centrifugation after various disruption processes may be used. It is not limited.
  • the composition may be in the form of a solution, powder, or suspension, but is not limited thereto.
  • the composition may be, for example, a food composition, a feed composition or a feed additive composition.
  • feed composition refers to feed fed to animals.
  • the feed composition refers to a material that supplies organic or inorganic nutrients necessary for maintaining the life of animals or producing meat, milk, and the like.
  • the feed composition may additionally include necessary nutrients for maintaining animal life or producing meat, milk, and the like.
  • the feed composition can be prepared with various types of feed known in the art, and specifically, may include concentrated feed, roughage and / or special feed.
  • feed additive is added to feed for various purposes, such as supplementation of nutrients and prevention of weight loss, enhancement of digestibility of fiber in feed, improvement of oil quality, prevention of reproductive disorders and improvement of conception rate, and prevention of high temperature stress in summer.
  • vitamins such as vitamin E, vitamins A, D, E, nicotinic acid, and vitamin B complex, protected amino acids such as methionine and lysine, protected fatty acids such as calcium salts of fatty acids, probiotics (lactic acid bacteria), yeast culture, mold fermentation Probiotics such as water, yeast agents, and the like may be further included.
  • the term "food composition” includes all forms of functional food, nutritional supplements, health food and food additives, and The food composition may be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • Compositions of the present application may include grains such as milled or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; vegetable protein feeds such as feeds based on soybean and sunflower; animal protein feed such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; It may further include sugar and dairy products, for example, dry ingredients composed of various powdered milk and whey powder, and the like, and may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, and the like.
  • composition of the present application may be administered to animals alone or in combination with other feed additives in an edible carrier.
  • the composition can be easily administered to animals as a top dressing or directly mixed with feed, or as an oral formulation separate from feed.
  • a pharmaceutically acceptable edible carrier as is well known in the art.
  • Such edible carriers can be solid or liquid, for example corn starch, lactose, sucrose, soybean flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • a solid carrier the composition may be a tablet, capsule, powder, troche or sugar-containing tablet, or a top dressing in a microdispersible form.
  • a liquid carrier is used, the composition may be in the form of a gelatin soft capsule, or a syrup, suspension, emulsion, or solution.
  • composition of the present application may contain, for example, a preservative, a stabilizer, a wetting or emulsifying agent, a cryoprotectant, or an excipient.
  • the cryoprotectant may be at least one selected from the group consisting of glycerol, trehalose, maltodextrin, skim milk powder and starch.
  • the preservative, stabilizer, or excipient may be included in the composition in an effective amount sufficient to reduce deterioration of microalgae of the genus Schizochytrium included in the composition.
  • the cryoprotectant may be included in the composition in an effective amount sufficient to reduce the degradation of microalgae of the genus Schizochytrium included in the composition when the composition is in a dried state.
  • composition may be used by adding it to animal feed by dripping, spraying or mixing.
  • the composition of the present application can be applied to a number of animal diets, including mammals, birds, fish, crustaceans, cephalopods, reptiles and amphibians, but is not limited thereto.
  • the mammals may include pigs, cows, sheep, goats, laboratory rodents, or pets, and the birds may include poultry, which include chickens, turkeys, ducks, geese, It may include pheasant, or quail, etc., but is not limited thereto.
  • the fish may include commercial livestock fish and their fry, ornamental fish, and the like, and the crustaceans may include shrimp, barnacles, and the like, but are not limited thereto.
  • the composition can be applied to the diet of rotifers, which are zooplankton.
  • Another aspect of the present application is culturing CD01-2147 microalgae of the genus Schizochytrium ( Schizochytrium sp.); and recovering biomass from the microalgae, the culture of the microalgae, the dried product of the culture, or the lysate of the dried product.
  • microalgae of the genus Schizochytrium, biomass, the culture of the microalgae, the dried product of the culture, and the lysate of the dried product are as described above.
  • the term "culture” means to grow the microalgae under appropriately controlled environmental conditions.
  • the culturing process of the present application may be performed according to appropriate media and culture conditions known in the art. This culturing process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected microalgae.
  • the cultivation of microalgae of the genus Schizochytrium of the present application may be performed under heterotrophic conditions, but is not limited thereto.
  • heterotrophic is a nutritional method that relies on organic matter obtained from outside the body as an energy source or nutrient source, and is a term corresponding to autotrophic, and can be used interchangeably with the term 'cancer culture'.
  • the step of culturing the microalgae of the genus Schizochytrium is not particularly limited thereto, but may be performed by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method, or the like.
  • the medium and other culture conditions used for culturing microalgae of the present application any medium used for culturing conventional microalgae may be used without particular limitation.
  • the microalgae of the present application can be cultured while controlling temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing appropriate carbon sources, nitrogen sources, phosphorus, inorganic compounds, amino acids, and/or vitamins.
  • a basic compound eg sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound eg phosphoric acid or sulfuric acid
  • pH eg pH 5 to 9, specifically pH 6 to 8, most specifically may adjust pH 6.8
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without gas injection or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected to maintain the anaerobic and non-aerobic state. It is not limited.
  • the culture temperature may be maintained at 20 to 45 ° C or 25 to 40 ° C, and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • foaming may be suppressed using an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester, but is not limited thereto.
  • the carbon source contained in the medium used in the step of culturing the microalgae of the genus Schizochytrium is any one selected from the group consisting of glucose, fructose, maltose, galactose, mannose, sucrose, arabinose, xylose and glycerol It may be more than one, but if it is a carbon source used for culturing microalgae, it is not limited thereto.
  • the nitrogen source contained in the medium used in the step of culturing the microalgae of the genus Schizochytrium is i) any one or more organic substances selected from the group consisting of yeast extract, beef extract, peptone and tryptone Sowon, or ii) any one or more inorganic nitrogen sources selected from the group consisting of ammonium acetate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea, and MSG (Monosodium glutamate), but used for culturing microalgae As long as it is a nitrogen source, it is not limited thereto.
  • potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium-containing salts corresponding thereto may be individually included or mixed as a phosphorus source, but this Not limited.
  • the step of recovering biomass from the microalgae, the culture of the microalgae, the dried material of the culture, or the lysate of the dried material may be to collect the desired biomass using a suitable method known in the art. For example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, and HPLC may be used, and a purification process may be further included.
  • Another aspect of the present application is culturing CD01-2147 microalgae of the genus Schizochytrium ( Schizochytrium sp.); and recovering lipids from the microalgae, the culture of the microalgae, the dried product of the culture, or the lysate of the dried product.
  • the step of culturing the microalgae, bio-oil, the culture of the microalgae, the dried product of the culture, the lysate of the dried product, and the microalgae in the genus Schizochytrium is as described above.
  • the step of recovering the lipid from the microalgae, the culture of the microalgae, the dried product of the culture, or the lysate of the dried product may be to collect the desired lipid using a suitable method known in the art. For example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, and HPLC may be used, and a purification process may be further included.
  • lipids and lipid derivatives such as fatty aldehydes, fatty alcohols and hydrocarbons (eg alkanes) can be extracted with a hydrophobic solvent such as hexane.
  • Lipids and lipid derivatives can also be extracted using methods such as liquefaction, oil liquefaction and supercritical CO 2 extraction.
  • a known microalgal lipid recovery method includes, for example, i) collecting cells by centrifugation, washing with distilled water, drying by freeze drying, ii) grinding the obtained cell powder, n- There is a method of extracting lipids with hexane (Miao, X and Wu, Q, Biosource Technology (2006) 97:841-846).
  • Another aspect of the present application is genus Schizochytrium ( Schizochytrium sp.) CD01-2147 microalgae, a culture of the microalgae, a dried product of the culture, or a biomass or bio-oil of the lysate of the dried product. provides a use for Schizochytrium ( Schizochytrium sp.) CD01-2147 microalgae, a culture of the microalgae, a dried product of the culture, or a biomass or bio-oil of the lysate of the dried product. provides a use for
  • microalgae of the genus Schizochytrium, biomass, the culture of the microalgae, the dried product of the culture, and the lysate of the dried product are as described above.
  • Another example of the present application is Schizochytrium sp. CD01-2147 microalgae, a culture of the microalgae, a dry product of the culture, or a use for preparing a feed composition or a food composition of a lysate of the dried product.
  • microalgae of the genus Schizochytrium, biomass, the culture of the microalgae, the dried product of the culture, and the lysate of the dried product are as described above.
  • the novel thraustochytrid-based microalgae of the present invention have a high fat content in biomass, and among them, a high content of unsaturated fatty acids such as docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid, so that they can be used by themselves or in culture and fermentation. It is very easy to extract biomass produced by the biomass and fat components including unsaturated fatty acids from the biomass. Accordingly, the microalgae, dried biomass and bio-oil prepared therefrom can be usefully utilized as a composition for feed or a composition for food.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a process for isolating a Thraustochytrid-based microalgae strain.
  • Figure 2 analyzes the total lipid content of 29 species of isolated thraustochytrid microalgae, docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) content in omega-3. This is the diagram showing the result.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • FIG. 3 is a photograph of wild-type Schizochytrium sp. strain CD01-1821 observed under an optical microscope.
  • FIG. 4 is a diagram showing the sugar consumption rate and optical density at 680 nm of wild-type Schizochytrium sp. strain CD01-1821 and four selected mutant strains.
  • Thraustochytrid family of microalgae In order to isolate the Thraustochytrid family of microalgae, environmental samples in the form of seawater, leaves and sediments were collected from a total of 40 areas in the west coast of Korea, Seocheon, Gunsan, Buan and Yeonggwang-gun coastal areas. Sampling was conducted focusing on specific areas where organic sediments were developed and observed, and the collected environmental samples were transported to the laboratory environment within 7 days and bacteria, microorganisms and fungi, except for the Thraustochytrid family microalgae to be separated, Removal of other contaminants such as protozoa was carried out.
  • Thraustochytrid-based microalgal cells were isolated (FIG. 1).
  • the separation and culture medium used in the separation process is a modified YEP medium (yeast extract 0.1 g / L, peptone 0.5 g / L, MgSO 4 7H 2 O 2 g / L, sea salt 50 g /L, H 3 BO 3 5.0mg/L, MnCl 2 3.0mg/L, CuSO 4 0.2mg/L, NaMo 4 2H 2 O 0.05mg/L, CoSO 4 0.05mg/L, ZnSO 4 7H 2 O 0.7 mg/L, 15 g/L of agar) was used. Through several isolation and subculture processes, pure isolated colonies free of contaminants could be obtained. 30 mg/L, penicillin G 0-30 mg/L, kanamycin sulfate 0-30 mg/L) in a solid medium containing a contaminant control and removal process again to obtain pure isolate colonies.
  • YEP medium yeast extract 0.1 g / L, peptone 0.5 g / L, MgSO 4 7
  • the colonies isolated in Example 1 were modified with modified GGYEP medium (glucose 5g/L glycerol 5g/L, yeast extract 0.1g/L, peptone 0.5g/L, MgSO 4 7H 2 O 2g/L, Sea salt 50g/L, H 3 BO 3 5.0mg/L, MnCl 2 3.0mg/L, CuSO 4 0.2mg/L, NaMo 4 2H 2 O 0.05mg/L, CoSO 4 0.05mg/L, ZnSO 4 7H 2 O 0.7mg / L) was incubated for about 2 days in a 250mL flask at 10-35 °C, 100-200rpm conditions.
  • modified GGYEP medium glucose 5g/L glycerol 5g/L, yeast extract 0.1g/L, peptone 0.5g/L, MgSO 4 7H 2 O 2g/L, Sea salt 50g/L, H 3 BO 3 5.0mg/L, MnCl
  • 29 species of microalgae capable of growing at a temperature of 30 ° C or higher, having excellent growth rates and securing a cell mass were selected.
  • the selected microalgae strains were subjected to modified GYEP medium containing 30 g/L of glucose as a carbon source and culture conditions of 30° C., 150 rpm, and 500 ml flask scale culture for 2 days. After confirming that all the carbon sources introduced in the culture environment for 2 days were consumed, the entire culture medium was recovered and dried overnight in a 60° C. dry oven to obtain biomass.
  • the following method was used to analyze the lipid and polyunsaturated fatty acid content of the cultured microalgae cells, and the microalgae-derived fatty acid-containing oil using the dried cells was measured by the following method. After adding 8.3M hydrochloric acid solution (HCl) to 5 g of dried cells to hydrolyze the cell walls of microalgae cells at 80 ° C, 30 mL of ethyl ether and 20 mL of petroleum ether were added, mixed for 30 seconds, and then centrifuged was repeated three or more times. The separated solvent layer was recovered, transferred to a pre-weighed round flask, and then the solvent was removed through nitrogen purging and cooled in a desiccator (Desicator) to a constant weight.
  • HCl hydrochloric acid solution
  • the weight of the dried oil was measured by subtracting the weight of the empty flask from the weight of the flask to calculate the total oil content.
  • the content of docosahexaenoic acid (DHA) contained in the oil was pretreated with methanolic 0.5N NaOH and 14% trifluoroboranemethanol (BF 3 ) and was measured by gas chromatography.
  • Biomass in Table 1 below means the cell concentration in the culture medium, and may be used in combination with DCW (dry cell weight) in Table 2 below.
  • TFA in the table above means total fatty acid, and may be used in combination with crude fat content, crude fat content, or total lipid.
  • the seed cultured flask was dispensed and inoculated into a 5L incubator.
  • a glucose carbon source of 28% compared to the total culture medium was supplied, cultured for about 72 hours, and cultured in a sterilized MJW02 medium and culture environment at 30 ° C, 500 rpm, 1.5 vvm, and pH 5-8.
  • the CD01-1821 strain had a higher total biomass production and crude fat content than the CD01-1822 strain under the same fermentation conditions. It was confirmed that it is easier for the scale-up process because it is high. Accordingly, the CD01-1821 strain was selected and utilized for strain sequence identification and additional strain development. The morphology of the selected CD01-1821 strain was observed using an optical microscope and is shown in FIG. 3 .
  • glucose is mainly used as a raw material for the carbon source.
  • Glucose at this time is a monosaccharide in a refined form of 90% or more, and its cost is higher during fermentation on an industrial scale than other carbon source raw material components.
  • the CD01-1821 strain and the CJM01 (registered patent 10-2100650) strain selected in Example 2 were fermented in raw sugar containing glucose, fructose or sucrose as the main component. Evaluation of fermentation culture was performed to confirm the culture characteristics. Cultivation was carried out in a 30L incubator, and the main carbon source components were glucose 450 g/L, glucose 225 g/L and fructose 225 g/L mixture, glucose 225 g/L, fructose 220 g based on the modified MJW02 medium. /L and raw sugar decomposition products containing 1.51 g/L of sulfate were tested, respectively. The culture conditions were set identically to 30 ° C., 500 rpm, 1.5 vvm, and pH 5-8 conditions, and 35% of the carbon source of the total culture volume was supplied, respectively.
  • the CD01-1821 strain showed equal or higher levels of total biomass production and crude fat content even when fermented under the conditions of a fructose mixture or a raw sugar hydrolyzate medium rather than a glucose monocomponent.
  • the CJM01 strain showed a diauxic growth form of dualized carbon source consumption and cell growth pattern as sugar components other than glucose components were added to the medium, and the total culture time was prolonged.
  • the CD01-1821 strain was able to confirm the possibility of scaled-up fermentation under complex carbon source conditions.
  • PCR amplification was performed using primers 18s-Fwd and LABY-ARev for gene amplification of the 18s rRNA site described in Table 4. .
  • sequence number primer Sequence (5' - 3') 2 18S-Fwd AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT 3 LABY-ARev GGG ATC GAA GAT GAT TAG
  • the PCR reaction was denatured at 95 ° C for 5 minutes using a reaction solution containing taq polymerase, followed by 35 cycles of denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 50 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 2 minutes, Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the reaction solution amplified through the PCR process was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm that a DNA fragment of about 1000 bp size was amplified, and sequencing analysis was performed. The sequence obtained as a result of the analysis was searched by NCBI BLAST, and the Schizochytrium limacinum strain belonging to the Thraustochytrid family microalgae.
  • the isolated microalgae CD01-1821 is a novel strain of the genus Schizochytrium, and it was named the strain CD01-1821 of the genus Schizochytrium ( Schizochytrium sp.), and as of August 23, 2021, Korea Biotechnology It was deposited with the Institute of Biological Resources Center (Korean Collection for Type Cultures: KCTC) and was given accession number KCTC14660BP.
  • Example 5-1 Mortality measurement according to gamma ray irradiation
  • the gamma-ray irradiation conditions were selected by measuring the mortality rate according to the gamma-ray dose.
  • the novel microalgae CD01-1821 were cultured for about 10 hours in a modified GGYEP medium containing 5 g/L of glucose and glycerol, respectively. This period is judged to be the Early Exponential phase phase in which zoospores observed on the life cycle of microalgae of the Thraustochytrid family are mainly generated and distributed, and more efficient genetics For red mutation, the cell culture medium of the corresponding period was obtained and used. The culture medium sample was centrifuged (4000 rpm, 20 minutes) to harvest only the cells from which the culture medium was removed, and suspended in 0.1M phosphate buffer solution containing 1.5% NaCl to be 10 9 cells/mL.
  • Microalgae cell samples suspended in the NaCl 1.5%-0.1M phosphate buffer were used in gamma-ray-derived artificial mutant strain development experiments.
  • the gamma ray irradiation experiment was conducted at the Advanced Radiation Research Institute of the Korea Atomic Energy Research Institute, and was conducted by irradiating a gamma ray dose of 5 to 8 kGY.
  • the gamma-irradiated suspension sample undergoes a recovery process overnight, then is inoculated and spread on GYEP medium containing 20 g/L of agar, incubated at 30°C for about 5 days, and then the number of growing colonies is counted to determine the amount of gamma dose. Star mortality was measured.
  • Mortality (%) [ ⁇ (Number of colonies in the untreated area) - (Number of colonies in the treated area) ⁇ /(Number of colonies in the untreated area)] X 100
  • the appropriate dose at which the number of growing colonies and the CFU value of the number of viable cells were reduced by 95% or more according to the dose of gamma ray irradiation was confirmed. Specifically, 91.1%, 95.3%, 100%, and 100% of the cells were killed at gamma-ray irradiation doses of 6.5, 7.0, 7.5, and 8.0 kGY, respectively. In the gamma-ray dose condition of 7.5 GY or more, all were killed and microalgae colonies could not be secured, and a gamma-ray dose condition of 7.0 kGY showing a mortality rate of 95.3% was selected.
  • the microalgae culture medium sample was treated with 20 g/L of agar and a cycloacid that inhibits fatty acid synthesis ( Cycloate) was cultured in GYEP medium.
  • a cycloacid that inhibits fatty acid synthesis Cycloate
  • Microalgal colonies grown during the culture period of about 4 weeks were selected and subcultured in the same medium and culture environment conditions. Strains capable of continuous growth between passages and excellent colony growth were preferentially selected. In addition, morphologically white and slippery colonies were selected.
  • the mutant strains selected in Example 5-2 were cultured on a flask scale to analyze the sugar consumption rate, and excellent mutant strains were selected through crude fat and fatty acid analysis.
  • the final volume in a 500mL flask was set to 50mL, and glucose In a GYEP medium containing 30 g/L, cultured at 30° C. and 180 rpm for 20 hours to obtain a certain amount of cells that can be analyzed.
  • glucose In a GYEP medium containing 30 g/L, cultured at 30° C. and 180 rpm for 20 hours to obtain a certain amount of cells that can be analyzed.
  • the amount of remaining glucose and optical density at 680 nm were analyzed, and through this, the rate of sugar consumption was measured.
  • the 4 strains selected above were re-evaluated in a 5L fermenter.
  • the GYEP medium culture containing 30 g / L was used as a seed culture, and it was divided into a 5L fermenter containing sterilized MJW02 medium and cultured at 30 ° C., 500 rpm, 1.5 vvm, and pH 5-8 conditions.
  • CD01-2147 the strain with the best growth, was measured and evaluated for the consumption rate of glucose, a major carbon source, and optical density and dry cell weight (g/L), which are identified as growth indicators, during the 15-hour cultivation period. Final selection.
  • CD01-2147 in the skijochytrium was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Korean Collection for Type Cultures: KCTC) as of August 23, 2021, and was given accession number KCTC14661BP.
  • Example 6-1 Cultivation of strain CD01-1821 and strain CD01-2147
  • the strain CD01-2147 of the genus Skizochytrium was cultured for 60 hours in a 5L fermentor by supplying 35% of the total culture medium as a glucose carbon source.
  • sterilized MJW02 medium was used and cultured in a 500 mL flask at 30 ° C. and 150 rpm for about 20 hours.
  • the seed cultured flask was dispensed and inoculated into a 5L fermentor, and cultured in a sterilized MJW02 medium and culture environment at 30 ° C., 500 rpm, 1.5 vvm, and pH 5-8 conditions. After the completion of the culture, the cells from which the supernatant was removed were used in experiments for measuring the content of crude fat, fatty acid, and crude protein, and extracting and recovering intracellular oil.
  • Example 6-2 Crude Fat and Fatty Acid Content Analysis of CD01-1821 and CD01-2147 Culture Fluid Samples
  • Example 6-1 the intracellular crude fat and fatty acid contents were analyzed in the same manner as described in Example 2.
  • C16 0 means palmitic acid
  • omega-3 fatty acid means the sum of docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid.
  • Example 6-3 Crude protein content analysis of culture medium samples of CD01-1821 and CD01-2147 strains
  • each dried fermentation broth (sample) corresponding to about 20 to 30 mg were precisely measured and placed in a digestion tube, and 2 tablets of a digestion promoter were added.
  • the decomposition promoter is efficiently decomposed when the ratio of sulfuric acid (H 2 SO 4 ) and potassium sulfate (K 2 SO 4 ) is 1.4 to 2.0:1.0.
  • 12 to 15 mL of concentrated sulfuric acid (H 2 SO 4 ) is added to the digestion tube and digested for 45 to 60 minutes in a digestion device at 420 ° C. When it became transparent yellow (in the case of using a selenium catalyst), it was cooled to room temperature. After cooling, 80 mL of distilled water was added to the decomposed test solution.
  • the distillate was titrated using a hydrochloric acid solution (usually 0.1N or 0.2N) until the end point reached a pale pink color, and the amount of acid used for titration was recorded. In the case of an automatic device, distillation, titration, and calculation are all performed automatically. Nitrogen% was derived by the following formula 2 using the above experimental results. Protein quantification was indicated by multiplying the previously derived nitrogen % by the average nitrogen coefficient of 6.25.
  • Nitrogen (%) ⁇ (amount of HCl mL - blank test mL) x M x 14.01/sample amount mg ⁇ x 100
  • Boric acid solution 1% (or 4%) boric acid solution diluted to 10L by adding 100g (or 400g) of H 3 BO 3 , 100mL of 0.1% bromocresol green solution, and 100mL of 0.1% methyl red solution.
  • the crude protein content in CD01-2147 dried cells was 10%.
  • the amino acid content in dried cells was highest in glutamic acid, followed by phenylalanine, lysine, alanine, valine, arginine, methionine, aspartic acid, glycine, leucine, isoleucine, and serine.
  • the amino acids in the dried CD01-2147 cells were composed of glutamic acid, phenylalanine, lysine, alanine, valine, arginine, methionine, aspartic acid, glycine, leucine, isoleucine, and serine.
  • Example 6-4 Oil recovery analysis of CD01-1821 strain and CD01-2147 strain fermentation broth
  • an oil extraction experiment was conducted for the cultured microalgae fermentation broth. After warming the culture medium to 60 °C, the pH was adjusted to 7 using a NaOH 50% solution. 0.2% (w/w) of Alcalase (Alcalase 2.4FG, Novozymes) was added to the weight of the fermentation broth, followed by stirring at 60° C. for 3 hours. The recovery rate from the oil of the supernatant obtained by centrifuging the enzyme-reacted fermentation broth at 3800 g was compared.
  • the oil recovery rate means the amount of oil that can be extracted when oil is extracted through an experiment among the intracellular oil content, that is, the crude fat content.
  • DCW crude fat content Crude Protein Content oil recovery rate (g/L) (%, /Biomass) (%, /Biomass) (%, /crude fat mass) CD01-1821 119 57 17 38 CD01-2147 148 65 10 87
  • Example 7 Schizochytrium sp. Identification of culture characteristics of strain SR21 and mutant strain CD01-2147 of the genus Schizochytrium
  • Example 7-1 Cultivation of strain SR21 and strain CD01-2147
  • Example 7-2 Oil recovery analysis of strain SR21 and strain CD01-2147 fermentation broth
  • an oil extraction experiment was conducted for the cultured microalgae fermentation broth. After warming the culture medium to 60 °C, the pH was adjusted to 7 using a NaOH 50% solution. In comparison to the cell concentration in the fermentation broth, 15% (w/w) of Alcalase (Alcalase 2.4FG, Novozymes) was added and reacted at 60 ° C. for 3.5 hours with stirring. The enzyme-reacted fermentation broth was centrifuged at 3800 g to recover oil in the supernatant. It was confirmed that the recovered supernatant was a layer in which oil and emulsified substances were mixed. The supernatant was heat-treated for 30 minutes while stirring at 75° C., and then centrifuged at 3800 g to recover oil from the supernatant.
  • Alcalase Alcalase 2.4FG, Novozymes
  • DCW crude fat content Crude Protein Content oil recovery rate (g/L) (%, /Biomass) (%, /Biomass) (%, /crude fat mass) CD01-2147 167 55 12 60 SR21 159 56 27 23

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Abstract

본 출원은 세포 내 오일 추출이 용이한 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규한 스키조키트리움 속 미세조류는 바이오매스 중 지방 함량이 높고, 그 중에서도 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산과 같은 불포화지방산의 함량이 높아, 그 자체 또는 배양 및 발효에 의해 생산된 바이오매스 및 바이오매스로부터의 불포화지방산을 포함한 지방 성분의 추출이 매우 용이하다. 이에, 상기 미세조류, 이로부터 제조되는 바이오매스 건조물 및 바이오오일은 사료용 조성물 또는 식품용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

세포 내 오일 추출이 용이한 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2021년 11월 8일자 한국특허출원 제10-2021-0152560호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며， 해당 한국 특허 출원의 문헌들에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 출원은 세포 내 오일 추출이 용이한 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법에 관한 것이다.
트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 자연계 내의 다양한 환경에서 생존 및 분포하고 있다. 유기체에 부착하여 공생을 하거나, 해양 환경 또는 담수, 기수 환경에 부유하기도 하며, 다양한 퇴적지형 층에 분포하여 생존한다. 이러한 트라우스토키트리드는 해양 생태 먹이사슬의 최하위 계층에 속하며, 식물성 플랑크톤으로서 유기종속영양 원생생물 미세조류로 분류되기도 한다. 자연 환경 내에서의 트라우스토키트리드는 기능적으로 황(Sulfur), 질소(Nitrogen), 인(Phosphorous), 칼륨(Potassium)등의 자연계 순환 원소의 순환과 정화 역할을 담당한다. 또한, 오메가-3로 분류되는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)을 포함하는 다중불포화지방산(polyunsaturated fatty acid: PUFA)을 고농도로 함유하여 해양생태계에 공급원으로서 기능을 한다.
사람을 포함한 대부분의 고등생물은 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산을 포함하는 다중불포화지방산을 자체적으로 합성하지 못하기 때문에 필수영양소로 섭취해야 한다. 다중불포화지방산 중 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산은 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동신경능력 등 신경체계 발달 및 심혈관 질환 예방에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, 뇌의 구조적 지질에 가장 풍부한 구성요소이다.
지금까지 다중불포화지방산의 주요 공급원은 고등어, 꽁치, 참치, 전갱이, 정어리, 청어 등과 같은 등 푸른 생선의 기름에서 추출된 어유이며, 이는 해수 어류 초기 먹이와 같은 양어 사료로서도 매우 유용하다. 어유로부터의 다중불포화지방산 추출 및 섭취는 산업적으로 발달되었으나 단점 역시 존재한다. 어유의 품질은 어종, 계절, 어획 위치에 따라서 다양하며, 어획을 통해 발생되기 때문에 지속적으로 공급하는 데에 어려움이 있다. 또한, 어유 내 포함된 중금속 및 유기화학 물질에 의한 오염 문제, 어유 특유의 비린내는 물론 가공 공정 중에 이중결합이 산화되는 문제 등으로 제조 과정 및 생산량의 제한이 있다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 최근 미생물 배양에 의한 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산을 포함한 다중불포화 지방산의 제조방법에 대한 연구가 진행되고 있다. 특히, 미세조류는 자연적으로 지방산을 새로이 합성한다는 능력 외에도 어유에 비해 여러가지 이점을 제공할 수 있다. 산업적 스케일의 배양을 통해 안정적으로 공급이 가능하며, 상대적으로 일정한 생화학적 조성을 갖는 바이오매스의 제조를 가능하게 한다. 어유와는 달리, 미세조류에 의해 제조되는 지질은 임의의 불쾌한 취를 갖지 않는다. 또한, 어유에 비해 단순한 지방산 조성을 갖으며, 이는 주요한 지방산을 분리하기 위한 단계를 수월하게 한다.
이러한 장점을 바탕으로, 최근 미세조류를 이용한 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA), 에이코사펜타엔산 (Eicosapentaenoic acid, EPA), 아라키돈산(Arachidonic acid, ARA), 도코사펜타엔산 (Docosapentaenoic acid, DPA), 및 α-리놀렌산 등과 같은 오메가-3 불포화 지방산(ωunsaturated fatty acid)을 포함하는 다중불포화 지방산 생산에 관한 연구 및 산업화가 매우 빠르게 진행되고 있으며, 주로 해양미세조류의 일종인 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 및 스키조카이트리움(Schizochytrium) 속 미생물에 의한 다중불포화지방산 생산이다. 실례로, 스키조카이트리움속 미생물인 스키조카이트리움 sp. ATCC20888 (Schizochytrium sp. ATCC20888) 및 스키조카이트리움 sp. PTA10208 (Schizochytrium sp. PTA10208)를 이용하여 오메가-3 다중불포화지방산을 제조하는 방법을 개시되었으며 (미국특허 제5,130,242호), 추가적으로 트라우조카이트리드 계 트라우조카이트리움 속 미생물인 트라우조카이트리움 sp. ATCC10212 (Thraustochytrium sp. PTA10212)를 이용하여 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산을 제조하는 방법을 개시되었다.
본 출원의 일 예는 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 미세조류를 제공한다. 일 구체에서, 상기 신규한 스키조키트리움 속 미세조류는 스키조키트리움 속 CD01-2147 미세조류(기탁번호 KCTC14661BP)일 수 있다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 또는 바이오오일을 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스, 바이오오일, 또는 이들의 조합을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스, 바이오오일, 또는 이들의 조합을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 또는 바이오오일 제조방법을 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류의 바이오매스 또는 바이오오일을 제조하기 위한 용도를 제공한다.
본 출원의 또 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류의 사료 조성물 또는 식품 조성물을 제조하기 위한 용도를 제공한다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 일 예는 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 미세조류를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "트라우스토키트리드(Thraustochytrid)"는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목의 미세조류를 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.)"은 트라우스토키트리알레스 목의 트라우스토키트리아세애(Thraustochytriaceae) 과에 속하는 속명 중 하나로, 용어 "스키조키트리움 속(genus Schizochytrium)"과 혼용될 수 있다. 또한, 상기 용어 "미세조류(microalgae)"는 육안으로 볼 수 없어 현미경을 통해서만 볼 수 있는 수준의 작은 조류이며, 물 속에서 자유로이 부유하여 살아가는 생물을 의미한다. 상기 미세조류에는 다양한 종류가 있으며, 광합성이 불가능하여 종속영양으로만 생장하는 균주까지 포함한다.
본 출원에서는 일 예로, 야생형 스키조키트리움 속 CD01-1821 균주에 감마선을 조사하여 돌연변이를 발생시키고, 상기 돌연변이 균주 중 다중불포화지방산 함유 오일의 생산능이 향상된 균주를 선별하여, 이를 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-2147로 명명하였고, 2021년 8월 23일자로 부다페스트 조약 하의 국제 기탁 기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC14661BP를 부여받았다.
따라서, 본 명세서에 있어서, 상기 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 미세조류는 스키조키트리움 속 CD01-2147 미세조류(기탁번호 KCTC14661BP)일 수 있다.
또한, 상기 야생형 스키조키트리움 속 균주는 서열번호 1의 18s rRNA 염기서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 미세조류는 서열번호 1의 염기서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 염기서열로 구성되는 18S rRNA를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA)"은 C22H32O2의 화학식을 갖는 다중불포화지방산 중 하나로, 알파-리놀렌산(α-linolenic acid: ALA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)과 함께 오메가-3 지방산에 해당하며, 관용명은 세르본산(cervonic acid)이고, 약칭으로 22:6 n-3으로도 표기될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)"은 C20H30O2의 화학식을 갖는 다중불포화지방산 중 하나로, ALA 및 DHA와 함께 오메가-3 지방산에 해당하며, 약칭으로 20:5 n-3으로도 표기될 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 35 내지 60 중량%의 DHA를 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 40 내지 60 중량%, 45 내지 60 중량%, 50 내지 60 중량%, 35 내지 58 중량%, 40 내지 58 중량%, 45 내지 58 중량%, 또는 48 내지 52 중량%의 DHA를 생산하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 0.1 내지 2 중량%의 EPA를 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 0.2 내지 2 중량%, 0.2 내지 1.5 중량%, 0.2 내지 1 중량%, 0.3 내지 2 중량%, 0.3 내지 1.5 중량%, 0.3 내지 1 중량%, 0.4 내지 2 중량%, 0.4 내지 1.5 중량%, 0.4 내지 1 중량% 또는 0.4 내지 0.7 중량%의 EPA를 생산하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 CD01-2147 미세조류는 글루탐산, 페닐알라닌, 리신, 알라닌, 발린, 아르기닌, 메티오닌, 아스파르트산, 글라이신, 류신, 이소류신 및 세린으로 구성되는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 스키조키트리움 속 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 또는 바이오오일을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오매스(biomass)"는 화학적 에너지로 사용 가능한 식물, 동물, 미생물 등의 생물체, 즉 바이오에너지의 에너지원을 의미하며, 생태학적으로 단위 시간 및 공간 내에 존재하는 특정 생물체의 중량 또는 에너지량을 의미하기도 한다. 또한, 상기 바이오매스는 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 세포외 물질뿐만 아니라 세포 및/또는 세포 내 내용물을 함유하는 것일 수 있다. 본 출원에서 상기 바이오매스는 스키조키트리움 속 미세조류 그 자체, 이의 배양물, 이의 건조물, 이의 파쇄물, 또는 상기 미세조류를 배양하거나 발효하여 생산된 산물일 수 있으며, 또는 상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류의 "배양물"은 상기 미세조류를 배양하여 생성된 산물을 지칭하는 것으로, 구체적으로 미세조류를 포함하는 배양액 또는 상기 배양액에서 미세조류가 제거된 배양여액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 스키조키트리움 속 미세조류 배양물의 "건조물"은 상기 미세조류 배양물에서 수분이 제거된 것으로, 예를 들어 상기 미세조류의 건조 균체 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 건조물의 "파쇄물"은 상기 미세조류 배양물에서 수분이 제거된 건조물을 파쇄한 결과물을 총칭하는 것으로, 예를 들어 건조 균체 분말일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 스키조키트리움 속 미세조류의 배양물은 미세조류 배양 배지에 상기 미세조류를 접종하고, 당업계에 공지된 배양 방법에 따라 제조될 수 있고, 상기 배양물의 건조물 및 이의 파쇄물 역시 당업계에 공지된 미세조류 또는 배양액의 처리 또는 건조 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 바이오매스 총 중량을 기준으로 40 내지 85 중량%, 45 내지 80 중량%, 50 내지 75 중량%, 50 내지 70 중량%, 는 54 내지 66 중량%의 조지방을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 바이오매스 총 중량을 기준으로 1 내지 20 중량%, 3 내지 17 중량%, 5 내지 15 중량%, 또는 7 내지 13 중량%의 조단백을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 지방산 총 중량을 기준으로 35 중량% 이상, 또는 35 내지 60 중량%의 DHA를 포함하는 것일 수 있고, 지방산 총 중량을 기준으로 0.1 중량% 이상, 또는 0.1 내지 2 중량%의 EPA를 포함하는 것일 수 있고, 지방산 총 중량을 기준으로 30 내지 40 중량% 이상의 팔미트산을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 바이오매스 총 중량을 기준으로 55 내지 95%, 55 내지 90%, 57 내지 88%, 또는 59 내지 88%의 오일 회수율을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 오일 회수율은 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase), 펙티나아제(pectinase) 또는 키티나아제(chitinase)를 처리하여 측정될 수 있고, 바람직하게는 알칼라아제(Alcalase)를 처리하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 오일 회수율은 세포 내 오일 함유량, 즉 조지방 함량 중, 실험을 통해 오일을 추출하였을 때 추출 가능한 오일의 양을 의미한다.
상기 “조지방 함량”은 “조지방량” 또는 “총 지질” 또는 “총 지방산” 또는 “TFA” 또는 “오일 함유량”과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 바이오매스는 일 양상에 따른 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스의 제조방법에 의해 제조되는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-2147 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스, 바이오오일, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-2147 미세조류 유래 바이오매스, 또는 상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류, 바이오매스, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 건조물의 파쇄물은 상기한 바와 같다.
상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물은 당업계에 공지된 미생물 바이오매스의 처리, 농축 또는 건조 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오오일(bio-oil)"은 생물학적, 열화학 그리고 물리화학 추출공정에 의해 바이오매스로부터 얻어지는 오일을 의미하며, 본 출원에서 제조된 바이오오일은 다중불포화지방산을 함유하는 것일 수 있고, 구체적으로 DHA 및 EPA를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 상기 바이오오일은 바이오매스의 추출물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 바이오오일 추출물을 제조하는 방법으로, 세포막 또는 세포벽 성분을 파쇄 또는 용해시키는 방법에 따라 프로테아제, 셀룰라아제, 펙티나아제 또는 키티나아제 등의 효소를 활용하는 방법, 호모게나이저, 초음파 분쇄기, 비드 처리 등을 이용하여 물리적으로 세포막 또는 세포벽 성분을 파쇄하는 방법, 용매를 직접 첨가하여 세포 내 투과하여 추출하는 방법, 다양한 파쇄 공정 후에 원심분리 과정을 통해 분리하는 무용매 추출 공정 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 용액, 분말, 또는 현탁액 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물은 예를 들어, 식품 조성물, 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사료 조성물"은 동물에게 급여되는 먹이를 지칭한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명을 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 말한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는 필요한 영양성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조 가능하며, 구체적으로는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사료 첨가제"는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 포함한다. 본 출원의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 라이신 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "식품 조성물"은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함하며, 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 출원의 조성물은 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물은 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 조성물을 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
본 출원의 조성물은, 예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 동결보호제, 또는 부형제 등을 함유할 수 있다. 상기 동결보호제는, 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 보존제, 안정화제, 또는 부형제는 상기 조성물에 포함되는 스키조키트리움 속 미세조류의 저하(deterioration)를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다. 또한, 상기 동결보호제는 상기 조성물이 건조된 상태일 때 조성물에 포함되는 스키조키트리움 속 미세조류의 저하를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다.
상기 조성물은 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 출원의 조성물은 포유류, 조류, 어류, 갑각류, 두족류, 파충류 및 양서류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 포유류는 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물, 또는 애완 동물 등을 포함할 수 있고, 상기 조류는 가금류를 포함할 수 있고, 상기 가금류는 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 또는 메추라기 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 어류는 상업적 축양 어류 및 이의 치어류, 관상어 등을 포함할 수 있고, 상기 갑각류는 새우, 따개비 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 동물성 플랑크톤인 로티퍼(rotifer)의 식이에도 적용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-2147 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 바이오매스를 회수하는 단계를 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류, 바이오매스, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 건조물의 파쇄물은 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "배양"은 상기 미세조류를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미세조류에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 스키조키트리움 속 미세조류의 배양은 종속영양 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "종속영양"은 에너지원 또는 영양원을 체외에서 얻어낸 유기물에 의존하는 영양 방식으로, 독립영양에 대응되는 용어이며, 용어 '암배양'과 혼용될 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본 출원의 미세조류의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미세조류의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 미세조류를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나, 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 배양온도는 20 내지 45℃ 또는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에 포함되는 탄소원은 글루코스, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 만노스, 수크로스, 아라비노스, 자일로스 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 미세조류를 배양하는데 사용되는 탄소원이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에 포함되는 질소원은 i) 효모 추출물(yeast extract), 우육 추출물(beef extract), 펩톤 및 트립톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유기질소원, 또는 ii) 암모늄 아세테이트, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 소듐 나이트레이트, 우레아 및 MSG(Monosodium glutamate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기질소원일 수 있으나, 미세조류를 배양하는데 사용되는 질소원이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에, 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유염 등을 개별적으로 포함하거나 또는 혼합하여 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 바이오매스를 회수하는 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 바이오매스를 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있고, 정제 공정을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-2147 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 지질을 회수하는 단계를 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오오일 제조방법을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류, 바이오오일, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 건조물의 파쇄물, 상기 미세조류를 배양하는 단계는 상기한 바와 같다.
상기 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 지질을 회수하는 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 지질을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있고, 정제 공정을 더 포함하는 것일 수 있다.
예를 들면, 지방 알데하이드, 지방 알콜 및 탄화수소(예를 들어, 알칸)와 같은 지질 및 지질 유도체는 헥산과 같은 소수성 용매로 추출할 수 있다. 지질 및 지질 유도체는 또한 액화, 오일 액화 및 초임계 CO2 추출 등 방법을 사용하여 추출할 수 있다. 또한, 공지된 미세조류 지질 회수 방법은 예를 들어, i) 원심분리에 의해 세포를 수거하고 증류수로 세척한 후, 동결 건조에 의해 건조시키고, ii) 수득한 세포 분말을 분쇄한 후, n-헥산으로 지질을 추출하는 방법이 있다(Miao, X and Wu, Q, Biosource Technology (2006) 97:841-846).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-2147 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물의 바이오매스 또는 바이오오일을 제조하기 위한 용도를 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류, 바이오매스, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 건조물의 파쇄물은 상기한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 예는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-2147 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물의 사료 조성물 또는 식품 조성물을 제조하기 위한 용도를 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류, 바이오매스, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 건조물의 파쇄물은 상기한 바와 같다.
본 발명의 신규한 트라우스토키트리드 계열의 미세조류는 바이오매스 중 지방 함량이 높고, 그 중에서도 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산과 같은 불포화지방산의 함량이 높아, 그 자체 또는 배양 및 발효에 의해 생산된 바이오매스 및 바이오매스로부터의 불포화지방산을 포함한 지방 성분의 추출이 매우 용이하다. 이에, 상기 미세조류, 이로부터 제조되는 바이오매스 건조물 및 바이오오일은 사료용 조성물 또는 식품용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 트라우스토키트리드 계열 미세조류 균주를 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 분리된 트라우스토키트리드 계열 미세조류 29종의 총 지질 함량, 오메가-3 중 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA) 함량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 야생형 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 균주 CD01-1821을 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4는 야생형 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 균주 CD01-1821 및 선별된 돌연변이 균주 4종의 당소모 속도 및 680nm에서의 흡광도(Optical Density)를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시에에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열 미세조류의 분리
트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열 미세조류를 분리하기 위하여, 대한민국 서해안 지역, 서천, 군산, 부안 및 영광군 해안 일대의 총 40여개 지역으로부터 해수, 나뭇잎 및 퇴적물 형태의 환경 시료를 채취하였다. 유기퇴적물이 발달되고 관찰되는 특정 지역을 중심으로 샘플링을 실시하였으며 채취된 환경 샘플은 실험실 환경으로 7일 이내 운반되어 분리하고자 하는 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열 미세조류를 제외한 박테리아류 미생물 및 곰팡이, 원생생물 등의 기타 오염원 제거 작업을 진행하였다. 지속적인 현미경 검경을 통하여 트라우스토키트리드 계열 미세조류 특징적인 형태(Morphology)를 보이며 생태 주기(Life cycle) 내에서 관찰 가능한 유주자(Zoospore)를 형성하거나, 발달 단계상 생성되는 외형질 망(Ectoplasmic network)이 구성되는 시료를 중심으로 트라우스토키트리드 계열 미세조류 세포를 분리하였다(도 1). 상기 분리 과정에서 활용한 분리 및 배양 배지로는 변형된 YEP 배지(효모 추출물(Yeast extract) 0.1g/L, 펩톤 0.5g/L, MgSO4·7H2O 2g/L, 해염(Sea salt) 50g/L, H3BO3 5.0mg/L, MnCl2 3.0mg/L, CuSO4 0.2mg/L, NaMo4·2H2O 0.05mg/L, CoSO4 0.05mg/L, ZnSO4·7H2O 0.7mg/L, 아가(Agar) 15g/L)를 활용하였다. 수회에 걸친 분리 및 계대 배양 과정을 통해 오염원이 제거된 순수 분리 콜로니를 얻을 수 있었으며, 분리된 콜로니는 항생제 칵테일 믹스 용액(스트렙토마이신 설페이트(Streptomycin sulfate) 0-50mg/L, 암피실린(Ampicillin) 0-30mg/L, 페니실린(Penicillin) G 0-30mg/L, 카나마이신 설페이트(Kanamycin sulfate) 0-30mg/L)을 포함한 고체 배지에서 재차 오염원 제어 및 제거 과정을 거쳐 순수 분리 가능한 콜로니를 획득하였다.
실시예 2. 분리된 미세조류의 배양 평가 및 우수 균주 선별
상기 실시예 1에서 순수 분리된 콜로니들을 대상으로 배양 평가를 수행하고, 이를 통해 우수한 균주를 선별하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 순수 분리된 콜로니들을 변형된 GGYEP 배지(글루코스 5g/L 글리세롤 5g/L, 효모 추출물 0.1g/L, 펩톤 0.5g/L, MgSO4·7H2O 2g/L, 해염 50g/L, H3BO3 5.0mg/L, MnCl2 3.0mg/L, CuSO4 0.2mg/L, NaMo4·2H2O 0.05mg/L, CoSO4 0.05mg/L, ZnSO4·7H2O 0.7mg/L)를 이용하여 250mL 플라스크에서 10-35℃, 100-200rpm 조건으로 약 2일간 배양하였다. 진행된 배양 결과를 토대로, 30℃ 이상의 온도 조건에서 성장이 가능하며, 성장 속도가 우수하고 균체량이 확보 가능한 미세조류 29종을 선별하였다. 선별된 미세조류 균주를 대상으로 30g/L의 글루코스를 탄소원으로 포함하는 변형된 GYEP 배지 및 배양 조건 30℃, 150rpm, 500ml 플라스크 스케일 배양을 2일간 진행하였다. 2일 동안의 배양 환경에서 투입된 탄소원을 모두 소모함을 확인한 후, 배양액 전체를 회수하여 60℃ 드라이오븐에서 밤새 건조하여 바이오매스를 수득하였다.
상기 배양한 미세조류 균체의 지질 및 다중불포화지방산 함량을 분석하기 위해 아래와 같은 방법을 이용하였고, 건조균체를 활용한 미세조류 유래 지방산 함유 오일은 다음의 방법으로 측정하였다. 건조균체 5g에 8.3M 염산용액(HCl)을 가하여 80℃에서 미세조류 균체의 세포벽을 가수분해한 후, 에틸 에테르 30mL 및 석유 에테르(Petroleum ether) 20mL을 첨가하고 30초간 섞어준 후 원심분리하는 과정을 3회 이상 반복하였다. 분리된 용매 층을 회수하여, 미리 무게를 측정해 둔 라운드 플라스크에 옮긴 뒤 질소퍼징을 통해 용매를 제거하고 데시게이터(Desicator)에서 냉각 항량하였다. 건조 후 플라스크 무게에서 빈 플라스크 무게를 뺀 값으로 건조된 오일의 무게를 측정하여, 전체 오일 함량을 산출하였다. 오일 중에 포함된 도코사헥사엔산(DHA)함량은 메탄올성 0.5N NaOH 및 14% 트리플루오로보란메탄올(BF3)을 통해 전처리하여 기체크로마토그래피법으로 측정하여 나타내었다.
[계산식 1]
전체 오일 함량(%)= (*오일 g/건조균체량 g) X 100
*오일 g: 산 가수분해 및 용매 제거 후 플라스크 무게 - 공 플라스크 무게
하기 표 1의 “바이오매스”는 배양액 내의 균체 농도를 의미하는 것으로서, 하기 표 2의 DCW(dry cell weight)와 혼용되어 사용될 수 있다.
　 총 오일 (%/바이오매스) 지방산함량 (%/TFA)
DHA EPA
1811 40.01 19.46 1.72
1812 36.03 17.90 1.80
1813 34.21 19.40 2.10
1814 38.67 18.90 1.98
1815 28.89 17.90 2.92
1816 23.84 17.64 3.38
1821 31.53 57.25 0.71
1822 43.18 58.68 0.53
1831 29.80 29.38 1.98
1832 31.50 33.35 1.61
1833 22.36 37.26 2.83
1834 23.44 36.12 2.22
1835 39.03 29.85 0.70
1836 21.73 35.77 2.76
1837 18.39 33.30 2.96
1838 19.81 38.77 2.76
1839 20.76 37.91 3.06
18310 20.65 39.93 2.85
18311 22.96 40.17 2.70
18312 18.26 39.27 3.31
18313 21.99 36.68 2.69
1841 26.33 19.40 1.06
1842 35.53 21.75 1.38
1843 34.83 18.67 1.02
1844 29.74 23.92 1.65
1845 33.23 19.89 0.89
1846 28.23 20.63 1.13
1847 31.37 18.56 0.91
1848 30.51 42.74 1.06
1849 29.19 20.46 1.50
18410 24.63 25.17 1.84
18411 21.93 25.75 1.96
(상기 표에서 TFA는 총지방산을 의미하고, 조지방 함량 또는 조지방량 또는 총 지질과 혼용되어 사용될 수 있다.)
그 결과, 표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, CD01-1821 및 CD01-1822 2종의 균주가 세포 내 DHA 함량이 50% 이상으로 매우 높게 나타났다.
상기 지방산 분석 결과 세포 내 DHA 함량이 우수한 CD01-1821, CD01-1822 2종의 균주를 대상으로 5L 스케일 배양기에서 배양 평가를 진행하였다. 종균 배양(Seed culture)은 500mL 플라스크에서 멸균된 MJW02 배지(글루코스 30g/L, MgSO4·7H2O 3.0g/L, Na2SO4 15g/L, NaCl 0.8g/L, 효모 추출물 1.0g/L, MSG·1H2O 1.0g/L, NaNO3 1.0g/L, KH2PO4 0.8g/L, K2HPO4 1.5g/L, CaCl2 0.5g/L, 비타민 혼합 용액 10ml/L)를 이용하여 30℃, 150rpm 조건으로 약 24시간 배양하였다. 종균 배양된 플라스크는 5L 배양기로 분주 및 접종하였다. 총 배양액 대비 28%의 글루코스 탄소원을 공급하고 약 72시간 배양을 진행하며, 멸균된 MJW02 배지 및 배양환경 30℃, 500rpm, 1.5vvm, pH 5-8 조건에서 배양을 진행하였다.
Schizochytrium sp. CD01-1821 Schizochytrium sp. CD01-1822
배양시간 (hr) 71.5 71.5
O.D (680nm) 154.2 103
DCW (g/L) 139.5 103
조지방량 (%) 58.6 49.7
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, CD01-1821 균주가 동일 발효 조건 내 바이오매스 총 생산량과 조지방량이 CD01-1822 균주보다 높아 스케일업(Scale-up) 공정에 보다 용이함을 확인하였다. 이에 CD01-1821 균주를 선정하여 균주 서열 동정 및 추가 균주 개발에 활용하였다. 상기 선정된 CD01-1821 균주의 형태는 광학현미경을 이용하여 관찰하여 도 3에 나타내었다.
실시예 3. 복합 탄소원 조건 하에서 CD01-1821 균주의 배양 특성 확인
종속 영양 미생물 기반의 발효에서는 주로 글루코스 성분을 탄소원의 원재료로 활용한다. 이때의 글루코스는 90% 이상 정제된 형태의 단당류로, 다른 탄소원 원재료 성분에 비해 산업적 스케일의 발효 시 그 비용이 더 발생된다. 저렴한 탄소원 원재료 활용 및 이를 통한 가격 경쟁력 확보를 위하여, 정제된 형태의 글루코스가 아닌 미생물이 발효 시 이용이 가능하되 저렴한 탄소원 성분에서 정상 배양이 가능한 균주를 발굴하는 것이 중요하다.
이에, 상기 실시예 2에서에서 선별한 CD01-1821 균주와 CJM01(등록특허 10-2100650)균주를 글루코스(Glucose), 프럭토스(Fructose) 또는 원당(Sucrose)을 주성분으로 하는 원당에서의 발효 배양 평가를 수행하여 배양 특성을 확인하였다. 배양은 30L 배양기에서 진행하였으며, 변형된 MJW02 배지를 기반으로 주요 탄소원 성분을 글루코스 450 g/L, 글루코스 225 g/L 와 프럭토스 225 g/L의 혼합물, 글루코스 225 g/L, 프럭토스 220 g/L 및 황산염(sulfate) 1.51 g/L를 포함하는 원당 분해물로 각각 실험하였다. 배양 조건은 30℃, 500rpm, 1.5vvm, pH 5-8 조건으로 동일하게 설정하였으며, 총 배양액 부피의 35%의 탄소원을 각각 공급하였다.
　 Schizochytrium sp. CD01-1821 Thraustochytrium sp. CJM01
탄소원 글루코스 글루코스+프럭토스 혼합물 원당(Sucrose) 분해물 글루코스 글루코스+프럭토스 혼합물 원당(Sucrose) 분해물
배양시간 (hr) 54.7 56.1 7.3 60 66.83 83.3
O.D (680nm) 169.3 143.7 177.9 152.7 180.4 155.7
DCW (g/L) 163 160 161 130 150 138
조지방량 (%) 60.7 60.1 60.3 61.2 61.7 59.3
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, CD01-1821 균주는 글루코스 단일성분이 아닌 프럭토스 혼합물 또는 원당 분해물 배지 조건의 발효에서도 동등 이상 수준의 총 바이오매스 생산량 및 조지방량을 나타냈다. 반면, CJM01 균주는 글루코스 성분 이외의 당 성분이 배지 내 첨가되면서 이원화된 탄소원 소모 및 세포 성장 패턴의 이단계적응성장(Diauxic growth) 형태를 보이며 총 배양시간이 길어지는 현상을 나타냈다. 해당 실험 결과를 통해, CD01-1821 균주는 복합 탄소원 조건에서의 스케일업화된 발효 가능성을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 신규한 스키조키트리움 속 균주 CD01-1821의 동정
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 분리 및 선정된 미세조류 균주 CD01-1821의 문자생물학적 동정을 위하여 18S rRNA 유전자 서열을 분석하였다.
구체적으로, 순수 분리된 미세조류 CD01-1821의 콜로니로부터 gDNA 를 추출 및 분리한 후, 표 4에 기재된 18s rRNA 부위의 유전자 증폭용 프라이머 18s-Fwd, LABY-ARev를 이용하여 PCR 증폭 반응을 수행하였다.
서열번호 프라이머 서열 (5' - 3')
2 18S-Fwd AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT
3 LABY-ARev GGG ATC GAA GAT GAT TAG
PCR 반응은 택 폴리머라제(taq polymerase)를 함유하는 반응 용액을 사용하여 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 50℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 35회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. PCR 과정을 통하여 증폭된 반응액은 1% 아가로즈겔에 전기영동하여 약 1000 bp size의 DNA단편이 증폭되었음을 확인하였고, 염기서열 시퀀싱 분석을 진행하였다. 분석 결과 확보된 해당 서열은 NCBI BLAST 검색을 통하여, 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과(科) 계열 미세조류에 속하는 스키조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum) 균주 OUC109의 18S rRNA 유전자 염기서열과 95.11%의 상동성을 나타내고, 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 균주 LY-2012의 18S rRNA 유전자 염기서열과 95.0%의 상동성을 보임을 확인하였다. 이를 통하여, 분리된 미세조류 CD01-1821은 신규한 스키조키트리움 속 균주임을 확인하여, 이를 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.) CD01-1821 균주로 명명하고, 2021년 8월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC14660BP를 부여받았다.
실시예 5. 돌연변이 미세조류 균주의 개발
실시예 5-1. 감마선 조사에 따른 사멸률 측정
상기 실시예 4에서 분리된 야생형 미세조류 균주(Schizochytrium sp. CD01-1821)로부터 인공 돌연변이 균주를 개발하기 위하여, 감마선 선량에 따른 사멸률을 측정하여 감마선 조사 조건을 선택하였다.
구체적으로, 신규 미세조류 CD01-1821을 글루코스와 글리세롤을 각각 5g/L씩 포함하는 변형된 GGYEP 배지에 약 10시간 배양하였다. 본 시기는 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열 미세조류 고유의 생태 주기(Life cycle) 상에서 관찰되는 유주자(Zoospore)가 주로 발생 및 분포하는 초기 대수기(Early Exponential phase)단계로 판단되며, 보다 효율적인 유전적 변이를 위해 해당 시기의 세포 배양액을 수득하여 사용하였다. 배양액 샘플을 원심분리(4000rpm, 20분)하여 배양 배지가 제거된 균체만을 수확하였으며, 109 cells/mL이 되도록 NaCl 1.5%를 포함하는 0.1M 인산 완충액(Phosphate Buffer Solution)에 현탁하였다. 상기 NaCl 1.5%-0.1M 인산 완충액에 현탁된 미세조류 균체 샘플을 감마선 유래 인공 돌연변이 균주 개발 실험에 사용하였다. 감마선 조사 실험은 한국원자력연구원 첨단방사선연구소에서 진행하였으며, 5~8 kGY의 감마선 선량을 조사하여 진행하였다. 감마선이 조사된 현탁액 샘플은 회복(Recovery) 과정을 밤새 거친 후, 아가(Agar) 20g/L를 포함한 GYEP 배지에 접종 및 도말하여 30℃에서 약 5일간 배양한 후 생육 콜로니 수를 계수하여 감마선량 별 사멸율을 측정하였다.
[계산식 2]
사멸률(%) = [{(무처리구의 콜로니 수) - (처리구의 콜로니 수)}/(무처리구의 콜로니 수)] X 100
감마선 선량 (kGY) 생육 콜로니 수 (EA) 사멸률 (%)
6.0 ≥ 190 -　
6.5 ≥ 17 91.1
7.0 ≥ 9 95.3
7.5 0 100
8.0 0 100
방사선 무처리구 ≥ 90 0
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사선량에 따른 생육 콜로니 수, 생균수의 CFU값이 95% 이상 감소되는 적정 선량을 확인하였다. 구체적으로, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 kGY의 감마선 조사선량에서 각각 91.1%, 95.3%, 100%, 100%가 사멸되는 결과를 나타냈다. 7.5 GY 이상의 감마선 선량 조사 조건에서는 모두 사멸되어 미세조류 콜로니를 확보할 수 없었으며, 95.3%의 사멸률을 나타내는 7.0 kGY의 감마선 선량 조건을 선택하였다.
실시예 5-2. 돌연변이 미세조류 균주의 분리
상기 실시예 5-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 신규 미세조류 균주 CD01-1821에 7.0 kGY 선량의 감마선을 조사한 후, 미세조류 배양액 샘플을 아가(Agar) 20g/L와 지방산 합성을 저해하는 시클로산염(Cycloate)을 포함한 GYEP 배지에서 배양하였다. 약 4주간의 배양간 생육되는 미세조류 콜로니를 선별하여, 동일한 배지 및 배양 환경 조건에서 계대를 진행하였다. 계대 간 지속적으로 성장이 가능하고 콜로니 생육이 우수한 균주를 우선적으로 선별하였다. 또한, 형태적으로 하얀색을 띄며 미끄러운 형태를 띄는 콜로니를 선별하였다.
실시예 5-3. 우수한 돌연변이 미세조류 균주의 선별
상기 실시예 5-2에서 선별된 돌연변이 균주들을 대상으로 플라스크 스케일에서의 배양을 통해 당소모 속도를 분석하고, 조지방 및 지방산 분석을 통하여 우수한 돌연변이 균주를 선별하였다.
구체적으로, 상기 실시에 4에서 확인한 신규 야생형 미세조류 CD01-1821 및 실시예 5-2에서 선별된 돌연변이 미세조류들을 플라스크 스케일에서 배양하고자, 500mL 플라스크에서 최종 부피(Working volume)를 50mL로 하고, 글루코스 30g/L를 포함한 GYEP 배지 내에서, 30℃, 180rpm 조건으로 20시간 동안 배양하여 분석이 가능한 일정량의 균체를 획득하도록 하였다. 배양 간의 샘플링을 통해 남아있는 글루코스량과 680nm에서의 흡광도(Optical Density)를 분석하였으며, 이를 통해 당소모 속도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 평가된 돌연변이 균주 중 당소모 속도와 성장이 우수한 4종의 균주를 선별하였다.
상기 선별된 4종의 균주는 5L 용량의 발효조에서 재평가를 진행하였다. 30g/L를 포함한 GYEP 배지 배양을 종균 배양(Seed culture)으로 하여, 멸균된 MJW02 배지가 들어있는 5L 발효조로 분주되어 30℃, 500rpm, 1.5vvm, pH 5-8 조건에서 배양을 진행하였다. 15 시간의 배양간 주요 탄소원인 글루코스의 소모 속도와 성장지표로 확인되는 흡광도(Optical Density) 및 건조균체중량(Dry cell Weight, g/L)을 측정 및 평가하여 성장이 가장 우수한 균주 CD01-2147을 최종 선별하였다. 상기 스키조키트리움 속 CD01-2147을 2021년 8월 23일자로 기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC14661BP를 부여받았다.
실시예 6. 야생형 스키조키트리움 속 균주 CD01-1821 및 돌연변이 스키조키트리움 속 균주 CD01-2147의 배양 특성 확인
실시예 6-1. CD01-1821 균주 및 CD01-2147 균주의 배양
야생형 스키조키트리움 속 균주 CD01-1821 및 돌연변이 스키조키트리움 속 균주 CD01-2147의 배양 특성 확인하기 위하여 실시예 2에서 선별된 야생형 스키조키트리움 속 균주 CD01-1821와 실시예 5-3에서 개발된 돌연변이 스키조키트리움 속 균주 CD01-2147를 5L 발효기에서 총 배양액 대비 35%의 글루코스 탄소원을 공급하여 60시간 동안 배양하였다. 종균 배양(Seed culture) 목적으로 멸균된 MJW02 배지를 이용하여 500mL 플라스크에서 30℃, 150rpm 조건으로 약 20시간 동안 배양하였다. 종균 배양된 플라스크는 5L 발효기로 분주 및 접종되어 멸균된 MJW02 배지 및 배양 환경으로 30℃, 500rpm, 1.5vvm, pH 5-8 조건에서 배양을 진행하였다. 배양 종료 후 상등액을 제거한 균체는 조지방 및 지방산, 조단백 함량 측정, 세포 내 오일 추출 및 회수를 위한 실험에 사용하였다.
실시예 6-2. CD01-1821 균주 및 CD01-2147 균주 배양액 샘플의 조지방 및 지방산 함량 분석
Schizochytrium sp. CD01-1821 균주 및 Schizochytrium sp. CD01-2147 균주 배양액 샘플의 조지방 및 지방산 함량을 분석하기 위해 하기와 같은 방법을 이용하였다.
구체적으로, 상기 실시예 6-1에서 수득한 CD01-1821 및 CD01-2147 균주 배양액 샘플을 이용하여 상기 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 세포 내 조지방 및 지방산 함량을 분석하였다.
　 Schizochytrium 　sp. CD01-1821 Schizochytrium 　sp. CD01-2147
배양시간(hr) 34 29
O.D (680nm) 248.7 208.1
DCW (g/L) 148.3 141.7
조지방량　(%) 58.3 61.8
조지방 중 지방산　(%) 　
- C16:0 33.3 36.1
-　omega-3 지방산 45.8 49.6
　 (상기 표에서 C16:0은 팔미트산을 의미하고, omega-3 지방산은 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산의 합을 의미한다.)
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이, CD01-1821 및 CD01-2147 균주는 비슷한 바이오매스 생장성을 나타내면서 조지방 중 지방산이 함량이 우수함을 확인하였다. 또한, CD01-1821 균주에 비해 CD01-2147 균주의 조지방량 및 조지방 중 지방산 함량이 더 높은 것을 확인하였다.
실시예 6-3. CD01-1821 및 CD01-2147 균주 배양액 샘플의 조단백 함량 분석
Schizochytrium sp. CD01-1821 및 Schizochytrium sp. CD01-2147 균주 배양액 샘플의 조단백 함량을 분석하기 위해 하기와 같은 방법을 이용하였다.
구체적으로, 건조 균체, 약 20~30mg에 해당하는 각각의 발효액 건조물(검체)을 정밀히 측정하여 분해튜브에 넣고 분해촉진제 2알을 넣었다. 상기 분해촉진제는 황산(H2SO4)과 황산칼륨(K2SO4)의 비율이 1.4~2.0:1.0 이 되어야 분해가 효율적으로 이뤄진다. 그런 다음, 분해튜브에 진한 황산(H2SO4) 12~15mL을 첨가하고, 420℃의 분해장치에서 45 내지 60분간 분해하여 분해액의 색이 투명한 연푸른색(구리 촉매제를 사용한 경우) 또는 투명한 노란색(셀레늄 촉 매제를 사용한 경우)이 되면 상온으로 냉각시켰다. 식힌 다음, 분해된 시험용액에 80mL의 증류수를 첨가하였다. 25mL의 혼합지시약이 섞인 포집용액을 삼각 플라스크에 넣은 후, 이를 증류장치에 놓고 증류 시 증류액이 포집용액으로 들어가도록 삼각플라스크 받침대를 들어 올렸다. 수산화나트륨용액(NaOH) 50mL (분해시 사용한 황산의 4배에 해당하는 양)을 분해튜브에 넣고, 증류장치에서 3 내지 4분간 증류하였다. 증류장치의 삼각 플라스크에 있는 포집용액이 증류액에 함유되어 있는 암모니아(NH3)를 포집하면서 녹색으로 변하는 것을 확인하였다. 증류액을 염산용액(일반적으로 0.1N 또는 0.2N)을 이용하여, 종말점이 엷은 핑크빛에 도달할 때까지 적정하고, 적정에 사용된 산의 양을 기록하였다. 자동장치인 경우 증류, 적정, 계산과정이 모두 자동으로 수행된다. 상기 실험 결과를 이용하여 하기 계산식 2에 의해 질소%를 도출하였다. 단백질 정량은 앞서 도출한 질소%에 평균 질소계수인 6.25를 곱하여 표기하였다.
[계산식 2]
질소(%) = {(HCl 양 mL - 공시험 mL) x M x 14.01/검체량 mg} x 100
* 14.01: 질소의 원자량
* M: HCl의 몰농도
* 분해촉진제: Kjeltabs 또는 이와 동등한 것
* 붕산용액: H3BO3 100g(또는 400g), 0.1% 브로모크레졸그린용액 100mL 및 0.1% 메틸레드용액 100mL을 넣어 10L로 정용한 1% (또는 4%) 붕산용액
아미노산 함량 분석을 위하여, CD01-1821 및 CD01-2147 균주 배양액으로부터 약 1g의 발효액 건조물(검체) 샘플을 채취하였다. 6N 농도의 HCl 용액을 활용하여 세포 내 단백질의 산 가수분해를 진행한 후, 증류수로 희석 및 여과하여 액체 크로마토그래피를 수행하였다.
Schizochytrium sp. CD01-1821 Schizochytrium sp. CD01-2147
조단백량 (%) 17 10
아미노산량 (mg/L)
아스파르트산 78.44 67.03
트레오닌 0.00 0.00
세린 108.65 43.80
글루탐산 790.80 343.28
글라이신 165.08 53.74
알라닌 172.72 113.90
시스테인 0.00 0.00
발린 96.35 108.29
메티오닌 46.54 74.13
이소류신 16.88 45.65
류신 13.17 51.95
타이로신 229.64 0.00
페닐알라닌 166.55 302.06
리신 85.83 174.62
히스티딘 0.00 0.00
아르기닌 114.15 94.51
그 결과, 표 7에 나타낸 바와 같이, CD01-2147 건조 균체 내의 조단백 함량은 10%임을 확인하였다. 또한, 건조 균체 내 아미노산 함량은 글루탐산이 가장 높았으며, 페닐알라닌, 리신, 알라닌, 발린, 아르기닌, 메티오닌, 아스파르트산, 글라이신, 류신, 이소류신, 세린의 순서로 높았다. 이를 통해, CD01-2147 건조 균체 내 아미노산은 글루탐산, 페닐알라닌, 리신, 알라닌, 발린, 아르기닌, 메티오닌, 아스파르트산, 글라이신, 류신, 이소류신, 세린으로 구성됨을 확인하였다.
실시예 6-4. CD01-1821 균주 및 CD01-2147 균주 발효액의 오일 회수량 분석
Schizochytrium sp. CD01-1821 균주 및 Schizochytrium sp. CD01-2147 균주 배양액 샘플의 오일 회수량을 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 배양이 끝난 미세조류 발효액을 대상으로 오일 추출 실험을 진행하였다. 배양액을 60℃로 가온한 후, NaOH 50% 용해액을 이용하여 pH를 7로 조정하였다. 발효액의 무게에 대비하여 Alcalase(Alcalase 2.4FG, Novozymes)를 0.2%(w/w) 투입하여 60℃에서 3시간 동안 교반 반응시켰다. 효소 반응한 발효액을 3800g에서 원심분리하여 회수되는 상등액의 오일로부터의 회수율을 비교하였다. 본 명세서에서 오일 회수율은 세포 내 오일 함유량, 즉 조지방 함량 중, 실험을 통해 오일을 추출하였을 때 추출 가능한 오일의 양을 의미한다.
　 DCW 조지방 함량 조단백 함량 오일 회수율
(g/L) (%, /Biomass) (%, /Biomass) (%, /조지방량)
CD01-1821 119 57 17 38
CD01-2147 148 65 10 87
그 결과, 표 8에 나타낸 바와 같이, 조단백 함량이 낮은 CD01-2147 균주의 발효액이 조단백 함량이 높은 CD01-1821 균주의 발효액보다 회수율이 2배 이상 높은 것을 확인하였다.
실시예 7. Schizochytrium sp. SR21 균주 및 돌연변이 스키조키트리움 속 균주 CD01-2147의 배양 특성 확인
실시예 7-1. SR21 균주 및 CD01-2147 균주의 배양
Schizochytrium sp. SR21 균주와 개발된 돌연변이 균주 CD01-2147 균주의 발효조에서의 탄소원 투입시의 생산성을 평가하기 위해, 5L fermenter 에서 총 배양액 대비 41%의 Glucose 탄소원을 공급하여 60시간 배양을 진행하였다. Seed culture 목적으로 멸균된 MJW02 배지를 이용하여 500mL flask 에서 30 ℃150 rpm 조건으로 약 20시간 배양을 진행하였다. Seed culture 된 flask 는 5L fermenter 로 분주 및 접종되어 멸균된 MJW02 배지 및 배양환경 28 ℃400 rpm, 1.0vvm, pH 5-9 조건에서 배양을 진행하였다. 배양 종료 후 상등액을 제거한 균체는 조단백, 조지방 및 지방산 함량 측정에 활용하였다. 또한, 세포 내 오일 추출 및 회수를 위한 실험에 사용하였다.
실시예 7-2. SR21 균주 및 CD01-2147 균주 발효액의 오일 회수량 분석
Schizochytrium sp. SR21 균주 및 Schizochytrium sp. CD01-2147 균주 배양액 샘플의 오일 회수량을 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 배양이 끝난 미세조류 발효액을 대상으로 오일 추출 실험을 진행하였다. 배양액을 60℃로 가온한 후, NaOH 50% 용해액을 이용하여 pH를 7로 조정하였다. 발효액 내의 세포 농도에 대비하여 Alcalase(Alcalase 2.4FG, Novozymes)를 15%(w/w) 투입하고 60℃에서 3.5시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 효소 반응한 발효액을 3800g에서 원심분리하여 상등액의 오일을 회수하였다. 회수한 상등액은 오일과 유화물질이 혼재한 층임을 확인하였다. 해당 상등액을 75℃에서 교반하면서 30분동안 열처리한 후 3800g에서 원심분리하여 상등액의 오일을 회수하였다.
　 DCW 조지방 함량 조단백 함량 오일 회수율
(g/L) (%, /Biomass) (%, /Biomass) (%, /조지방량)
CD01-2147 167 55 12 60
SR21　 159 56 27 23
그 결과, 표 9에 나타낸 바와 같이, CD01-2147 균주의 발효액이 SR21균주의 발효액보다 회수율이 2배 이상 높은 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[수탁 번호]
기탁기관명: 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)
수탁번호: KCTC14660BP
수탁일자: 20210823
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수탁일자: 20210823
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Claims (14)

  1. 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-2147 미세조류(기탁번호 KCTC14661BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 스키조키트리움 속 CD01-2147 미세조류는 오메가-3 불포화 지방산 생산능을 가지는, 스키조키트리움 속 미세조류.
  3. 제2항에 있어서, 상기 오메가-3 불포화 지방산은 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid: DHA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)인, 스키조키트리움 속 미세조류.
  4. 제3항에 있어서, 상기 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 35 내지 60 중량%의 도코사헥사엔산을 생산하는 것인, 스키조키트리움 속 미세조류.
  5. 제3항에 있어서, 상기 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 0.1 내지 2 중량%의 에이코사펜타엔산을 생산하는 것인, 스키조키트리움 속 미세조류.
  6. 제1항의 스키조키트리움 속 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스.
  7. 제6항의 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스, 상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물, 또는 상기 바이오매스의 추출물을 포함하는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 사료 조성물 또는 식품 조성물인 것인, 조성물.
  9. 제1항의 스키조키트리움 속 CD01-2147 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 미세조류, 이의 건조물, 또는 이의 파쇄물로부터 도코사헥사엔산 함유 바이오매스를 회수하는 단계를 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배양은 종속영양 조건 하에서 수행되는 것인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 배양은 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지를 사용하여 수행하는 것인, 바이오매스 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 말토오스, 갈락토오스, 만노오스, 수크로오스, 아라비노오스, 자일로오스 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 바이오매스 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 질소원은 i) 효모 추출물(yeast extract), 우육 추출물(beef extract), 펩톤 및 트립톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유기질소원, 또는 ii) 암모늄 아세테이트, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 소듐 나이트레이트, 우레아 및 MSG(Monosodium glutamate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기질소원인 것인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  14. 제1항의 스키조키트리움 속 CD01-2147 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 미세조류, 이의 건조물, 또는 이의 파쇄물로부터 도코사헥사엔산 함유 바이오매스를 회수하는 단계를 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오오일 제조방법.
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