KR20080111586A - Schizochytrium mangrovei MM103을 이용한 Docosahexanoic acid(DHA)의 생산 방법 - Google Patents

Schizochytrium mangrovei MM103을 이용한 Docosahexanoic acid(DHA)의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 국내 해양으로부터 분리한 미세조류인 Schizochytrium mangrovei MM103을 이용하여 Docosahexanoic acid(DHA)를 생산하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 고도불포화지방산(오메가지방산)인 Docosahexanoic acid(DHA)는 두뇌, 신경계 및 안구조직에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동능력개발에 중요한 요소로 대부분이 고등어, 꽁치등과 같은 등 푸른 생선으로부터 추출하여 산업적으로 이용하고 있으나, 특유의 비린내 및 산패 등으로 인하여 식품 등의 원료로 사용하기에는 많은 문제점이 있다. 특히 어류의 생산량 감소로 Docosahexanoic acid(DHA)의 안정적 공급이 점차적으로 어려워지고 있으며, 가격의 폭등으로 이어지고 있다. 또한 어유에는 Docosahexanoic acid(DHA)와 분자량이 거의 비슷한 Eicosapentaenoic acid(EPA)가 동시에 존재하여 Docosahexanoic acid(DHA)를 순수 분리하기 어렵다. 그러므로 Eicosapentaenoic acid(EPA)는 존재하지 않고 Docosahexanoic acid(DHA)를 함유하는 미세조류를 분리함으로써 Docosahexanoic acid(DHA)를 순수분리하기 용이하며, 미세조류의 세포벽이 지방산의 코팅 역활을 하므로 어취 및 지방산의 산패가 발생하지 않는다. 또한 Docosahexanoic acid(DHA)를 다량 함유하는 미세조류를 분리하여 대량배양함으로써 Docosahexanoic acid(DHA)의 대체 공급원을 확보할 수 있다. 이와 같은 효과를 얻기 위하여 국내 해양으로부터 Docosahexanoic acid(DHA)를 다량 함유하는 미세조류를 분리하여 대량 배양하는 방법과, Docosahexanoic acid(DHA)를 다량 함유하는 배 양조건을 개발하여 Docosahexanoic acid(DHA)를 상업적으로 대량생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
Schizochytrium mangrovei MM103, 미세조류, Docosahexanoic acid(DHA), 고도불포화지방산, 오메가지방산

Description

시조키트리움 맹그로브이 엠엠103를 이용한 도코사헥사노익에시드의 생산 방법 {The production method of Docosahexanoic acid(DHA) with Schizochytrium mangrovei MM103}
발명은 어류의 기름인 어유 유래의 고도불포화지방산(오메가지방산)에서는 분자량이 거의 비슷한 Eicosapentaenoic acid(EPA)와 Docosahexanoic acid(DHA)가 동시에 함유되어있어 Docosahexanoic acid(DHA)를 순수분리하기 어려우며, 식품 등 원료로의 사용에 따른 문제점 및 어류 포획량 감소에 따른 안정적 대체공급원 확보의 필요성이 대두되고 있다. 이와 같이 어유 유래의 고도불포화지방산 제품에 대한 문제점을 해결하고, 안정적으로 생산 가능한 어유대체 Docosahexanoic acid(DHA)공급원 확보를 위하여 해양으로부터 Docosahexanoic acid(DHA)를 함유하는 미세조류인 Schizochytrium mangrovei MM103을 분리하여, 분리한 미세조류의 최적 생육환경을 설정하고, 생체내에 다량의 Docosahexanoic acid(DHA)를 축적하는 조건을 찾아내어 다량의 Docosahexanoic acid(DHA)를 생산하는 방법에 관한 발명이다.
본 발명은 어류의 기름인 어유 유래의 고도불포화지방산(오메가지방산)의 한 종인 Docosahexanoic acid(DHA)를 식품 등 원료로의 사용에 따른 문제점 및 어류 포획량 감소에 따른 안정적 대체공급원으로서 해양으로부터 분리한 미세조류인 Schizochytrium mangrovei MM103의 최적 생육환경을 설정하고, 생체내에 다량의 Docosahexanoic acid(DHA)를 축적하는 조건을 찾아내어 다량의 Docosahexanoic acid(DHA)를 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 어유로부터 유래하는 고도불포화지방산(오메가지방산)에는 분자량이 302인 Eicosapentaenoic acid(EPA)와 분자량이 328인 Docosahexanoic acid(DHA)이 같이 함유되어 있으며, 이와 같은 미세한 분자량의 차이로 인하여 순수 Docosahexanoic acid(DHA)를 분리하는데 많은 어려움이 있으며, 순수 분리된 Docosahexanoic acid(DHA)는 높은 가격으로 판매되고 있다. 때문에 건강기능성 식품에서의 오메가지방산 제품은 Eicosa- pentaenoic acid(EPA)와 Docosahexanoic acid(DHA)이 혼합된 상태이다. 또한 어유로부터 분리한 오메가 지방산은 어취 및 산패 등으로 인하여 그대로 식품에 사용하지 못하고 대부분이 캡슐화시켜 사용하고 있다. 때문에 식품의 원료로는 극히 제한적으로 사용되고 있다. 또한 어류의 포획량이 점차적으로 감소하고 있으며, 그에 따른 어유의 가격이 동반 상승하며, Docosahexanoic acid(DHA)의 생산을 위한 어유의 확보가 어려워지고 있다. 때문에 Docosahexanoic acid(DHA)의 안정적이고, 값싼 공급을 위하여 대체 공급원이 필요하며, 그에 대한 대책으로 해양에 존재하는 미세조류 중 DHA를 함유하는 종을 분리하여 상업적으로 대량 배양하는 것이다. 또한 미 세조류에 함유된 Docosahexanoic acid(DHA)는 미세조류의 세포벽이 어유제품에서의 산패 및 어취방지를 위하여 가공하는 인위적 캡슐화 작용을 대신하므로 매우 안정적이며, 기존 어유제품의 식품원료로의 사용에 따른 한계점 및 문제점을 동시에 해결할 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 국내 해양으로부터 Docosahexanoic acid(DHA)를 다량 함유하는 미세조류를 분리하여 분리된 미세조류의 최적 생육환경조건 및, Docosahexanoic acid(DHA)를 대량으로 합성하는 배지조성을 확립 하여 다량의 Docosahexanoic acid(DHA)를 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 한다. 이와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여 해양으로부터 Docosahexanoic acid (DHA)를 함유하는 미세조류를 분리하는 방법과, 그 분리된 미세조류를 대량 배양할 수 있는 배양조건 및 배지조성, 그리고 Docosahexanoic acid(DHA)를 대량으로 합성하는 배양조건 및 배지조성을 개발하는 방법이다.
본 발명은 국내 해양으로부터 Docosahexanoic acid(DHA)를 다량 함유하는 미세조류를 분리하는 방법과, 그 분리된 미세조류의 대량배양조건 및 배지조성, 그리고 Docosahexanoic acid(DHA)를 대량으로 합성하는 배양조건 및 배지조성에 대하여 첨부된 도면에 의하여 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 국내 해양에서 Docosahexanoic acid(DHA)를 다량으로 함유하고 있는 미세조류를 분리하는 단계, 그 분리된 미세조류의 대량배양을 위한 배지조성 및 배양조건을 확립하는 단계, 그리고 분리된 미세조류가 Docosahexanoic acid(DHA)를 대량으로 생합성하는 배양조건 및 배지조성을 확립하는 단계로 구성된다.
이하 본 발명의 구체적인 방법은 다음과 같다.
우선 국내 남해안의 경남 고성지역 해안으로부터 4월부터 7월까지 지속적으로 선박을 활용하여 3㎛의 여과망으로 해수를 여과시켜 잔여물로부터 샘플을 채취 하였다. 채취된 샘플을 생리 식염수에 희석시켜 glucose 30g, yeast extract 5g, peptone 10g, (NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g, bacto agar 25g을 정제수를 이용하여 염분농도 2.0%(w/w)로 조정한 해수 1,000㎖에 녹인후 NaoH를 이용하여 pH 4.5로 조정 후 121℃에서 15분간 멸균시킨 배지에 도말시켜 28℃에서 5일간 배양하여 생성되는 colony를 현미경으로 검경하여 Schizochytrium sp.로 추정되는 유사형태의 미세조류를 재선별하여 glucose 30g, yeast extract 5g, peptone 10g, (NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g을 정제수를 이용하여 염분농도 2.0%(w/w)로 조정한 해수 1,000㎖에 녹인후 NaoH를 이용하여 pH 4.5로 조정 후 121℃에서 15분간 멸균시킨 액상배지에 배양 한 후 지방산 조성을 분석하여 Docosahexanoic acid(DHA)를 함유하는 미생물을 분리하였으며, 그 중 Docosahexanoic acid(DHA)의 함유량이 높고, 성장속도가 빠르며, 배양조건이 복잡하지 않는 1종의 미세조류를 최종 선정하여, 대량배양을 위한 최적의 배양조건 및 배지조성, Docosahexanoic acid(DHA)를 대량 생합성하는 배양 조건 및 배지조성을 확립하기 위하여 각각의 조건별로 다음과 같이 실험하였다.
1.대량배양을 위한 최적 생육조건 및 배지조성 조사
1) 최적 탄소원 조사
최적 탄소원 선정을 위하여 (NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g을 정제수를 이용하여 염분농도 2.0%(w/w)로 조정한 해수 1,000㎖에 녹인후 pH 4.5 조정된 기본 배지에 각각 glucose 30g, fructose 30g, xylose 30g, mannose 30g, starch 30g을 투입하여 분리된 미세조류를 28℃에서 5일간 배양한 후 잔여 당을 확인한 후 분리된 미세조류가 가장 쉽게 사용하는 탄소원을 확인하였다.
2)온도별 성장속도 측정
분리 미세조류의 최적 생육온도를 측정하기 위하여 glucose 60g, yeast extract 2g, peptone 10g, (NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g을 정제수를 이용하여 염분농도 2.0%(w/w)로 조정한 해수 1,000㎖에 녹인후 pH 4.5로 조정된 배지에 20, 24, 28, 32, 36℃의 온도 조건으로 분리 미세조류를 5일간 배양한 후 OD값을 측정하여 최적 생육온도를 확인하였다.
3)생육시간에 따른 성장속도 측정
분리 미세조류의 시간대별 생육정도를 측정하기 위하여 glucose 60g, yeast extract 2g, peptone 10g, (NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g을 정제수를 이용하여 염분농도 2.0%(w/w)로 조정한 해수 1,000㎖에 녹인후 pH 4.5로 조정된 배지에 24, 48, 72, 96, 144, 168시간의 조건으로 분리 미세조류를 배양한 후 OD값을 측정하여 최 적 배양시간을 확인 하였다.
4)pH 변화에 따른 성장속도 측정
분리 미세조류의 pH별 생육정도를 측정하기 위하여 glucose 60g, yeast extract 2g, peptone 10g,(NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g을 정제수를 이용하여 염분농도 2.0%(w/w)로 조정한 해수 1,000㎖에 녹인후 pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0의 조건으로 제조된 배지에 분리 미세조류를 5일간 배양한 후 OD값을 측정하여 최적 배양 pH를 확인 하였다.
5)염 농도에 따른 성장속도 측정
분리 미세조류의 염 농도별 성장도를 측정하기 위하여 glucose 60g, extract 2g, peptone 10g,(NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g을 정제수를 이용하여 염분농도 0.0, 0.5, 1.0, 1.5,2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5%(w/w)로 조정된 해수 1,000㎖에 녹인후 pH 4.5의 조건으로 제조된 배지에 분리 미세조류를 5일간 배양한 후 OD값을 측정하여 최적 배양 염 농도를 확인 하였다.
2.총지질 및 Docosahexanoic acid(DHA)를 다량 함유하는 조건설정
1)배양시간에 따른 오메가 지방산 함유량 측정
분리 미세조류의 배양시간에 따른 오메가지방산 함유량 측정을 위하여 분리 미세조류를 glucose 60g, yeast extract 2g, peptone 10g, (NH4)2SO4 3g,KH2PO4 3g 을 정제수를 이용하여 염분농도 2.0%(w/w)로 조정한 해수1,000㎖에 녹인 후 pH4.5 로 조정된 배지에 호기조건, 배양온도 28℃에서 분리 미세조류를 배양한 후 시간별 오메가 지방산 함량을 측정 하였다.
2)염 농도별 오메가 지방산 함유량 측정
분리 미세조류의 염 농도별 오메가 지방산 함유량 측정을 위하여 분리 미세조류를 glucose 60g, yeast extract 2g, peptone 10g, (NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g을 정제수를 이용하여 염분농도 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 3.5, 4.0%(w/w)의 농도별로 조정된 해수 1,000㎖에 녹인 후 pH4.5로 조정하여 분리 미세조류를 접종한 후, 호기조건, 28℃에서 120시간 배양한 후 오메가 지방산 함량을 측정하였다.
3)pH 변화에 따른 오메가 지방산 함유량 측정
분리 미세조류의 pH 변화에 따른 오메가 지방산 함유량 측정을 위하여 glucose 60g, yeast extract 2g, peptone 10g, (NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g을 정제수를 이용하여 염분농도 2.0%(w/w)로 조정한 해수1,000㎖에 녹인 후 pH를 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5로 각각 조정하여 분리 미세조류를 접종하여 호기조건, 28℃에서 120시간 배양 후 오메가 지방산 함량을 측정 하였다.
4)배양온도에 따른 오메가 지방산 함유량 측정
분리 미세조류의 배양온도에 따른 오메가 지방산 함유량 측정을 위하여 glucose 60g, yeast extract 2g, peptone 10g, (NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g을 정제수를 이용하여 염분농도 2.0%(w/w)로 조정한 해수1,000㎖에 녹인 후 pH4.5로 조정하여, 호기조건에서 20, 24, 28, 32, 36, 40℃의 온도 조건으로 분리 미세조류를 120시간 배양한 후 오메가 지방산 함량을 측정 하였다.
5)glucose 농도에 따른 오메가 지방산 함유량 측정
분리 미세조류의 glucose 농도에 따른 오메가 지방산 함유량 측정을 위하여 yeast extract 2g, peptone 10g, (NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g을 정제수를 이용하여 염분농도 2.0%(w/w)로 조정한 해수1,000㎖에 녹인 후, pH4.5로 조정하여 glucose의 농도를 0.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0%(w/w)로 조정한 후 분리 미세조류를 접종하여 호기조건에서 28℃온도 조건으로 120시간 배양한 후 오메가 지방산 함량을 측정 하였다.
이상의 실험결과에 의하여 분리 미세조류의 대량배양 및 Docosahexanoic acid(DHA)의 대량 생합성을 위한 최적 배양조건은 배양온도 28℃, 배양시간 120시간, 진탕배양의 조건에서 배지의 조성은 glucose 60g, yeast extract 2g, peptone 10g, (NH4)2SO4 3g, KH2PO4 3g을 정제수를 이용하여 염분 농도 2.0%(w/w)로 조정한 해수 1,000㎖에 녹인후 NaOH를 이용하여 pH 4.5로 조정한 배지이다.
상기의 실험결과에 의하여 분리된 미세조류를 배양한 후 분석한 지방산 조성은 표1.과 같다.
표1.분리된 미세조류의 지방산 조성결과
구조식 일반명 함량
14:0 myristic acid 4.27
15:0 3.81
16:0 Palmitic acid 28.36
16:1n-7 Palmitoleic acid 0.20
17:0 Magaric acid 0.20
18:0 Stearic acid 1.52
18:1n-9 Oleic acid 0.19
20:0 Arachidic acid 0.11
20:3n-6 Dihomo-r-linolenic acid 0.10
20:4n-6 Arachidonic acid 2.80
20:4n-3 Eicosatetraenoic acid 0.83
20:5n-3 Eicosapentaenoic acid(EPA) 0.90
22:5n-6 9.80
22:5n-3 Docosapentaenoic acid(DPA) 0.15
22:6n-3 Docosahexaenoic acid(DHA) 45.62
n-3:n-6 3.74
n-3 HUFA 47.49
n-6 HUFA 47.49
상의 실험 완료된 미세조류의 18S rDNA 분석결과 Schizochytrium mangrovei로 판명 되었으며, 이 미세조류를 Schizochytrium mangrovei MM103으로 명명하여, 한국생명공학연구원에 수탁하였다(수탁번호:KCTC 11117BP).
이와 같이 된 본 발명에 의하여 분리된 미세조류는 Docosahexanoic acid(DHA)를 다량 함유하는 Schizochytrium mangrovei MM103으로 기존 Docosahexanoic acid (DHA)의 주 공급원인 어유를 대체할 수 있다, 또한 Docosahexanoic acid(DHA)의 주 공급원인 어유로 부터 Docosahexanoic acid(DHA)를 순수 분리하기 위하여는 어유속에 같이 함유된 Eicosapentaenoic acid(EPA)와의 분자량 차이가 나지 않아 매우 어렵다. 그러나 , 본 발명에 의하여 분리된 미세조류인 Schizochytrium mangrovei MM-103는 Eicosapentaenoic acid(EPA)가 존재하지 않아 쉽게 Docosahexanoic acid(DHA)를 순수 분리할 수 있다.그리고 어유 유래의 고도불포화지방산은 산패 및 어취의 발생으로 식품등의 원료로 사용하기 위하여는 인위적으로 캡슐화하여야 한다. 때문에 식품원료로의 사용에 제한적이다. 그러나 본 발명에 의하여 분리된 미세조류는 자체의 세포벽에 의하여 Docosahexanoic acid(DHA)가 캡슐화된 효과와 동일하므로 식품원료로의 사용에 제한이 없다.
1. Schizochytrium mangrovei MM103의 18S rDNA 염기서열 >H103 AGTTACATGCATGTGTAGTATAAGCGATTGTACTGTGAGACTGCGAACGGCTCATTATATCAGTAATAATTTCTTCGGTAGTTTCTTTTATATGGATACCTGCAGTAATTCTGGAAATAATACATGCTGTAAGAGCCCTGTATGGGGCTGCACTTATTAGATTGAAGCCGATTTTATTGGTGAATCATGATAATTGAGCAGATTGACTTTTTTGGTCAATAAATCGTTTGAGTTTCTGCCCCATCAGTTGTCAACGGTAGTGTTTTGGACTACGGGGACTATAACGGGGGACGGAAAGTTAGGGCTCAACTCCGGAAAGGGAGCCTGAAAAACGGCTACCATATCCAAGGATACCAGCAGGGCCGTAAATTACCCACTGGGGACTCCACAAGGTATTGACAAAAAATATCAATGCAAAGCGGGTATGCGTTTTGCTATCGGAATGAAAGCAATGTAAAACCCTCATCAAGGATCAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCACCAGCCCCGGTAATTCCAGTTCCAAACCATATGCTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGGCATGGGCGACCGGTGCTTTCCCTGAATGGGGATTGATTGTCTGTGTTGCCTTGGCCATCTTTCTCATGCTGTTATTGGTATGAGATCTTTCACTGTAATCAAAGCAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATGACCGGTATGTTTATTATGGGATGATAAGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGTTGGTTTGCACGCCTGAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTATTTAGGAGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTCCGAAAGACGAACTAGAGCGAAGGCATTTACCAAGCATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCTGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTAGACCGTAAACGATGCCGACTTGCGATTGTTGGGTGCTTTTTTATGGGCCTCAGCAGCAGCACATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGGTAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCATGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTCGGCCTACTAAATAGTGCGTGGTATGGCAACATAGTACGTTTTTAACTTCTTAGAGGGACATGTCCGGTTTACGGGCAGGAAGTTCGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGGGTTCATCGGGTTTTAATTTCAATTTTTGGAATTGAGTGCTTGGTCGGAAGGCCTGGCTAATCCTTGGAACGCTCATCGTGCTGGGGCTAGATTTTTGCAATTATTAATCTCCAACGAGGAATTCCTAGTAAACGCAAGTCATCAGCTTGCATTGAATACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCACCTACCGATTGAACGGTCCGATGAAACCATGGGATGTTTGTGTTTGGATTCAATTTTTGGACATAGGCAGAACTCGGGTGAATCTTATTGTTAGAGGAAGTAAGTCGTACCCGT 서열목록제출서에 첨부하여 제출

Claims (3)

  1. 국내 해양으로부터 분리한 1,705개의 18S rDNA 핵산 염기서열을 특징적으로 하는 Schizochytrium mangrovei MM103(KCTC 11117BP) 미세조류.
    (특징적인 18S rDNA 의 핵산염기서열은 첨부된 염기서열 전자파일에 수록)
  2. Schizochytrium mangrovei MM103(KCTC 11117BP)의 대량배양 및 Docosahexanoic acid(DHA)의 대량 생합성을 위하여 배양온도 20~35℃, 배양시간 60~180시간,
    진탕배양의 조건으로 구성된 Schizochytrium mangrovei MM103(KCTC 11117BP)의 배양조건.
  3. Schizochytrium mangrovei MM103(KCTC 11117BP)의 대량배양 및 Docosahexanoic acid(DHA)의 대량 생합성을 위하여 glucose 20~80g, yeast extract 0.5~10g, peptone 1~10g, (NH4)2SO4 0.5~10g, KH2PO4 0.5~10g을 정제수를 이용하여 염분 농도 0.5~5.0%(w/w)로 조정한 해수 1,000㎖에 녹인후 NaOH를 이용하여 pH 3.0~4.5로 조정하여 Schizochytrium mangrovei MM103(KCTC 11117BP)를 배양하는 것으로 구성된 배양배지 조성.
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