CN102358886A - 一种二十碳五烯酸生产菌株的筛选方法 - Google Patents

一种二十碳五烯酸生产菌株的筛选方法 Download PDF

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卢美欢
李利军
马英辉
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Abstract

一种二十碳五烯酸生产菌株的筛选方法，本发明是将采集的土样用诱物块诱导培养，将分离纯化得到的纯菌株经染色后初步筛选，再经扩大培养后提取油脂，进行气相色谱分析，筛选得到EPA含量高的菌株。本发明能快速有效地筛选到二十碳五烯酸产量高的真菌菌株，方法步骤简单、筛选周期短，而且所筛选菌株的花生四烯酸含量低、繁殖快、易培养，适合于工业化生产，对扩大二十碳五烯酸的微生物来源及其商业化生产具有重要意义。

Description

一种二十碳五烯酸生产菌株的筛选方法
技术领域
本发明涉及微生物菌种筛选技术，特别涉及一种二十碳五烯酸生产菌株的筛选方法。
背景技术
二十碳五烯酸(EPA)是ω-3系列多不饱和脂肪酸的一种，人体能通过植物中摄取的α-亚麻酸微量地转化为EPA，满足一般健康需求。但是老年人、幼儿及糖尿病人则不能将α-亚麻酸有效地转化为EPA，这就必需从食物中直接摄取EPA。二十碳五烯酸又俗称“血管清道夫”，能抑制血小板凝集，减少血栓素形成，具有预防心肌梗塞和脑梗塞作用，同时具有降血脂、防动脉硬化、抗癌及抗炎的作用。由于EPA对机体具有良好的生理功效，目前已在医药、食品、饲料、化工领域广泛应用。国内外市场上，EPA的主要产品是以保健食品上市的含EPA和DHA鱼油的明胶软微胶囊，另外还有以医药品上市的甲酯胶囊和乙酯胶囊，EPA含量可达60％以上。
绝大多数的植物油中不含EPA，天然EPA的来源主要为海产鱼类、贝类和一些海藻类，如海狗油、海豹油、金枪鱼、沙丁鱼、白蛤等。其加工原料主要采用海产鱼油，由于鱼油来源容易受季节、气候等环境因素影响，且过多捕猎会破坏海洋生态平衡，所以无法满足市场对EPA产量的要求，开发新来源成为目前学者关心的问题。微生物发酵法生产EPA不受自然条件影响，作为EPA原料来源明显优于鱼类等资源，是取代鱼油原料的最佳选择。
目前已发现含有EPA的微生物种类有真菌、海水细菌、藻类等。真菌在自然界分布广且易培养，所以从真菌中选育EPA高产菌株前景广阔。含EPA真菌主要为多种低等菌，如被孢霉、腐霉、虫霉、壶菌等。目前已在高山被孢霉(Mortierella alpina)，长孢被孢霉，樟疫霉(Phytophthora ciaoamrnni)，终极腐霉(Pythiumultimum)，轮梗霉(Diasporangium sp.)，腐霉(Pythium)，畸雌腐霉(Pythium irregulare)，刺腐霉(P.spinosumSawada)等真菌中发现含有EPA。其中，腐霉是一种丝状真菌，菌体内的油脂中含有不饱和脂肪酸，尤其是EPA含量较高，是生产EPA的良好菌种。
目前含EPA菌种的筛选方法是从土壤中获得大量菌株后，通过油脂提取和脂肪酸分析来确定生产菌株，其方法耗时长、工作量大。
发明内容
本发明的目的是提供一种二十碳五烯酸生产菌株的筛选方法，其方法步骤简单、周期短，能有效快速地获得二十碳五烯酸高产菌株。
本发明所提出的二十碳五烯酸生产菌株的筛选方法，具体步骤包括：
步骤一、诱导培养：将采集的土样置于无菌培养皿内，喷适量无菌水保持湿度，将经灭菌的诱物块按每皿1～5块均匀放置在培养皿内的土样上，使诱物部分埋于土内，培养见诱物上有菌丝长出，将菌丝移植到含硫酸链霉素600单位/ml和青霉素钠盐1000单位/ml的PDA培养基平板上25℃培养2天；所述土样采集于菜园或果园5～15cm深处；所述的诱物块为1公分大小的黄瓜、土豆、黄豆、花生和胡萝卜块的任一种或是几种；
步骤二、分离纯化：采用稀释涂布法对培养菌体进行分离纯化，直至得到纯菌株，将得到的菌株采用PDA培养基斜面保种，编号保存；
步骤三、初步筛选：将纯化菌株从斜面中挑取菌丝于试管中，加入苏丹II与苏丹IV混合液染色5分钟，用水冲洗后取染色的菌丝置于载波片上显微镜观察；选取脂肪粒大而多的菌株为初筛菌种并确定其编号；
所述苏丹II与苏丹IV混合液的配制：用30ml的丙酮与乙醇等体积混合液振荡溶解1g苏丹II后，静置24小时以上，取上清液或者过滤液；以同方法配制苏丹IV染液，将苏丹II染液与苏丹IV染液等体积混合；
步骤四、复筛：将初筛菌种采用PDA固体培养基扩大培养，得到的孢子采用液体培养基再次扩大培养；收获菌丝烘干后研磨，用石油醚提取油脂，经甲酯化后进行气相色谱分析，选取EPA含量高的菌株确定编号，完成EPA高产菌株的筛选；所述液体培养基的组成为：葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，硝酸钠3g/L，磷酸氢二钠1g/L，硫酸镁0.5g/L。
采用本发明筛选到EPA含量较高的菌株，其中编号SW-43的菌株经菌落菌丝形态、生理生化及18SrDNA鉴定为华丽腐霉。本发明通过诱导方法获得菌丝，先采用苏丹染色法挑选脂肪含量高的菌株，再进行气相色谱分析确定EPA高产菌株，快速有效地筛选到二十碳五烯酸产量高的真菌菌株，方法步骤简单、筛选周期短，而且所筛选菌株的花生四烯酸含量低、繁殖快、易培养，适合于工业化生产，对扩大EPA的微生物来源及其商业化生产具有重要意义。
附图说明
附图1为采用本发明方法筛选得到的SW-43号菌株脂肪酸甲酯的气相色谱图，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为电压值(mv)，经与标准品对照，EPA甲酯的出峰时间为17.90min，含量11.13％。附图2为SW-43号菌株脂肪酸甲酯质谱图，横坐标为质荷比(m/z)，纵坐标为电压值(mv)，经过NIST02版标准谱库检索，附图1色谱图中17.90mi n峰的质谱图与NIST中EPA甲酯质谱图主要的碎片离子峰完全一致，因此确认该成分为EPA甲酯。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明技术方案进行详细说明。其中，
1.PDA培养基参见[周德庆，微生物学实验教程(第二版)，高等教育出版社]，为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L，水1000ml；
2.PDA培养基中加入抗生素方法：在培养基灭菌后冷却至50℃～60℃时，将注射用硫酸链霉素和青霉素钠盐溶解后加入到培养基中，搅拌均匀后倒成平皿培养基；使培养基中硫酸链霉素600单位/ml、青霉素钠盐1000单位/ml；
3.苏丹II与苏丹IV混合液的配制和液体培养基组成与前述方法相同。
4.筛选出菌株的编号为SW-XX，其中SW意为陕西省微生物研究所。
实例1、(土样采集于湖北武汉花山镇丝瓜菜地5～15cm深处)
步骤一、诱导培养、分离纯化：将采集的土样分成10份，每份均摊在无菌平皿中，喷适量无菌水至土样湿润；另将约1公分大小的诱物块(土豆块)煮熟；凉后按每皿5块均匀放置在培养皿内的土样上，使诱物部分埋于土内，培养见诱物上有菌丝长出，立即将菌丝移植到含抗生素的PDA培养基平板上25℃培养2天；采用稀释涂布法对长出的菌株进行分离纯化，直至获得纯菌株；将得到的菌株采用PDA培养基斜面保种，并编号保存；
步骤二、初步筛选：按编号从PDA斜面中挑取菌丝于试管中，加入苏丹II与苏丹IV混合液染色5分钟，用水冲洗3次，挑少量菌丝置于载波片，用400倍显微镜观察菌丝，选取脂肪粒大而多的菌株(菌丝体内脂肪粒被染成红色)为初筛菌种并确定其编号(对初筛出菌种可以重新编号，并斜面保种)；
步骤三、复筛：将初筛菌种接种至PDA培养基斜面上，扩大培养3～5天后，用10ml无菌水洗脱斜面上孢子，用接种钩打散后把含孢子的水溶液倒入液体培养基中，于25℃、180转/分钟条件下培养5天；收获菌丝，抽滤后，蒸馏水洗3遍，80℃烘干至恒重；用研钵把菌丝研成粉末，称取1g菌粉置于离心管，用3ml石油醚(30～60沸程)抽提2次，蒸干溶剂，测定油脂含量。取油脂0.05g置于具塞试管中，加入0.5mol/L的KOH甲醇溶液1mL，60℃水浴中皂化15min，冷却后加入14％三氟化硼乙醚甲醇溶液2ml，于60℃水浴中振荡2min，冷却后加入正己烷1ml振荡，再加入饱和氯化钠溶液1ml，静置后取上清液进行气相色谱分析(脂肪酸甲酯)；炉温升温程序为180℃～200℃，5℃/min；再200℃～220℃，1℃/min；至220℃保持6min；进样器和检测器240℃；用标准二十碳脂肪酸甲酯为标准品确定二十碳五烯酸含量；选取EPA含量高的菌株确定编号，完成EPA生产菌株的筛选。
筛选出EPA含量高于5％的菌株有：SW-2的EPA含量5.98％；SW-5的EPA含量6.51％；SW-8的EPA含量8.34％；SW-16的EPA含量6.38％；SW-20的EPA含量7.99％。
实例2、(土样采集于陕西铜川市耀州区南街村农家葡萄园5～15cm深处)
按实例1的方法步骤操作；其中，将土样分成20份均摊在无菌平皿中，所用的诱物块为黄瓜、土豆和黄豆，按每皿3块均匀放置在培养皿内，其他操作均与实例1的方法步骤相同。
筛选出EPA含量高于5％的菌株有：SW-21的EPA含量8.75％；SW-28的EPA含量7.33％；SW-33的EPA含量8.12％；SW-35的EPA含量9.79％。
实例3、(土样采集于陕西蓝田县华胥镇白菜地5～15cm深处)
按实例1的方法步骤操作；其中，将土样分成20份均摊在无菌平皿中，所用的诱物块为黄瓜、土豆、黄豆、花生和胡萝卜按每皿3块均匀放置在培养皿内，其他操作均与实例1的方法步骤相同。
筛选出EPA含量高于5％的菌株有：SW-41的EPA含量10.04％；SW-43的EPA含量11.13％；SW-44的EPA含量9.17％；SW-45的EPA含量6.78％；SW-47的EPA含量7.82％；SW-48的EPA含量7.36％。
其中SW-43号菌株的EPA含量最高，为11.13％。对SW-43号菌株提取油脂进行气相色谱-质谱分析，再次确认EPA含量，其结果见附图1和附图2。

Claims (2)

1.一种二十碳五烯酸生产菌株的筛选方法，其特征在于，具体包括：
步骤一、诱导培养：将采集的土样置于无菌培养皿内，喷适量无菌水保持湿度，将经灭菌的诱物块按每皿1～5块均匀放置在培养皿内的土样上，使诱物部分埋于土内，培养见诱物上有菌丝长出，将菌丝移植到含硫酸链霉素600单位/ml和青霉素钠盐1000单位/ml的PDA培养基平板上25℃培养2天；所述土样采集于菜园或果园5～15cm深处；所述的诱物块为1公分大小的黄瓜、土豆、黄豆、花生和胡萝卜块的任一种或是几种；
步骤二、分离纯化：采用稀释涂布法对培养菌体进行分离纯化，直至得到纯菌株，将得到的菌株采用PDA培养基斜面保种，编号保存；
步骤三、初步筛选：将纯化菌株从斜面中挑取菌丝于试管中，加入苏丹II与苏丹IV混合液染色5分钟，用水冲洗后取染色的菌丝置于载波片上显微镜观察；选取脂肪粒大而多的菌株为初筛菌种并确定其编号；
步骤四、复筛：将初筛菌种采用PDA固体培养基扩大培养，得到的孢子采用液体培养基再次扩大培养；收获菌丝烘干后研磨，用石油醚提取油脂，经甲酯化后进行气相色谱分析，选取EPA含量高的菌株确定编号，完成EPA高产菌株的筛选。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤四中所述液体培养基的组成为：葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，硝酸钠3g/L，磷酸氢二钠1g/L，硫酸镁0.5g/L。
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