KR100680906B1 - 트라우스토키트리드 진균에서 다불포화 지방산의 수준을증가시키는 방법 - Google Patents

트라우스토키트리드 진균에서 다불포화 지방산의 수준을증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 점도의 증가를 위해서 폴리비닐 피롤리돈(PVP)이 보충된 배지를 사용하여 트라우스토키트리드 진균 중의 다불포화 지방산 수준을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 율케니아 라디아타 가에르트너(Ulkenia radiata Gaertner) 종에 상응하는 트라우스토키트리드 진균 균주 NIO-TH 21[더 내셔널 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼-테크놀로지 재팬(the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Japan)의 수탁 번호 제 AB22115 번 배양물이다]을 제공하는 1단계; 상기 균주를 배양 배지에 접종하는 2단계; 상기 2단계의 배양액을 2 일간 25 내지 30 ℃ 범위의 온도에서 증식시키는 3단계; 상기 3단계의 배양액을 상이한 농도의 폴리비닐 피롤리돈(PVP)을 갖는 배지에 접종하는 4단계; 상기 4단계의 배양액을 2 내지 5 일간 25 내지 30 ℃ 범위의 온도에서 별도로 증식시키는 5단계; 상기 5단계의 배양액으로부터 원심분리에 의해 세포를 수확하고 증가된 양의 도코사헥사에노산(DHA) 및 에이코사펜타에노산(EPA)을 추출하는 6단계;를 포함한다.
폴리비닐 피롤리돈(PVP), 트라우스토키트리드(thraustochytrid) 진균, 다불포화 지방산, 도코사헥사에노산(DHA), 에이코사펜타에노산(EPA)

Description

트라우스토키트리드 진균에서 다불포화 지방산의 수준을 증가시키는 방법{A method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid fungi}
본 발명은 트라우스토키트리드(thraustochytrid) 진균에서 다불포화 지방산의 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 트라우스토키트리드라 칭하는 진균 그룹에 속하는 미생물의 세포를 점도가 증가된 배지에서 증식시킴으로써 상기 세포 중의 다불포화 지방산인 도코사헥사에노산 및 에이코사펜타에노산을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 이어서 상기와 같이 다불포화 지방산(PUFA)이 풍부해진 세포를 다불포화 지방산이 필요한 각종의 유익한 용도에, 예를 들어 영양 보충을 위한 동물 사료, 인간의 음식물 및 상기 PUFA의 추출에, 상기 PUFA가 풍부하지 않은 세포보다 더 성공적으로 이용할 수 있다.
지방산은 성장, 생존 및 번식을 위해 모든 살아있는 유기체에 필요한 지질의 구성성분이다. 상기 지방산들 중에서, 탄소 원자들이 오직 단일 결합에 의해서만 서로 결합되고 이중 결합은 함유하지 않는 화학 구조를 갖는 것들이 포화 지방 산이다. 불포화 지방산은 탄소 원자들중 하나 이상이 이중 결합에 의해 서로 결합된 것이다. 다불포화 지방산(이후부터 PUFA라 칭함)은 상기와 같은 이중 결합이 하나 이상 발견되는 지방산이다.
PUFA들 중에서 동물 및 인류의 건강에 대단히 필수적인 것으로 간주되는 것 2 개가 있다. 이들은 도코사헥사에노산(DHA)과 에이코사펜타에노산(EPA)이다. DHA와 EPA의 분자 구조는 모두 처음 이중 결합에 이어서 지방산 구조의 메틸 말단의 세 번째 탄소 원자가 오는 구조이다. 따라서, 이들을 오메가-3 PUFA라 칭한다. DHA는 22 개의 탄소 원자를 함유하며, 이들 원자 사이에 6 개의 이중 결합들이 발견된다. EPA는 20 개의 탄소 원자를 함유하며, 이들 원자 사이에 5 개의 이중 결합이 나타난다. DHA와 EPA는 모두 인간의 건강과 동물의 영양에 중요한 것으로 나타났다. 인간의 건강에서, DHA와 EPA는 어린이의 두뇌 발달, 죽상경화증의 예방, 야맹증의 예방, 신경계 장애 및 심지어는 그런 대로 암의 예방에도 중요한 것으로 나타났다(Bajpai, P. 및 P.K. Bajpai, 1993, Journal of Biotechnology 30: 161-183; Barclay, W.R. et al., 1994, Journal of Applied Phycology 6: 123-129; 미국 특허 제 9428913 호; Singh, A. 및 O.P. Ward, 1997, Advances in applied microbiology, 45: 271-312). 이들 2 개의 오메가-3 PUFA는 갑각류 동물, 예를 들어 참새우의 생육 및 번식을 향상시키는 것으로 나타났으며, 이들 참새우는 인간 소비용 수생 양식용 동물로서 매우 중요하다(Harrison, K.E. 1990, Journal of Shellfish Research 9: 1-28). 따라서 인간의 음식물 및 동물 사료에 DHA 및 EPA를 혼입하는 것은 중요하게 고려된다. 트라우스토키 트리드 진균의 DHA 및 EPA 수준은 본 발명에 상세히 개시되는 바와 같이 점도가 증가된 배지에서 세포를 증식시킴으로써 천연 수준 이상으로 증가시킬 수 있으며, 이들 진균의 세포를 기존의 공정들에 비해 인간의 영양 보충식 및 동물용 사료로서 훨씬 더 잘 이용할 수 있다. 트라우스토키트리드를 널리 확립된 발효 기법을 사용하여 대규모로 배양할 수 있다. 이렇게 수득된 세포를 예를 들어 분무 건조 및 동결에 의해 적절히 가공 및 보존함으로써 동물 사료로서 사용할 수 있다. 상기 오메가-3 지방산이 증가된 세포 생물 자원을 또한 수확할 수 있으며 DHA 및 EPA를 순수한 형태로 추출할 수 있다. 이들을 필수 오메가-3 PUFA가 부족한 인간 식품의 보충에 사용할 수도 있다.
인간 소비용 EPA 및 DHA의 한가지 주요 공급원은 어유(fish oil) 형태이다. 그러나, 어유는 많은 인간 소비자들의 비위를 거스르는 냄새를 갖는다는 단점이 있다. DHA 및 EPA를 함유하는 어류는 또한 매우 계절을 타며 오메가-3 PUFA 함량이 가변적이다. 게다가, 대부분의 어유는 수소화되며 상기 오메가-3 PUFA가 파괴된다. 이러한 이유 때문에, 인간의 음식물 및 동물 사료에 사용하기에 적합한 것으로 대규모로 배양할 수 있는, EPA 및 DHA 함유 미생물들이 고려되고 있다(Bajpai, P. 및 P.K. Bajpai, 1993, Journal of Biotechnology 30: 161-183). 여러 단세포 식물들, 조류(algae)가 다량의 EPA 및 DHA를 함유하여 상기 용도로 고려되었다. 문헌[Alonso, D.L. et al., 1992, Aquaculture 102: 363-371]을 참조할 수 있다. 그러나, 이들 식물을 자연에서 대규모로 양식하는 것은 종종 이들 식물과 함께 성장하는 다른 미생물들의 문제를 겪게된다. 여기에는 인간 소 비자에 대한 건강상 문제가 있을 수 있다. 이들 식물을 발효조에서 순수한 배양물로 증식시키는 것은, 이들 식물이 빛을 필요로 하며 적합한 광 반응기는 유지 및 가동에 매우 비용이 많이들기 때문에 비용-집약적이다. 미생물은 값싼 영양분을 사용하여 대규모로 쉽게 배양할 수 있다. 다수의 미생물 그룹들이 다량의 EPA 및 DHA를 함유한다. 이러한 미생물들은 음식물로서 직접 사용되거나, 또는 추후의 사용을 위해서 이들 미생물들로부터 상기 PUFA를 추출할 수 있다. 다량의 DHA 및 EPA를 함유하는 미생물에 대한 연구는 트라우스토키트리드 진균이 가장 많은 양의 DHA 및 EPA중 일부를 함유함을 입증하였다. 트라우스토키트리드는 이미 상업적으로 중요한 것으로 간주되고 있다. 이들의 세포를 동물 사료에 사용하거나, 또는 상업적인 용도를 위해 PUFA의 추출에 사용한다(Singh, A. 및 O.P. Ward. 1997, Advances in applied Microbiology 45: 271-312). 일본 특허 제 9633263 호(1996년)에는 식품 첨가물, 영양 보충제, 유아용 우유 유동식용 첨가물, 사료 및 약물 첨가제와 같은 식품 산업 용도의 트라우스토키트리드 균주가 개시되어 있다. 상기 균주는 2 건조 중량% 이상의 DHA를 함유한다. 또 다른 일본 특허 제 980 3671 호(1998년)에는 트라우스토키트리드 진균의 지질로부터 DHA 및 또 다른 PUFA인 도코사펜타에노산(DPA)을 발효에 의해 생산하는 것이 개시되어 있다. 미국 특허 제 5,340,594 호에는 고 농도의 오메가-3 PUFA를 갖는 트라우스토키트리드 진균을 사용하는 전 세포 또는 추출된 미생물 제품의 생산 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 제 5,340,742 호에는 트라우스토키트리드 진균을 그의 생육에 적합한 한정된 배지에서 증식시키는 방법이 개시되어 있다. 상기 특허 들은 모두 다수의 트라우스토키트리드 배양물을 스크리닝하고, 최대의 DHA와 EPA 함량을 갖는 상기 균주를 선별하고, 이들의 돌연변이 균주를 제조하고, 상업적인 용도를 위해 최적의 배양 조건 하에서 상기와 같은 균주를 배양하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 주 목적은 상기 트라우스토키트리드 진균이 훨씬 더 많은 DHA 및 EPA의 상업적인 수율을 제공하도록 이들 진균의 상기 PUFA 수준을 더욱 증가시키는 것이다. 그 밖에, 상기 언급한 특허들은 단지 중간 정도의 DHA 및 EPA 농도를 가질 수 있는 다수의 균주들은 받아들이지 않고 있다. 본 발명에서는, 중간 정도 량의 DHA 및 EPA를 갖는 균주라도 이들을 점도가 증가된 배지에서 증식시킴으로써 상기 PUFA를 다량 생산하게 만들 수 있다. 천연적으로 높은 농도의 DHA 및 EPA를 갖는 균주들을 본 발명의 방법을 사용하여 상기 PUFA를 훨씬 더 많이 생산하게 만들 수 있다. 본 발명의 주 목적은 상기 상세히 개시한 바와 같은 단점들이 제거된, 트라우스토키트리드 진균의 PUFA 량을 증가시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트라우스토키트리드의 균주들을 이들이 최적의 영양 조건을 사용하여 통상적으로 생산하는 것보다 훨씬 더 많은 양의 DHA 및 EPA를 생산하게 만드는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트라우스토키트리드 진균의 배양물을 점도가 증가된 배지에서 증식시킴으로써 상기 지방산의 수준을 증가시키는 것이다.
발명의 요약
따라서, 본 발명은 점도의 증가를 위해서 폴리비닐 피롤리돈(PVP)을 보충시킨 배양 배지를 사용하여 트라우스토키트리드 진균 중의 다불포화 지방산 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 하기의 단계들을 포함한다:
단계 a: 율케니아 라디아타 가에르트너(Ulkenia radiata Gaertner) 종에 상응하는 트라우스토키트리드 진균 균주 NIO-TH 21[더 내셔널 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼-테크놀로지 재팬(the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Japan)의 수탁 번호 제 AB22115 번 배양물이다]을 제공하는 단계;
단계 b: 상기 균주를 배양 배지에 접종하는 단계;
단계 c: 상기 배양액을 2 일간 25 내지 30 ℃ 범위의 온도에서 증식시키는 단계;
단계 d: 상기 배양액을 상기 배지를 사용하는 접종물로서 사용하기 위해서 수득하여 상이한 농도의 폴리비닐 피롤리돈(PVP)을 갖는 배지에 접종하는 단계;
단계 e: 상기 배양액을 2 내지 5 일간 25 내지 30 ℃ 범위의 온도에서 별도로 증식시키는 단계;
단계 f: 상기 배양액으로부터 원심분리에 의해 세포를 수확하고 증가된 양의 도코사헥사에노산(DHA) 및 에이코사펜타에노산(EPA)을 추출하는 단계.
본 발명의 실시태양에서, 상기 배지의 점도를 0.1 내지 1.0% 범위 농도의 폴리비닐 피롤리돈(PVP)을 혼입시킴으로써 증가시킨다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 트라우스토키트리드 진균 세포 중의 PUFA의 수준을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 증가시키는 PUFA는 DHA 및 EPA이다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 점도가 증가된 배지에서 배양물을 증식시킴으로써 트라우스토키트리드 진균 세포 중의 DHA 및 EPA를 증가시킨다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 점도의 증가는 폴리비닐 피롤리돈(PVP)과 같이 영양분으로서 이용되지 않는 물질을 0.1 내지 1.0% 범위의 농도로 혼입시킴으로써 제공된다.
본 발명에 따라, 오메가-3 PUFA인 DHA와 EPA를 함유하는 트라우소키트리드 진균의 후보 종들의 배양물을 먼저 액체 영양 배지에 접종시킨다. 다른 트라우스토키트리드 진균에 속하는 진균 균주들, 예를 들어 트라우스토키트리움 스페시즈(Thraustochytrium sp.)에 속하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC) 수탁 번호 제 18906, 18907, 20890, 20891, 20892, 26185 번, 트라우스토키트리움 로제움 가에르트너(roseum Gaertner)에 속하는 제 28210 번 및 트라우스토키트리움 아우레움 골드스타인(aureum Goldstein)에 속하는 제 34304 번을 또한 사용할 수도 있다. 적합한 배지는 예를 들어 펩톤, 효모 추출물, 글루코스 및 해수를 함유하는 것이다. 또한 상기 진균의 양호한 생육을 지원하는 임의의 다른 배지도 사용할 수 있다. 배양액을 2 일간 25 내지 30 ℃ 범위의 실온에서 증식시킨다. 상기 배양액을 접종물로서 점도가 증가된 배지의 접종에 사용한다. 점도 증가를 위해 첨가되는 화합물은 미생물들에 의해 영양분으로서 이용되지 않고 단지 배지 점도의 증가에만 기여하는 통상적인 중합체들중 하나, 예를 들어 덱스트란 또는 폴리비닐 피롤리돈(PVP)일 수 있다. 예를 들어 폴리비닐 피롤리돈(PVP)은 염기성인 수용성 중합체이다(McGraw-Hill Encyclopaedia of Science and Technology, Vol. 10, 1982). PVP는 유체의 점도를 증가시키는데 통상적으로 사용되며 상기의 용도에 적합한 작용제이다(Podolsky, R.D. and R.B. Emlet, 1993. Journal of experimental biology 176: 207-221). 본 발명의 실시예에서, 0.1 내지 1.0% 농도의 PVP를 배지에 가한다. 배양액을 실험실, 회전 진탕기 상의 플라스크에서 증식시키거나 또는 대규모의 배양이 필요한 경우 발효조에서 증식시킬 수도 있다. 상기 배양액을 25 내지 30 ℃, 또는 특정 균주가 가장 잘 생육하는 임의의 온도에서 증식시킬 수 있다. 적합한 기간 후에, 예를 들어 2 내지 7 일간 증식시킨 후에, 상기 배양액으로부터 세포를 수확한다. 이는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 원심분리, 연속적인 유동 원심분리, 여과 등에 의해 수행될 수 있다. 상기와 같이 수득된 세포를 트라우스토키트리드 세포를 필요로하는 모든 용도에 사용할 수 있다. 이러한 용도에는 동물 사료, 인간 식품 보충제 또는 순수한 DHA 및 EPA 추출용의 세포 생물 자원이 포함될 수 있다.
따라서 본 발명은 오메가-3 PUFA, 즉 DHA 및 EPA의 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 의해, 트라우스토키트리드의 배양 균주를 이들이 다른 조건 하에서 생산할 수 있는 수준 보다 많은 수준의 이들 PUFA를 생산할 수 있게 만든다. 게다가, 통상적인 조건 하에서 단지 중간 정도 량의 이들 PUFA를 함유하는 균주들 조차도 그의 세포 내에 보다 많은 양을 생산할 수 있게 만든다.
이후에 본 발명을 첨부된 도면을 참고로 보다 상세히 개시하며, 이들은 단지 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것이다.
도 1은 액체 영양 배양 배지에서 증식 시, 형태학 및 생활사가 율케니아 라디아타 가에르트너 종에 상응하는 트라우스토키트리드 균주 NIO-TH 21(더 내셔널 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼-테크놀로지 재팬의 수탁 번호 제 AB22115 번 배양물이다)의 EPA 함량을 나타낸다.
도 2는 액체 영양 배양 배지에서 증식 시, 형태학 및 생활사가 율케니아 라디아타 가에르트너 종에 상응하는 트라우스토키트리드 균주 NIO-TH 21(더 내셔널 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼-테크놀로지 재팬의 수탁 번호 제 AB22115 번 배양물이다)의 DHA 함량을 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되며 따라서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.
실시예 1
# NIO-TH 21 균주에 속하는 트라우스토키트리드의 배양물을 젤라틴 펩톤(1.0%), 특정 펩톤(0.5%), 효모 추출물(0.01%), 간 추출물(0.02%), 글루코스(0.1%) 및 해수(100 ㎖)를 함유하는 배양 배지 100 ㎖에 접종하였다. 상기 배양액을 2 일간 25 내지 30 ℃의 실온에서 진탕기 상에서 증식시켰다. 이들 배양액을 실험을 위한 접종물로 사용하였다. 3 셋트의 배양액을 상기와 동일한 조성을 갖는 배지를 사용하여 준비하였다. 첫 번째 셋트는 0.1% 폴리비닐 피롤리돈이 첨가되었다. 두 번째 셋트는 0.5% PVP가 함유된 반면, 세 번째 셋트는 1.0% PVP를 함유하였다. 상기 접종물 10 ㎖을 각각의 셋트에 대해 배양 배지 100 ㎖에 가하여 실험을 수행하였다. 배양액을 3 일간 25 내지 30 ℃의 실온에서 진탕기 상에서 증식시켰다. 이 기간의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수확하고, 지방산을 추출하고 기체 크로마토그래피에 의해 분석하였다. PVP를 가하여 점도를 증가시킨 배지에서 증식된 배양물은 PVP의 증가가 없는 배지에서 증식된 것보다 거의 0.5 내지 2 배 이상의 EPA를 함유하였다(도 1).
실시예 2
# NIO-TH 21 균주에 속하는 트라우스토키트리드의 배양물을 젤라틴 펩톤(1.0%), 특정 펩톤(0.5%), 효모 추출물(0.01%), 간 추출물(0.02%), 글루코스(0.1%) 및 해수(100 ㎖)를 함유하는 배양 배지 100 ㎖에 접종하였다. 상기 배양액을 2 일간 25 내지 30 ℃의 실온에서 진탕기 상에서 증식시켰다. 이들 배양액을 실험을 위한 접종물로 사용하였다. 3 셋트의 배양액을 상기와 동일한 조성을 갖는 배지를 사용하여 준비하였다. 첫 번째 셋트는 0.1% 폴리비 닐 피롤리돈이 첨가되었다. 두 번째 셋트는 0.5% PVP가 함유된 반면, 세 번째 셋트는 1.0% PVP를 함유하였다. 상기 접종물 10 ㎖을 각각의 셋트에 대해 배양 배지 100 ㎖에 가하여 실험을 수행하였다. 배양액을 3 일간 25 내지 30 ℃의 실온에서 진탕기 상에서 증식시켰다. 이 기간의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수확하고, 지방산을 추출하고 기체 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 0.5 내지 1.0%의 PVP를 가하여 점도를 증가시킨 배지에서 증식된 배양물은 PVP가 없는 배지에서 증식된 것보다 거의 2 배 이상의 DHA를 함유하였다(도 1).
본 발명의 주요 이점은 하기와 같다:
1. 배양물에 통상적으로 존재하는 트라우스토키트리드의 DHA 및 EPA 수준을 더욱 증가시킬 수 있다.
2. 단지 중간 정도 량의 DHA 및 EPA를 갖는 균주들 조차도 이들 지방산이 풍부하게 될 수 있다.
3. 배지의 점도를 쉽게 입수할 수 있는 화학 약품인 폴리비닐 피롤리돈의 첨가에 의해 증가시킨다.
4. 폴리비닐 피롤리돈은 배양물에 의해 영양분으로서 이용되는 것이 아니므로, 상기 배양물의 정상적인 대사를 방해하지 않는다.
5. 폴리비닐 피롤리돈은 배양물에 대해 독성이 없고 그의 정상적인 대사에 유해하지 않다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법을 이용하면 트라우스토키트리드(thraustochytrid) 진균에서 다불포화 지방산의 수준을 증가시킬 수 있어, 다불포화 지방산이 필요한 각종의 유익한 용도에, 예를 들어 영양 보충을 위한 동물 사료, 인간의 음식물 및 상기 PUFA의 추출에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (4)

  1. 다음의 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 트라우스토키트리드(thraustochytrid) 진균 중의 다불포화 지방산 수준을 증가시키는 방법 :
    율케니아 라디아타 가에르트너(Ulkenia radiata Gaertner) 종에 상응하는 트라우스토키트리드 진균 균주 NIO-TH 21[더 내셔널 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼-테크놀로지 재팬(the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Japan)의 수탁 번호 제 AB22115 번 배양물이다]을 제공하는 1단계;
    상기 균주를 배양 배지에 접종하는 2단계;
    상기 2단계의 배양액을 2 일간 25 내지 30 ℃ 범위의 온도에서 증식시키는 3단계;
    상기 3단계의 배양액을 폴리비닐 피롤리돈(PVP) 또는 덱스트란을 포함하는 배지에 접종하는 4단계;
    상기 4단계의 배양액을 2 내지 5 일간 25 내지 30 ℃ 범위의 온도에서 증식시키는 5단계;
    상기 5단계의 배양액으로부터 원심분리에 의해 세포를 수확하고 증가된 양의 도코사헥사에노산(DHA) 및 에이코사펜타에노산(EPA)을 추출하는 6단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 2단계의 배양 배지는 펩톤; 효모 추출물; 글루코스; 및 해수를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 4단계의 배지는 폴리비닐 피롤리돈(PVP) 또는 덱스트란을 전체 배지에서 0.1 내지 1.0 중량% 범위의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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