CN1358839A - 利用海洋微藻异养培养生产长链多不饱和脂肪酸 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用传统的搅拌式发酵罐,以异养方式进行海洋微藻培养生产长链多不饱和脂肪酸,尤其是二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)的方法。其中所用的培养基为低盐度、成份简单工业适用的培养基。
Description
本发明涉及生产长链多不饱和脂肪酸(简称为PUFA)的方法。PUFA是细胞和有机体生物膜的重要组成成份，可调节细胞构型、动态平衡、相转变及细胞膜的渗透性，同时还调节与膜有关的生理过程，因此它们可以影响细胞的化学组成、信号传递、免疫及冷适应性，以及与此有关的疾病的发生，PUFA可以转化成调节人体某些生理功能的代谢产物。在人体内的PUFA类二十碳烯酸物质(eicosanoid)系统具有重要的生理调节功能，如前列腺素(postaglandins)，凝血黄素(thromboxanes)等，它们同激素一样，在组织中存在量很少，但是具有很强的调节功能，如前列腺素可以调节血压，而凝血黄素(thromboxanes)可以诱导血小板凝集。此外，它们心血管、呼吸、肠胃、视觉和免疫系统均有一定的调节作用，其中二十二碳烯酸(简称DHA)具有更重要的生理功能，近来研究也发现了二十二碳五烯酸(简称为DPA)的商业应用价值。DHA是细胞膜中长链多不饱和脂肪酸的主要成份，可以预防和治疗心血管疾病、预防和治疗癌症。在神经系统中，DHA主要存在于大脑灰质中，是人脑中ω-3PUFA的主要成分。研究发现哺乳动物脑中的DHA主要与记忆、学习能力有关。大脑中DHA含量的降低可导致学习记忆能力的减退。专家建议在妇女怀孕期及婴儿大脑发育早期应进食ω-3PUFA含量高的食品，如海鱼等以补充适量的DHA。
有关这些长链多不饱和脂肪酸的生理功能及其实际应用的研究已有较多报道，这也是人们重视食用鱼油的理论依据。传统的长链多不饱和脂肪酸多是从鱼油中提取的，但是由于从鱼油中提取的PUFA含有强烈的鱼腥味，而且鱼油中脂肪酸成份复杂，PUFA特别是EPA和DHA的分离提取过程不仅步骤多而且损失近50％。所以现在有很多专利是用来申请PUFA分离及纯化方法的，如果可以寻找一种脂肪酸成份单一、且多不饱和脂肪酸含量高的微生物来生产PUFA，不仅可以用传统的工业化发酵罐进行高细胞密度异养培养藻体，而且简化了DPA和DHA的纯化工艺和降低了难度。另一方面从海洋生物的食物链来看，藻类是鱼类的最基本食物，实验已表明鱼体内的多不饱和脂肪酸来源于藻类。然而，这些藻类如Thraustochytriaceae中的DPA和DHA含量不是很高。例如在C.Ratledge and S.G.Wilkinson所编辑的Microbial Lipid(P774-775，London Academic Press，1988-1989)一书中提到Thraustochytrium aureum的DPA含量占总脂肪酸的6.6％，DHA含量占总脂肪酸的10.8％。这样不利于降低生产成本。
另外，一般认为，微藻特别是有鞭毛的可以游动的藻类对机械搅拌比较敏感，传统的培养方式是鼓泡和振荡培养，或者是在很低的搅拌速度下进行培养。在下述的两篇文章中均提到机械搅拌培养可导致细胞干重的降低：Baipai P.K.，Baipai.，and Ward O.P.，Optimization of production ofdocosahexaenoic acid(DHA)by Thraustochytrium aureum ATCC 34304，J.Am.Oil Chem.Soc.，1991，68：509-514；and Iwao Iida，Toro Nakahara，ToshihiroYokochi，Yasushi Kamisaka，Hisaaki Yagi，Masakazu Yamaoka and OsamuSuzuki，Improvement of docosahexaenoic acid of Thraustochytrium aureum bymedium optimization，J.Ferm.Bioeng.，1996，81：76-78.
关于Thraustochytriaceae的培养，一般报告认为是在较低的温度下进行培养，高温会严重影响细胞的生长在以上两篇文献中培养温度为25℃。在LIZ.Y.and Ward O.P.，Production of docosahexaenoic acid byThraustochytrium roseum，J.Ind.Microb，1994，13：238-241中提到，当培养温度升到30℃时，细胞干重降低大约25％。在另一本由编写的书中MarineThraustochytrids and chytridiomycetes in the North area and in the selected otherregion提到在5-10℃之间细胞生长较好，在14℃时，细胞生长受到阻滞，在20℃叶细胞几乎停止生长。，其中还提到一篇文章也谈到这一问题，UlkenA.，uber zwei marine niedere pilze vom meeresboden der nordsee，veroff inst.Meeresforsch，Bremerh，Sonderbd，1968，3：71-74。
在本专利申请之前，仅有一篇中国专利涉及微藻培养生产DHA的报告(申请号94106621.5)，但它是利用隐甲藻Crypthecodiniumcohnii在液体培养基中连续振荡培养生产DHA。该发明所得到的Crypthecodiniumcohnii细胞，DHA产量低，细胞的长链多不饱和脂肪酸成分中只含有DHA一种长链多不饱和脂肪酸，如果用于营养补充剂生产工业，该发明很难有较高的经济效益，不适用于工业化生产。而且隐甲藻细胞壁厚，不易破壁，难于被人体消化，有的甲藻细胞还产生一种毒素，所以也很难利用整个细胞来作为营养添加剂。因此，需要提供一种高效、简便、经济地生产PUFA的方法。
本发明的目的是提供一种海洋微藻的培养方法；
本发明的另一目的是提供一种生产长链多不饱和脂肪酸，尤其是二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)的方法。
发明的详细描述
本发明提供了一种海洋微藻培养用的培养基，其包括碳源、氮源、无机盐，其中所述的碳源选自废糖蜜、玉米粉、蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、二氧化碳或其混合物；所述的氮源选自有机和无机氮化合物或其混合物；所述的无机氮化合物包括硝酸铵、硫酸铵、尿素或其混合物，有机氮化合物包括脯氨酸、精氨酸、、天冬氨酸、酪氨酸、蛋白胨、谷氨酸或其混合物。优选的氮源为硝酸铵、脯氨酸或其混合物。所述的无机盐这一种或多种选自下列的物质：钠盐、钾盐、镁盐、碳酸盐铁盐、锰盐、钴盐、钼酸盐、锌盐、硼化物、溴化物及其混合物。
在本发明的培养基中，所述的碳源浓度为10-200g/L，最好为20-100g/L；所用的氮源浓度是培养基中碳源浓度的1/2-1/10；所述的无机盐浓度，以钠盐为标准，为0.01-12ppm。培养基，其pH值为3.0-12.0。
对于无机盐类，使用天然海水是最好的，但也可以用各种钠盐、钾盐、镁盐、碳酸盐等配制，同时铁盐、锰盐、钴盐、钼酸盐、锌盐、硼化物、溴化物等也包括在本发明中。其中所配制的无机盐浓度以钠盐为标准，其浓度在0.01-12ppm。
本发明还提供了一种在上述的培养基中培养微藻的方法。这种方法是在通气和机械搅拌条件进行。所述的微藻是Thraustothytriaceae属藻类。
本发明所用的海洋微藻是能生产长链多不饱和脂肪酸的Thraustochytriaceae藻种，包括可以从ATCC(美国典型培养物收集中心)、日本大坂发酵工程研究所等保藏机构获得的藻种。上述微藻的说明性实例包括Schizochytrium sp.ATCC 18915，Schizochytrium aggregatum ATCC 28209，Schizochytrium sp.ATCC 20888，Schizochytrium sp.ATCC 20889，Schizochytrium limacinum SR21，Thraustochytrium roseum ATCC 28211，Schizochytrium mangrovei G13，Thraustochytrium sp.ATCC 18907等保藏藻种，其中最佳的是Schizochytrium aggregatum ATCC 28209。藻种均保藏于固体斜面上。
首先，对Thraustothytriaceae藻类进行驯化。即多次的高温条件下传代培养，只保留生长旺盛的藻种，而淘汰生长慢和生长微弱的藻种。
其次，对Thraustothytriaceae藻类进行预培养，所述的培养基中，硫酸铵的浓度应尽可能的小。优选脯氨酸与硫酸铵的比例大于2∶1，优选大于5∶1，更优选大于10∶1，最优选，脯氨酸完全代替硫酸铵。预培养的温度为5-30℃，优选为5-20℃，更优选为10-20℃。
经预培养后，再接种到上述的培养基中，其中在培养基中所用的碳源的浓度应高于预培养中所用的浓度，优选为预培养中所用的碳源浓度的1.5-15倍，更优选为2-8倍，最优选2-6倍。
由于经过驯化和预培养，本发明中所用的Thraustothytriaceae微藻能承受振荡和机械搅拌的培养条件，且能在无光的条件下异养生长。
本发明的微藻的可以为光照培养或异养培养。如利用传统的搅拌式发酵罐进行工业化生产PUFA。所得到藻类-Thraustochytriaceae的脂肪酸成份单一、DPA和DHA含量高。DPA/DHA含量分别占脂肪酸的10.24和30.05％。
上述的Thraustochytriaceae的微藻生产方法，分为两个阶段，第一是微藻的大量繁殖即以无性繁殖方式产生大量单鞭毛游动孢子，第二是细胞静止生长即长链多不饱和脂肪酸的累积阶段。
上述的Thraustochytriaceae的微藻生产经预培养后，可以在较高温度下进行培养，培养温度为10-50℃，优选为15-45℃，更优选为20-45℃，如20-40℃。
本发明还提供了一种长链多不饱和脂肪酸，包括二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的生产方法，其包括下列步骤：
(1)对Thraustothytriaceae藻类进行驯化；
(2)对Thraustothytriaceae藻类进行预培养；
(3)经预培养后，再接种到上述的培养基中，进行脂肪酸的生成和累积培养；
(4)提取细胞和酯化从而得到所需要的长链多不饱和脂肪酸，包括二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
上述的驯化是多次在高温条件下传代培养，只保留生长旺盛的藻种，而淘汰生长慢和生长微弱的藻种。驯化方法是在低温下培养如10℃，再于高温10-50℃摇瓶振荡培养，选择有活性的藻株，再于低温下，如此反复，选择性能稳定的藻珠。
在预培养中，所用的培养基硫酸铵的浓度应尽可能的小。优选脯氨酸完全代替硫酸铵。预培养的温度为5-30℃，优选为5-20℃，更优选为10-20℃。
本发明是通过对藻种的驯化，而使藻种在较高的搅拌速度下进行快速生长和生产多不饱和脂肪酸。
关于Thraustochvtriaceae的培养，一般报告认为是在较低的温度下进行培养，高温会严重影响细胞的生长，而本专利所涉及的藻种可以在较高的温度下有较高的生长速率，而且多不饱和脂肪酸含量没有降低。
海洋微藻Thraustochytriaceae的繁殖过程有无性或有性繁殖两种。在无性繁殖过程中，每个营养细胞经过细胞分裂释放2-8个游动孢子，这些孢子成熟后以经过细胞分裂使细胞数目成倍增加。有性繁殖过程中，细胞游动速度逐渐减慢，最后形成静止不动的配子母细胞，经过细胞分裂形成有性配子，两个配子结合形成体积膨大的接合子，再经过减数分裂，每个细胞分裂成四个单细胞完成其繁殖过程。在细胞的无性繁殖过程中，孢子游动速度快，细胞活跃，生长速度达到最高，如果可以在较短的时间内使细胞进入该生长阶段延长该段大量繁殖时间，可以有效的提高细胞干重。但是一般有利于细胞快速生长的培养基都会影向细胞长链多不饱和脂肪酸的含量，本发明人经过深入的研究，设计了一种有效的培养基和培养方法，可以明显改善细胞干重，并且可以有效地提高细胞长链多不饱和脂肪酸的含量。
另外本发明还提供了一种可以使细胞快速生长的培养方法。为了使藻细胞延长快速生长时间，要先将液体种子培养基中藻细胞的密度在短时间内提高到一定水平，这就需要进行种子培养。这个培养过程采用以上所述的培养基，在10℃-45℃间进行。
按照本发明所提供的方法，当藻细胞密度达到一定水平时，用搅拌式发酵罐作为培养容器进行分批培养。在培养过程中，逐渐提高搅拌速率，如果搅拌速率过高，虽然不会对细胞产生损害，但是对于细胞生长和提高氧气的溶解度没有帮助，而且提高了能源损耗。
在培养过程中，最佳的培养温度介于15-40℃之间，通气速度为0.2-2vvm，搅拌速度由100到600rpm。最后通过一般的分离方法，如高速冷冻离心、过滤等，从培养基中回收细胞，经过烘干或冻干后，用此回收的细胞进行长链多不饱和脂肪酸的提取。多不饱和脂肪酸的提取方法是通过使用有机溶剂系统如甲醇/氯仿、正己烷等从细胞中萃取脂肪成份，再经过转甲酯化，得到脂肪酸酯，最后通过柱层析得到进一步纯化的脂肪酸成份。
以下所列实施例只供本专利说明之用。
实施例1
菌种的保存
本发明实施例所使用的培养基I为：
NaCl 5g (NH4)2SO4 2g
KCl 2.21g MnCl2 0.005g
CaCl2.2H2O 1.02g ZnCl2 0.01g
MgSO4.7H2O 0.92g H3BO3 0.01g
蒸馏水1.0升。
本发明所用的实验菌种均保存于添加5g/L葡萄糖的上述培养基中。为了使细胞在培养过程中快速生长，首先要进行预培养。在藻种的保存过程中，一般都是将藻种所需的营养要求降至最低，以降低它的生长和细胞代谢速度，达到长期保存的目的。在进行正式的培养之前，都要将藻种预培养，使其从缓慢生长状态过渡到快速生长状态，并达到一定的细胞浓度。所用的预培养液体培养基中，用脯氨酸取代培养基I中的NH4SO4所实验的)脯氨酸和NH4SO4添加量为(1)脯氨酸∶NH4SO4＝0∶2；(2))脯氨酸∶NH4SO4＝0.5∶1；(3)脯氨酸∶NH4SO4＝1∶1；(4))脯氨酸∶NH4SO4＝1.5∶0.5；(5)脯氨酸∶NH4SO4＝2∶0。将一环藻细胞接种到上述5种培养基中，20℃摇床培养48小时，离心收集细胞，并用水洗两次，冷冻干燥过夜，称重。所得结果见下表。其中添加脯氨酸2.0g/L的培养基II所得的细胞干重最高。这个结果表明，在培养基中添加氨基酸可以促进细胞生长，有利于工业化生产。
表1.藻种的活化培养基组成
| 培养基添加物(g/L) | 细胞干重(mg/L) |
| 脯氨酸∶NH4SO4＝0∶2 | 3011 |
| 脯氨酸∶NH4SO4＝0.5∶1 | 3162 |
| 脯氨酸∶NH4SO4＝1∶1 | 3514 |
| 脯氨酸∶NH4SO4＝1.5∶0.5 | 3898 |
| 脯氨酸∶NH4SO4＝2∶0 | 4210 |
实施例2
藻种的异养培养及长链多不饱和脂肪酸的生产
取一环ATCC28209细胞接种到培养基II中，在10-20℃摇床中以50-200rpm的转速培养48小时，细胞浓度达到106时完成预培养，再以1-20％的接种量接种到蔗糖浓度为20g/L的培养基II中，氮源精氨酸为3g/L，在20-45℃摇床中以100-350rpm的转速培养96小时。同时以同样的接种量、同样的培养条件在光照摇床中培养96小时，同时在培养中通以二氧化碳作为无机碳源。取100ml发酵液离心收集藻细胞，并用水洗两次，以去除残留的培养基，然后进行冷冻干燥。干燥后测得光照条件下细胞产率为0.063g/L/hr，异养培养条件下细胞率为0.078g/L/hr。根据经典的Bligh-Dyer(1959)脂肪酸提取及酯化方法，称取一定量的冻干细胞，与甲醇∶氯仿∶水＝1∶2∶0.8的混合液一起搅拌30分钟，得到藻细胞的脂，并由此进行甲酯化，从而得到多不饱和脂肪酸甲酯，进行气相色谱检测。经色谱确定，两种培养条件下，藻细胞中脂肪酸含量如下表所示：
表二.不同培养条件下藻细胞中多不饱和脂肪酸的组成
| 脂肪酸组成 | 光照培养 | 异养培养 | ||||
| 占总脂肪酸(％) | 占细胞干重(％) | 产量(mg/L/hr) | 占总脂肪酸(％) | 占细胞干重(％) | 产量(mg/L/hr) | |
| C12∶0 | 0.15 | 0.04 | 0.03 | 0.32 | 0.07 | 0.05 |
| C14∶0 | 10.49 | 2.47 | 1.56 | 14.6 | .06 | 2.39 |
| C15∶0 | 22.14 | 5.11 | 3.22 | 6.41 | 1.31 | 1.02 |
| C16∶0 | 28.42 | 7.03 | 4.43 | 31.74 | 7.0 | 5.46 |
| C16∶1 | 3.82 | 0.95 | 0.61 | 8.67 | 1.91 | 1.49 |
| C18∶0 | 0.78 | 0.19 | 0.12 | 0.68 | 0.15 | 0.12 |
| C18∶1 | 5.06 | 1.25 | 0.79 | 3.67 | 0.81 | 0.63 |
| C20∶4 | 0.83 | 0.78 | 0.49 | 0.28 | 0.23 | 0.18 |
| C20∶5 | 0.89 | 1.03 | 0.66 | 1.12 | 1.16 | 0.90 |
| C22∶5 | 9.45 | 5.47 | 3.45 | 8.69 | 4.48 | 3.49 |
| C22∶6 | 17.97 | 4.75 | 2.99 | 23.82 | 5.59 | 4.36 |
实施例3
发酵罐中ATCC28209的异养培养及长链多不饱和脂肪酸的生产
取一环ATCC28209细胞接种到培养基II中，在10-20℃摇床中以50-200rpm的转速培养48小时，细胞浓度达到106时完成预培养，再以1-20％的接种量接种到1.5L葡萄糖浓度为80g/L和氮源谷氨酸浓度为35g/L的培养基中，在2.4L的发酵罐中进行搅拌培养。搅拌速度为200-800rpm，通气量为0.2-2vvm，培养基中溶解氧浓度控制在10-100之间，以聚氧丙烯甘油作为消泡剂，在发酵过程中维持自然pH值。培养至96小时放罐，这时取样测定培养基中糖的含量，结果保持在0-2之间，这说明发酵已完毕，为正常发酵。取100ml发酵液离心收集藻细胞，并用水洗两次，以去除残留的培养基，然后进行冷冻干燥。干燥后测得细胞产率为0.64g/L/hr。根据经典的Bligh-Dyer(1959)脂肪酸提取及酯化方法，称取一定量的冻干细胞，与甲醇∶氯仿∶水＝1∶2∶0.8的混合液一起搅拌30分钟，得到藻细胞的脂，并由此进行甲酯化，从而得到多不饱和脂肪酸甲酯，进行气相色谱检测，藻细胞中脂肪酸含量如表3所示。剩余的培养液经离心洗涤后，与正己烷溶液混合搅拌2个小时，进行多不饱和脂肪酸的抽提，所得的多不饱和脂肪酸按Bligh-Dyer(1959)的方法进行酯化及气相色谱法测定，测得多不饱和脂肪酸的提取率为70％。
表3.2.4L发酵罐中藻细胞多不饱和脂肪酸的含量
| 脂肪酸组成 | 发酵罐培养 | ||
| 占总脂肪酸(％) | 占细胞干重(％) | 产量(mg/L/hr) | |
| C12∶0 | 0.29 | 0.06 | 0.38 |
| C14∶0 | 9.92 | 2.05 | 13.12 |
| C15∶0 | 18.33 | 3.79 | 24.26 |
| C16∶0 | 26.86 | 5.83 | 37.31 |
| C16∶1 | 0.68 | 0.15 | 0.96 |
| C18∶0 | 0.69 | 0.15 | 0.96 |
| C18∶1 | 0.31 | 0.06 | 0.38 |
| C20∶4 | 0.65 | 0.55 | 3.52 |
| C20∶5 | 1.98 | 2.04 | 13.06 |
| C22∶5 | 10.24 | 5.18 | 33.15 |
| C22∶6 | 30.05 | 6.96 | 44.54 |
比较实施例3
改进的2.4L发酵罐中ATCC28209的异养培养及多不饱和脂肪酸的生产
按与实施例3相同的条件进行藻种的预培养及发酵培养，但是在本例中，发酵罐的通气口改用砂芯玻璃，这样提高了培养基中溶解氧的浓度。最后测得干细胞的生产率为0.84g/L，藻细胞中多不饱和脂肪酸的含量见表4。
表4.改进的2.4L发酵罐中藻细胞多不饱和脂肪酸的含量
| 脂肪酸组成 | 发酵罐培养 | ||
| 占总脂肪酸(％) | 占细胞干重(％) | 产量(mg/L/hr) | |
| C12∶0 | 0.28 | 0.09 | 0.76 |
| C14∶0 | 9.23 | 3.01 | 25.28 |
| C15∶0 | 13.54 | 4.4 | 36.96 |
| C16∶0 | 22.48 | 7.68 | 64.52 |
| C16∶1 | 1.97 | 0.67 | 5.68 |
| C18∶0 | 0.73 | 0.25 | 2.1 |
| C18∶1 | 2.66 | 0.91 | 7.64 |
| C20∶4 | 0.36 | 0.35 | 2.94 |
| C20∶5 | 0.78 | 1.26 | 10.58 |
| C22∶5 | 16.39 | 11.48 | 96.43 |
| C22∶6 | 31.58 | 13.03 | 109.45 |
实施例4
16L发酵罐中ATCC28209的异养培养及多不饱和脂肪酸的生产
按与比较实施例3相同的条件下进行ATCC28209的16L罐发酵培养，采用硅油做为消泡剂，使得培养基中溶氧程度提高。最后得到细胞产率为0.95g/L，DHA的产率为142.5mg/L/hr。
实施例5
16L发酵罐中微藻的异养培养及多不饱和脂肪酸的生产
按照实施例4的方法培养Schizochytrium sp.ATCC 18915，Schizochytrium aggregatum ATCC 28209，Schizochytrium sp.ATCC 20888，Schizochytrium sp.ATCC 20889，Schizochytrium limacinum SR21，Thraustochytrium roseum ATCC 28211，Schizochytrium mangrovei G13，Thraustochytrium sp.ATCC 18907，并进行细胞产率及多不饱和脂肪酸产量的测定。结果见表5。
表5.不同藻细胞中DHA和DPA的含量
| DHA占细胞干重(mg/g) | DHA产量(mg/L) | DPA占细胞干重(mg/g) | DPA产量(mg/L) | |
| Schizochytrium sp.ATCC 18915 | 6.98 | 206.6 | 4.89 | 144.62 |
| Schizochytrium aggregatum ATCC 28209 | 271.8 | 13862 | 90.6 | 4620.7 |
| Schizochytrium sp.ATCC 20888 | 33.21 | 1195.63 | 26.57 | 956.5 |
| Schizochytrium sp.ATCC 20889 | 49 | 1568.15 | 34.3 | 1097.7 |
| Schizochytrium limacinum SR21 | 277 | 13300 | 46.18 | 2216.7 |
| Thraustochytrium roseum ATCC 28211 | 17.63 | 296.2 | 3.52 | 59.2 |
| Schizochytrium mangrovei G13 | 73.31 | 2170 | - | - |
| Thraustochytrium sp.ATCC 18907 | 13.22 | 327.8 | 10.57 | 262.2 |
-：为检测不到
因此按以上所述，按照本发明的方法，通过机械搅拌式发酵罐利用微藻异养培养方法工业化生产DHA，可以低成本地稳定提供没有腥味的DHA、DPA及其它长链多不饱和脂肪酸，替代现有的从鱼油中高成本的提取方法，也减少了季节和地域的限制。
以上用实施例对本发明进行了描述。本领域的普通技术人员在上述的基础之上可以作出多种变动而不脱离本发明的精神。
Claims (14)
1、一种培养基，包括碳源、氮源、无机盐，其中所述的碳源选自废糖蜜、玉米粉、蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉二氧化碳或其混合物；所选述的氮源选自有机氮化合物、无机氮化合物或其混合物；所述的无机盐这一种或多种选自下列的物质：钠盐、钾盐、镁盐、碳酸盐铁盐、锰盐、钴盐、钼酸盐、锌盐、硼化物、溴化物及其混合物。
2、权利要求1的培养基，其中所述的碳源为蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉二氧化碳或其混合物，所述的无机氮化合物包括硝酸铵、硫酸铵、尿素或其混合物，有机氮化合物包括脯氨酸、精氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、蛋白胨、谷氨酸或其混合物。
3、权利要求1的培养基，其中所述的碳源浓度为10-200g/L，优选为8-60g/L，如10-20g/L，最好为20-100g/L；所用的氮源浓度是培养基中碳源浓度的1/2-1/10；所述的无机盐浓度，以钠盐为标准，为0.01-12ppm。
4、权利要求1的培养基，其pH值为3.0-12.0。
5、一种长链多不饱和脂肪酸，包括二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的生产方法，其包括下列步骤：
(1)对Thraustothytriaceae藻类进行驯化；
(2)经驯化后Thraustothytriaceae藻类在权利要求1的培养基中进行预培养；
(3)经预培养后，进行藻细胞的快速生长和多不饱和脂肪酸的累积；
(4)收集细胞和酯化从而得到所需要的长链多不饱和脂肪酸。
6、权利要求5的方法，其中预培养的温度为5-30℃，优选为10-25℃，更优选为10-220℃。
7、权利要求5的方法，上述的Thraustochytriaceae经预培养后的培养温度为10-50℃，优选为15-45℃，更优选为20-45℃，如20-40℃。
8、权利要求5的方法，其中所述的培养是在通气和搅拌条件下进行的。
9、权利要求5的方法，其中所述的培养可以在有光或无光条件下进行。
10、一种Thraustothytriaceae微藻培养方法，包括下列步骤：
(1)对Thraustothytriaceae微藻在高温条件下传代培养进行驯化；
(2)对经驯化后的Thraustothytriaceae藻类在权利要求1-7之一的培养基中进行预培养；
(3)经预培养后，再接种到上述的权利要求1-7之一的培养基中，其中在该步骤培养基中碳源的浓度为预培养中碳源浓度的1.5-20倍，更优选为2-15倍，最优选2-10倍。
11、权利要求8的方法，其中预培养中脯氨酸与硫酸铵的比例大于2∶1，优选大于5∶1，更优选大于10∶1，最优选，脯氨酸完全代替硫酸铵。
12、权利要求8的方法，其中预培养的温度为5-30℃，优选为5-25℃，更优选为10-20℃。
13、权利要求8的方法，上述的Thraustochytriaceae经预培养后的培养温度为10-50℃，优选为15-45℃，更优选为20-45℃，如20-40℃。
14、Thraustochytriaceae在生产不饱和脂肪酸，特别是二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸中的应用。
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