JPH08294384A - 海洋性微細藻類のシード培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】主発酵での藻体の誘導時間が非常に短縮され、
極めて藻体の生産性の高いシードの培養方法およびその
シードを用いたドコサヘキサエン酸の製造方法の提供。 【構成】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエ
ン酸を産生する能力を有する藻類のシードを培養するに
際し、シード培養終了時に、主発酵の初発炭素源濃度の
０．３〜１．３倍の濃度の炭素源がシード培養液中に存
在する海洋性微細藻類のシード培養方法およびそのシー
ドを用いたドコサヘキサエン酸の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ドコサヘキサエン酸を
産生する能力のある渦鞭毛藻類を良好に増殖させドコサ
ヘキサエン酸の生産性を高めるための振盪培養方法や深
部通気攪拌培養方法などに用いるシードの培養方法に関
するものである。ドコサヘキサエン酸は、近年、コレス
テロール低下作用、抗血液凝固作用、学習機能向上作用
など多彩な生理作用が報告されている高度不飽和脂肪酸
である。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生理作用が報告されている高度不
飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸について、魚油以
外に起源を求めて微生物などに選択的に産生させる検討
が行なわれてきた。中でも海洋性微細藻類に属するクリ
プテコディニウム・コーニーを増殖させることによりド
コサヘキサエン酸を産生させることが検討されている。
クリプテコディニウム・コーニーなど海洋性微細藻類の
培養は通常静置状態での培養が行なわれてきた。しかし
ながら、工業的な規模での培養を目的とした場合、藻体
増殖速度とドコサヘキサエン酸含量を考えると振盪培養
法または深部通気攪拌培養法による培養が好ましい。

【０００３】クリプテコディニウム・コーニーの培養を
扱ったものについて幾つか挙げて示すと、Ｒ．Ｃ．タッ
トュルら（Phycologia, 14(1), 1-8(1975)参照）が、培
養時の温度やｐＨ、照射光強度の世代時間への効果を報
告しているが、シード培養の方法とその効果については
全く触れられていない。また、マーテック社による検討
では、ドコサヘキサエン酸の収量の増大を目的として深
部通気攪拌培養方法が試みられている（ＷＯ９１／１１
９１８）が、やはりシードの培養方法とその本培養の誘
導時間への効果については触れられていない。

【０００４】一方、本発明者らは、特開平５−２７６９
６３号で、ドコサヘキサエン酸産生能を有する海洋性微
細藻類の振盪培養方法や深部通気攪拌培養方法について
示し、また、特開平６−２５３８１７号である特定の炭
素源を至適な濃度で存在させることにより極めて良好な
藻体の増殖性とドコサヘキサエン酸の生産性が得られる
ことを示した。しかしながら、海洋性微細藻類に属し、
かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を有する藻類
の深部通気攪拌培養などにおいて、シードを主発酵の生
産用培地へ接種した後に、新しい環境への適応のために
藻体の誘導時間が１２〜４８時間程に長くなる場合が見
受けられ、藻体の生産性が低下する場合がしばしば観察
された。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、海洋
性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生す
る能力を有する藻類の深部通気攪拌培養などにおいて、
シードを主発酵の生産用培地へ接種した後の新しい環境
への適応のための誘導時間を短縮させるシードの培養方
法の開発が望まれていた。本発明は、これらの課題の少
なくとも１つを解決するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決するために鋭意検討した結果、海洋性微細
藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力
を有する海洋性微細藻類のシードを培養するに際し、シ
ード培養終了時にシード培養液中の炭素源の濃度が主発
酵に用いる生産用培地の初発炭素源濃度の０．３〜１．
３倍となるように炭素源を残存させることにより、主発
酵での藻体の誘導時間が非常に短縮されることを見いだ
し本発明をなすに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、海洋性微細藻類に属
し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を有する
藻類のシードを培養するに際し、シード培養終了時に、
主発酵の初発炭素源濃度の０．３〜１．３倍の濃度の炭
素源がシード培養液中に存在する海洋性微細藻類のシー
ド培養方法を提供する。そして、炭素源が、グルコー
ス、ガラクトース、およびラクトースの加水分解物から
なる群から選ばれる少なくとも１種であるのが好まし
い。さらに、その藻類が、クリプテコディニウム・コー
ニー(Crypthecodinium cohnii) ＡＴＣＣ３００２１で
あるのが好ましい。また、シード培養終了時に炭素源の
濃度を主発酵を行う生産用培地の初発炭素源濃度の０．
３〜１．３倍とした培養液中のシードを該生産用培地に
移し、培養した藻体からドコサヘキサエン酸を得るドコ
サヘキサエン酸の製造方法を提供する。

【０００８】以下に、本発明を詳細に説明する。海洋性
微細藻類としてクリプテコディニウム・コーニーなどに
属する藻類のシードを培養するに際し、シード培養の終
了時に、シード培養液中のグルコース、ガラクトースな
どの炭素源の濃度が、主発酵に用いる生産用培地の初発
炭素源濃度の０．３〜１．３倍となるように炭素源を残
存させることが肝要であって、これにより、主発酵での
藻体の誘導時間が非常に短縮されるばかりでなく、高度
不飽和脂肪酸としてドコサヘキサエン酸のみの脂質中の
割合を高度に上昇させたまま、藻体の生産性を顕著に向
上できる点で特筆すべきである。

【０００９】本発明において利用される微生物は海洋性
微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する
ものであればいずれでもよく、例えばクリプテコディニ
ウム・コーニー(Crypthecodinium cohnii) などがあ
る。これらの微生物としてＡＴＣＣ（American Type Cu
lture Collection）などの各種保存機関から入手できる
公知のものも利用することが可能である。具体例として
は、クリプテコディニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２
１、３０５４３、３０５５６、３０５７１、３０６７
２、３０７７５、５００５１、５００５３、５００５
５、５００５６、５００５８、５００６０等が挙げられ
る。このほか該微生物に例えば、紫外線照射や各種変異
剤による処理等の公知の変異処理を施した変異株の使用
も本発明に包含されるものである。

【００１０】本発明に用いられるシード培養の終了時の
シード培養液中の炭素源の濃度は、主発酵を行う生産用
培地の初発炭素源濃度の０．３〜１．３倍の範囲であ
る。シード培養終了時の炭素源の濃度が０．３倍未満で
は、シード培養液と生産用培地との炭素源の濃度差によ
り、シードを主発酵に用いる生産用培地に添加した後の
主発酵時の藻体増殖の速度が著しく遅くなり誘導時間の
改善（短縮）が見られず好ましくない。また、シード培
養終了時の炭素源の濃度が１．３倍を越えるものはシー
ド培養に必要な時間が長くなり非効率的で実質的に用い
られず好ましくない。

【００１１】本発明のシード培養に用いるシード用培地
の炭素源の濃度は、シード培養の終了時に残存する炭素
源の濃度が、主発酵（本培養）開始の初発炭素源の濃度
の０．３〜１．３倍であれば、特に限定するものではな
いが、０．５〜５０ｇ／ｌ、特に１．０〜４０ｇ／ｌで
あるのが好ましい。また、シード培養中の炭素源は、シ
ード培養の終了時の炭素源の濃度が本発明のシード培養
液と生産用培地との炭素源濃度の関係を示す範囲内であ
れば、シード培養開始時に必要な炭素源の全量をシード
用培地に添加していても、シード培養の開始後、連続的
にあるいは数回に分けて添加してもよい。特に、シード
培養の期間全体に対する割合でシード培養開始時から１
／１０〜１／２の時間からシード培養の終了時までのシ
ード培養液中の炭素源の濃度が、主発酵の初発炭素源濃
度の本発明の範囲の濃度であるのが好ましい。

【００１２】シード培養に用いる培地は、下記の炭素
源、窒素源、無機塩類等を含有する。炭素源としては例
えば、ガラクトース、グルコースや、ラクトースの加水
分解物などの炭水化物、魚油、大豆油などの油脂類、乳
酸、酢酸などの有機酸類、エタノールなどのアルコール
類などが挙げられ、中でもガラクトース若しくはグルコ
ース、またはこれらの混合物が最適である。窒素源とし
ては例えば、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトン、廃糖
蜜、コーンスティープリカーなど有機態窒素や、硝酸カ
リウム、塩化アンモニウムなど無機態窒素が挙げられ、
さらにこれらを組み合わせることも可能である。

【００１３】無機塩類としては、市販の人工海水の濃縮
物を用いることも可能であるが、例えば、塩化ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどを組み合わ
せて用いることも可能である。重金属元素を含む成分と
しては、例えば、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛などの
単体、イオン、塩化物、硫酸塩、硝酸塩など種々の塩が
挙げられる。以上のほか、重金属元素を含む成分の安定
化のために例えば、ホウ酸やエチレンジアミン四酢酸を
用いることも可能である。

【００１４】培地のｐＨは通常５〜８である。このｐＨ
安定化のために例えば、トリスヒドロキシメチルアミノ
メタン、モルホリノエタンスルホン酸などの緩衝剤を用
いることも可能である。

【００１５】シード培養の温度としては通常１５〜３４
℃で藻体生産を行なうことが可能である。シード培養の
時間は、１２〜２４０時間であるのがシードとしての活
性が強い点で好ましい。シード培養の方法は、液体静置
培養、回転振盪あるいは往復振盪による液体振盪培養な
どが挙げられるが、特に液体振盪培養であるのが静置培
養に比べシード培養時間の短縮がはかれ、シードと
して本培養移植時の活性が強いので好ましい。液体振盪
培養の場合は、５０〜４００ｒｐｍで１２〜１２０時間
行うのが好ましい。

【００１６】本発明のシード培養方法によって得られる
シード培養液は、海洋性微細藻類の藻体を１．５〜１５
ｇ／Ｌ（乾燥藻体重量で）含有する。さらに、シード培
養液中には、０．５〜５０ｇ／Ｌのグルコースまたはガ
ラクトースあるいはそれらの混合物が残存するのが好ま
しい。そして、本発明のシード培養方法によって得られ
るシードは、シードとしての活性が高いうえに、主発酵
培地との炭素源濃度差が小さいので短時間の誘導時間後
に、主発酵を行う生産用培地での振盪培養や深部通気攪
拌培養で十分な量の藻体増殖を行うことができ、また、
藻体中のドコサヘキサエン酸含有量が高い。

【００１７】主発酵（本培養）では、本発明のシード培
養方法で得られるシード培養液をシードとして生産用培
地に添加し、培養することで、ドコサヘキサエン酸を含
有する藻体を生産性よく得ることができる。主発酵に用
いる生産用培地は、シード培養に用いる培地と同様の各
種成分を有する培地を使用することができる。生産用培
地中の初発炭素源濃度は、生産用培地の初発炭素源濃度
に対するシード培養の終了時の炭素源の濃度が、０．３
〜１．３倍の範囲であれば特に限定されるものではない
が、０．５〜５０ｇ／ｌであるのが好ましい。また、シ
ード培養の終了時のシード培養液中の炭素源と生産用培
地中の初発炭素源濃度の関係がこの範囲内であれば、主
発酵の開始時に主発酵に必要な炭素源の全量を生産用培
地に添加していても、主発酵の開始後の炭素源を、連続
的にあるいは数回に分けて添加してもよい。生産用培地
に添加するシード培養液の量は、生産用培地１Ｌに対し
て、１０〜３００ｍｌであるのが好ましい。

【００１８】主発酵の温度としては通常１５〜３４℃で
藻体生産を行なうことが可能である。主発酵の時間は、
通常４８〜３６０時間である。主発酵の方法は、回転振
盪あるいは往復振盪による液体振盪培養、液体通気攪拌
培養、深部通気攪拌培養などで行うことができる。液体
振盪培養の場合は、１５〜３４℃、５０〜４００ｒｐｍ
で２〜１５日間培養するのが好ましい。液体通気攪拌培
養の場合は、１５〜３４℃、５０〜６００ｒｐｍで２〜
１５日間培養するのが好ましい。本発明のシード培養方
法で培養されたシードを用いて、液体振盪培養や深部通
気攪拌培養により主発酵を行うと、従来は、シードを用
いても藻体を主発酵へと導く誘導時間が長かったものを
短縮することができる。すなわち、従来より１／５〜２
／３短い誘導時間でシード培養の１．２〜１０倍の増殖
速度を有する主発酵とすることができる。このような主
発酵で得られる藻体は、乾燥藻体重量で、１．０〜１
５．０重量％のドコサヘキサエン酸を含む。

【００１９】主発酵の培養終了後、主発酵の培養液から
の藻体の回収は、一般的な方法、例えば、１０℃、８０
００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離法や濾紙およびガラス
フィルターによる濾過法等により行なうことが可能であ
る。このように回収した藻体をそのままか、あるいは凍
結乾燥法、熱風乾燥法などにより乾燥藻体としたのち、
ドコサヘキサエン酸を高度に含有する粗脂質を抽出する
ことが可能である。

【００２０】藻体からドコサヘキサエン酸を高度に含有
する粗脂質の抽出の方法としては、Folch 法やBligh-Dy
er法に代表されるクロロホルム／メタノール系等の有機
溶媒による一般的な抽出方法を用いることが可能であ
る。

【００２１】粗脂質からのドコサヘキサエン酸の精製
は、常法に従って行なうことが可能である。例えば、粗
脂質をＮａＯＨなどでケン化したのちそのままか、ある
いは酸またはアルカリ触媒によりアルコールエステルと
することで、カラムクロマトグラフィーまたは分別、蒸
留、超臨界抽出などの方法によって容易に純品として得
ることが可能である。これは藻体中にドコサヘキサエン
酸と物性の非常に似通った高度不飽和脂肪酸が同時に含
まれていないことによるもので、従来の魚油などからの
精製に比較して非常に簡便で効率良くドコサヘキサエン
酸を得ることが可能である。

【００２２】以上のように本発明によれば、海洋性微細
藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力
を有する海洋性微細藻類のシードを製造するに際し、シ
ード培養の終了時にシード培養液中の炭素源の濃度が主
発酵に用いる生産用培地の初発炭素源濃度の０．３〜
１．３倍となるように炭素源を残存させることにより、
誘導時間が非常に短縮されるが、本発明の趣旨に従い通
常行なわれる改変は本発明に含まれる。

【００２３】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説
明するが、これらの実施例が本発明の範囲を限定するも
のでないことは言うまでもない。下記の実施例中、海洋
性微細藻類の藻体生産性は培養後の藻体の乾燥藻体重量
で示し、また、ドコサヘキサエン酸の含有量は乾燥藻体
からクロロホルム／メタノール（２：１）で抽出される
粗脂質を三フッ化ホウ素メタノール錯体で脂肪酸メチル
エステルとし、ヘプタデカン酸を内部標準として、産生
したドコサヘキサエン酸をガスクロマトグラフィーによ
り定量することにより測定した。

【００２４】（比較例１、２）下記表１に示す生産用培
地３Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンタに入れて滅菌をし
た。冷却後、これにシードとして下記表２に示すシード
用培地で予め２８℃で３日間、１８０ｒｐｍで液体振盪
培養したクリプテコディニウム・コーニーＡＴＣＣ３０
０２１の培養液３００ｍｌを接種し、本培養として、２
８℃で７日間、攪拌速度２５０ｒｐｍ、通気量０．６７
ｖｖｍ、培養中のｐＨ値はコントロールせずに深部通気
攪拌培養を行なった。培養藻体から得た乾燥藻体収量の
経時変化は図１に示す結果を得た。図１中、横軸は本培
養の開始からの培養時間を示し、縦軸は本培養で得た乾
燥藻体収量を示す。

【００２５】（実施例１、２）シード用培地として下記
表３に示す培地を用いる以外は比較例１、２と同様にシ
ード培養と、本培養である深部通気攪拌培養を行ない、
図２に示す結果を得た。図２中、横軸は本培養の開始か
らの培養時間を示し、縦軸は本培養で得た乾燥藻体収量
を示す。

【００２６】（実施例３）シード用培地として下記表４
に示す培地を用いて４日間液体振盪培養した以外は、比
較例１、２と同じ条件で本培養を行なった。培養藻体か
ら得た乾燥藻体収量の経時変化は図３に示す結果を得
た。図３中、横軸は本培養の開始からの培養時間を示
し、縦軸は本培養で得た乾燥藻体収量を示す。

【００２７】（実施例４）シード用培地として下記表５
に示す培地を用いて５日間液体振盪培養してシードを調
製し、これを下記表５に示す生産用培地へ接種し、比較
例１、２と同じ条件で本培養を行なった。培養藻体から
得た乾燥藻体収量の経時変化は図４に示す結果を得た。
図４中、横軸は本培養の開始からの培養時間を示し、縦
軸は本培養で得た乾燥藻体収量を示す。

【００２８】

【００２９】 ＊括弧内の値は生産用培地中のグルコース濃度に対する 培養後のシード用培地中のグルコース濃度の比

【００３０】 ＊括弧内の値は生産用培地中のグルコース濃度に対する 培養後のシード用培地中のグルコース濃度の比

【００３１】 ＊括弧内の値は生産用培地中のグルコース濃度に対する 培養後のシード用培地中のグルコース濃度の比

【００３２】

【００３３】＊Ｂ／Ａの値は生産用培地中のグルコース
濃度に対する 培養後のシード用培地中のグルコース濃度の比

【００３４】

【発明の効果】本発明の培養方法によって、海洋性微細
藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力
を有する海洋性微細藻類のシードを培養するに際し、シ
ード培養終了時にシード培養液中の炭素源濃度が主発酵
に用いる生産用培地の初発炭素源濃度の０．３〜１．３
倍となるように炭素源を残存させることにより、主発酵
の藻体の誘導時間が非常に短縮されるので、極めて生産
性が高い。さらに従来は原料の供給が不安定で品質が一
定せず、独特の臭気をもつ魚油からの抽出と高度な分離
精製技術により得ていたドコサヘキサエン酸を産生する
藻体を高濃度に安定して生産できる点で工業的に有効な
効果を奏するものである。本発明は上述の効果の内少な
くとも１つを奏するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 比較例１および２の本培養の培養時間と藻体
収量の関係を示すグラフである。

【図２】 実施例１および２の本培養の培養時間と藻体
収量の関係を示すグラフである。

【図３】 実施例３の本培養の培養時間と藻体収量の関
係を示すグラフである。

【図４】 実施例４の本培養の培養時間と藻体収量の関
係を示すグラフである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキ
   サエン酸を産生する能力を有する藻類のシードを培養す
   るに際し、シード培養終了時に、主発酵の初発炭素源濃
   度の０．３〜１．３倍の濃度の炭素源がシード培養液中
   に存在することを特徴とする海洋性微細藻類のシード培
   養方法。
2. 【請求項２】前記炭素源が、グルコース、ガラクトー
   ス、およびラクトースの加水分解物からなる群から選ば
   れる少なくとも１種である請求項１に記載の海洋性微細
   藻類のシード培養方法。
3. 【請求項３】前記藻類が、クリプテコディニウム・コー
   ニー(Crypthecodinium cohnii)ＡＴＣＣ３００２１であ
   る請求項１または２に記載の海洋性微細藻類のシード培
   養方法。
4. 【請求項４】シード培養終了時に炭素源の濃度を主発酵
   を行う生産用培地の初発炭素源濃度の０．３〜１．３倍
   とした培養液中のシードを該生産用培地に移し、培養し
   た藻体からドコサヘキサエン酸を得ることを特徴とする
   ドコサヘキサエン酸の製造方法。