JPH0795876A

JPH0795876A - 海洋性微細藻類の培養方法

Info

Publication number: JPH0795876A
Application number: JP5242782A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Uehara; 原健一上; Tokio Iizuka; 塚時男飯; Daizo Takeuchi; 内大造武
Original assignee: Kawasaki Steel Corp
Current assignee: JFE Steel Corp
Priority date: 1993-09-29
Filing date: 1993-09-29
Publication date: 1995-04-11

Abstract

(57)【要約】【目的】他の高度不飽和脂肪酸を含まず、高濃度に安定
して生産でき、かつ、非常に簡便な分離精製技術により
純度の高いドコサヘキサエン酸を得る海洋性微細藻類の
培養方法の提供。【構成】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエ
ン酸を産生する能力を有する藻類を培養して増殖させた
藻体よりドコサヘキサエン酸を製造するに際し、培養し
て得られた藻体を、前駆物質を含有する培地中で、さら
に培養する海洋性微細藻類の培養方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ドコサヘキサエン酸を
産生する能力のある海洋性微細藻類を良好に増殖させド
コサヘキサエン酸の生産性を高めるための培養方法に関
するものである。ドコサヘキサエン酸は、近年、コレス
テロール低下作用、抗血液凝固作用、学習機能向上作用
など多彩な生理作用が報告されている高度不飽和脂肪酸
である。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生理作用が報告されている高度不
飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸について、魚油以
外に起源を求め微生物などに選択的に産生させる検討が
行われてきた。中でも、海洋性微細藻類に属するクリプ
テコディニウム・コーニーを増殖させることによりドコ
サヘキサエン酸を産生させることが検討されている。

【０００３】クリプテコディニウム・コーニーなど海洋
性微細藻類の培地は採取する場所により生理的性質が異
なったり、滅菌によって沈殿を形成する海水を基本とし
て、この海水に欠乏しやすい栄養物質を添加した天然培
地よりも、高圧滅菌によっても沈殿を形成せず実験の再
現性も保証される合成培地が好ましい。

【０００４】クリプテコディニウム・コーニーの培養に
ついて合成培地を用いたものを幾つか挙げて示すと、Ｒ
・ジェームス・ヘンダーソンらによるＡＸＭ培地（Ｐｈ
ｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７（６），１６７９−１
６８３（１９８８）参照）や、Ｒ・Ｃ・タットュルらに
よるＭＬＨ培地（Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ，１４（１），
１−８（１９７５）参照）が報告されているが、藻体の
増殖性に対する前駆物質の影響や、ドコサヘキサエン酸
の生産性に対する影響については触れられていない。

【０００５】また、マーテック社による検討では、ドコ
サヘキサエン酸の収量の増大を目的として天然海水また
は人工海水を基本とし、グルコースと酵母エキスを加え
た培地による培養が報告されている（ＷＯ９１／１１９
１８）が、ドコサヘキサエン酸に対する前駆物質の影響
や、ドコサヘキサエン酸の生産性に対する影響について
は触れられていない。

【０００６】一方、本発明者らは、特願平０４−３４４
２７９号で特定の糖類、有機窒素源類、無機塩類および
重金属元素を含有する成分を必須成分とする培地を用い
て、藻類の安定した増殖とドコサヘキサエン酸の高い生
産性を示した。しかし、前駆物質として特に、加えるべ
き適切な物質、その濃度、添加時期についての記載はな
い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、海洋
性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生す
る能力を有する藻類を安定に増殖させ、その藻体からド
コサヘキサエン酸を製造するに際し、安定に脂質中のド
コサヘキサエン酸の含有量をさらに高めるための簡便
で、かつ、有効な培養方法の開発にある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明では、これらの問
題点を解決するために鋭意検討した結果、ドコサヘキサ
エン酸を産生する能力を有する海洋性微細藻類を培養す
るに際し、培養して得られた藻体を前駆物質を存在させ
た培地中でさらに培養するか、あるいは、前駆物質を添
加することにより、藻体増殖とドコサヘキサエン酸の生
産性が高まることを見いだし、本発明をなすに至った。

【０００９】すなわち、本発明は、海洋性微細藻類に属
し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を有する
藻類を安定に増殖させ、その藻体よりドコサヘキサエン
酸を製造するに際し、培養して得られた藻体を前駆物質
を存在させた培地中でさらに培養する海洋性微細藻類の
培養方法を提供する。また、海洋性微細藻類に属し、か
つ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を有する藻類を
培養して増殖させた藻体よりドコサヘキサエン酸を製造
するに際し、培養液に前駆物質を添加して培養する海洋
性微細藻類の培養方法を提供する。そして、前記藻類
が、クリプテコディニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅ
ｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉ）ＡＴＣＣ３００２１
であるのが好ましい。また、前駆物質が、炭水化物類で
あるのが好ましい。また、前駆物質が、有機酸類である
のが好ましい。また、前駆物質が、油脂類であるのが好
ましい。

【００１０】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
において利用される微生物は、海洋性微細藻類に属し、
かつ、ドコサヘキサエン酸を産生するものであればいず
れでもよく、例えばクリプテコディニウム・コーニー
（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉ）な
どがある。これらの微生物として、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ）などの各種保存機関から入手できる公知のもの
も利用することが可能である。具体例としては、クリプ
テコディニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２１、３０５
４３、３０５５６、３０５７１、３０６７２、３０５７
５、５００５１、５００５３、５００５５、５００５
６、５００５８、５００６０等が挙げられる。このほか
微生物に、例えば、紫外線照射や各種変異剤による処理
等の公知の変異処理を施した変異株の使用も本発明に包
含されるものである。

【００１１】本発明において海洋性微細藻類の液体振盪
培養および液体深部培養による増殖およびドコサヘキサ
エン酸の産生に関しては、得られた藻体を前駆物質を存
在させた培地中でさらに培養するか、あるいは、得られ
た藻体に培養の途中で、前駆物質を添加して培養するこ
とが肝要である。したがって、本発明の培養方法を２つ
の態様に分けて、以下に説明する。なお、本発明に用い
る微生物は、あらかじめ少量の藻体を、２０〜３１℃、
８０〜２５０ｒｐｍで２〜１０日間振盪培養する（前培
養）。前培養の終了時に、培養液中の藻体数は、１０⁵
〜１０⁷個／ｍｌである。

【００１２】本発明の第１の態様は、海洋性微細藻類を
１度培養して増殖させた後、遠心分離などでいったん藻
体を回収し、さらに、前駆物質を存在させた培地中でも
う１度培養する。そこで、本培養を２段階に分けて、前
半を本培養、後半を後培養とする。この態様では、一
度、海洋性微細藻類の藻体を、炭素源、窒素源、無機塩
類、重金属元素を含む成分等を含有する培地を用いて培
養する。この段階で使用する培地の１例としては、下記
表１に示される培地が挙げられる。

【００１３】本発明において用いられる培地成分のうち
炭素源としては、例えば、ガラクトース、グルコースな
どの炭水化物、魚油、大豆油などの油脂類、乳酸、酢酸
などの有機酸類、エタノールなどのアルコール類などが
挙げられ、さらにこれらを組み合わせることも可能であ
る。

【００１４】窒素源としては、例えば、酵母エキス、牛
肉エキス、ペプトン、廃糖蜜、コーンスティープリカー
などの有機態窒素や、硝酸カリウム、塩化アンモニウム
などの無機態窒素が挙げられ、さらにこれらを組み合わ
せることも可能である。

【００１５】無機塩類としては、市販の人工海水の濃縮
物を用いることも可能であるが、例えば、塩化ナトリウ
ム、硫酸マグネシウムなどを組み合わせて用いることも
可能である。

【００１６】重金属元素を含む成分としては、例えば、
鉄、マンガン、コバルト、亜鉛などの単体、イオン、塩
化物、硫酸塩、硝酸塩など種々の塩が挙げられる。以上
のほか、重金属元素を含む成分の安定化のために例え
ば、ホウ酸やエチレンジアミン四酢酸等を用いることも
可能である。

【００１７】培地のｐＨは通常５〜９、好ましくは６〜
８である。このｐＨ安定化のために、例えば、トリスヒ
ドロキシメチルアミノメタン、モルホリノエタンスルホ
ン酸などの緩衝剤を用いることも可能である。

【００１８】本培養後、いったん遠心分離などにより藻
体を回収し、新たに前駆物質を含む培地に藻体を移して
から再度培養（後培養）する。この段階で用いる培地
は、前段階で用いた培地組成に、前駆物質を加えて得ら
れた培地である。このような培地の例としては、下記表
２〜４に示される培地が挙げられる。

【００１９】本発明において用いられる前駆物質には、
油脂類のように、大きな修飾作用を受けずにドコサヘキ
サエン酸になり得るものだけではなく、広くドコサヘキ
サエン酸を生合成するうえで必要となる物質も含まれ
る。このような物質としては、例えば、脂肪酸合成の出
発物質であるアセチルＣｏ−Ａや、ＮＡＤＰＨを供給で
きる物質が含まれる。具体的には、可溶性澱粉、グルコ
ースなどの炭水化物類、乳酸、ピルビン酸などの有機酸
類、トリオレイン、オリーブ油などの油脂類などが挙げ
られる。

【００２０】本発明において用いられる前駆物質の濃度
は、培地中０．１〜５０ｇ／ｌ、好ましくは０．５〜１
０ｇ／ｌである。培地中の前駆物質の濃度が０．１ｇ／
ｌ未満では、添加した効果が小さいばかりか、ドコサヘ
キサエン酸を含有する油脂の回収を目的とする藻体の分
離時期の調整が大変難しい。また、５０ｇ／ｌを超える
と、添加した割には、効果が小さいため不経済である。

【００２１】培養方法としては、静置培養法を用いるこ
とも可能であるが、海洋性微細藻類の藻体生産性と脂質
中のドコサヘキサエン酸の含量を考えると、振盪培養法
または深部通気攪拌培養法による培養が好ましい。振盪
培養および深部通気攪拌培養の方法は、特願平０４−０
７７１８９号明細書に記載の通りの方法を用いればよ
い。培養温度としては通常１５〜３４℃で藻体生産を行
なうことが可能である。培養時間は、本培養の開始から
通常２〜１０日間で本培養を終え、その後１〜５日間前
駆物質を含む培地で後培養するのが、藻体の増殖、ＤＨ
Ａ収量が向上するので好ましい。振盪は、往復振盪であ
っても、回転振盪であってもよく、８０〜２５０ｒｐｍ
であるのが好ましい。

【００２２】本発明の第２の態様は、海洋性微細藻類を
増殖させ、培養の途中で前駆物質を添加して培養を継続
する。したがって、本培養は、一連の継続した系であ
る。本発明の第２の態様で、培養の開始時に用いる培地
は、炭素源、窒素源、無機塩類、重金属元素を含む成分
等を含有し、各成分は、上述の通りである。最初、本発
明の第１の態様と同様に本培養を開始すればよく、この
段階の培養は、本発明の第１の態様の本培養と同じ条件
で行えばよい。次に、培養の途中で、前駆物質を添加し
て培養を継続する。前駆物質は、本発明の第１の態様に
使用したものと同じ物質である。前駆物質を添加する時
期は、培養の開始から２〜１０日後であると、藻体の増
殖が対数増殖期になったときに、前駆物質の取込みが良
好である点で好ましい。また、添加の方法は、例えば、
各種前駆物質を粉末または液状のまま、これらを培養液
中に添加してもよいが、各種前駆物質を含んだ溶液を調
製して、これを常套の方法により滅菌した後、培養液中
に添加する方法が、簡便で好ましい。そして、各種前駆
物質を含んだ溶液は、前駆物質を蒸留水、リン酸緩衝
液、生理食塩水等に溶かし、濾過、高圧蒸気などにより
滅菌することによって得られる。また、前駆物質を添加
する方法は、１度に全てを添加しても、また、数回に分
けて添加しても、一定量を連続して添加してもよい。前
駆物質を添加しながら培養を継続することにより、多量
の藻体が培養でき、短時間に安定したＤＨＡ収量を得る
ことができる点で優れている。

【００２３】前駆物質の添加量は、培地中、０．１〜５
０ｇ／ｌ、好ましくは０．５〜１０ｇ／ｌになるように
添加する。培地中の前駆物質の濃度が０．１ｇ／ｌ未満
では、添加した効果が小さいばかりか、ドコサヘキサエ
ン酸を含有する油脂の回収を目的とする藻体の分離時期
の調整が大変難しい。また、５０ｇ／ｌを超えると、添
加した割には、効果が小さいため不経済である。

【００２４】培養方法としては、静置培養法を用いるこ
とも可能であるが、海洋性微細藻類の藻体生産性と脂質
中のドコサヘキサエン酸の含量を考えると、振盪培養法
または深部通気攪拌培養法による培養が好ましい。振盪
培養および深部通気攪拌培養の方法は、特願平０４−０
７７１８９号明細書に記載の通りの方法を用いればよ
い。培養温度としては通常１５〜３４℃で藻体生産を行
なうことが可能である。振盪は、往復振盪であっても、
回転振盪であってもよく、８０〜２５０ｒｐｍであるの
が好ましい。

【００２５】培養終了後、培養液から藻体を回収する方
法は、一般的な方法、例えば、１０℃、８０００ｒｐ
ｍ、１０分間の遠心分離法や濾紙およびガラスフィルタ
ーによる濾過法等により行なうことが可能である。この
ように回収した藻体をそのままか、あるいは凍結乾燥
法、熱風乾燥法などにより乾燥藻体としたのち、ドコサ
ヘキサエン酸を高度に含有する粗脂質を抽出することが
可能である。

【００２６】藻体からドコサヘキサエン酸を高度に含有
する粗脂質を抽出する方法としては、Ｆｏｌｃｈ法やＢ
ｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法に代表されるクロロホルム／メタ
ノール系等の有機溶媒による一般的な抽出方法を用いる
ことが可能である。

【００２７】粗脂質からドコサヘキサエン酸を精製する
方法は、常法に従って行なうことが可能である。例え
ば、粗脂質をＮａＯＨなどでケン化したのち、そのまま
か、あるいは酸またはアルカリ触媒によりアルコールエ
ステルとすることで、カラムクロマトグラフィーまたは
分別、蒸留、超臨界抽出などの方法によって容易に純品
として得ることが可能である。これは藻体中にドコサヘ
キサエン酸と物性の非常に似通った高度不飽和脂肪酸が
同時に含まれていないことによるもので、従来の魚油な
どからの精製に比較して非常に簡便で効率良くドコサヘ
キサエン酸を得ることが可能である。

【００２８】以上のように本発明によれば、海洋性微細
藻類を培養する際に、培養して得られた藻体を前駆物質
を含む培地でさらに培養するか、培養途中に前駆物質を
添加することにより、藻体の安定した増殖がはかれ、他
の高度不飽和脂肪酸を含まず、脂質中のドコサヘキサエ
ン酸の含量を顕著に上昇させたまま、海洋性微細藻類の
生産性を向上できることが特筆すべき点であるが、本発
明の趣旨に従い通常行なわれる改変は本発明に含まれ
る。

【００２９】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説
明するが、これらの実施例が本発明の範囲を限定するも
のでないことは言うまでもない。下記の実施例中、海洋
性微細藻類の藻体生産性は培養後の藻体の乾燥藻体重量
で示し、また、ドコサヘキサエン酸の含有量は乾燥藻体
からクロロホルム／メタノール（２：１）で抽出される
粗脂質を三フッ化ホウ素メタノール錯体で脂肪酸メチル
エステルとし、ヘプタデカン酸を内部標準として産生し
たドコサヘキサエン酸をガスクロマトグラフィーにより
定量することにより測定した。

【００３０】また、本発明の実施例および比較例には、
下記に記載の表１〜２の培地を用いた。

【００３１】

【００３２】（実施例１〜７）表１に示す培地それぞれ
１００ｍｌを、３００ｍｌ容三角フラスコに入れて滅菌
をした。冷却後、この培地に、グルコース１０ｇ／ｌ、
酵母エキス２ｇ／ｌを人工海水アクアマリン（八洲薬品
株式会社製）に溶解しｐＨ７．４に調整した培地で予め
７日間、１８０ｒｐｍ、２８℃で振盪培養したクリプテ
コディニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２１の培養液５
ｍｌを各々接種し、本培養として、２８℃で、５日間回
転振盪培養（１８０ｒｐｍ）を行なった。この本培養で
得た培養液を遠心分離（１０℃、８０００ｒｐｍ、１０
分間）して湿藻体を得た。

【００３３】さらに、得られた藻体を表３に示す前駆物
質を含む表２に記載の培地中へ添加し、２８℃で２日回
転振盪培養（１８０ｒｐｍ）を行った（後培養）。培養
藻体から得た乾燥藻体重量とドコサヘキサエン酸の含有
量は表３に示す結果を得た。なお、藻体中の脂質の各成
分と含有量を以下に示す。

【００３４】（比較例１）後培養で、前駆物質を添加し
ない以外は、実施例１〜４と同様に、予め７日間前培養
した後、表１に記載された培地をもちいて本培養を行な
った。遠心分離して得られた培養藻体を再び前駆物質を
含まない表１に示される培地を用いて後培養を行い、得
た乾燥藻体重量とドコサヘキサエン酸の含有量は、表３
に示す結果を得た。

【００３５】（比較例２）実施例１〜４と同様に、予め
７日間前培養した後、表１に記載された培地をもちいて
本培養を行なった。後培養は行わず、遠心分離して得ら
れた培養藻体から得た乾燥藻体重量とドコサヘキサエン
酸の含有量は、表３に示す結果を得た。

【００３６】

【表１】

【００３７】（実施例８および９）表１に示す培地それ
ぞれ１００ｍｌを、３００ｍｌ容三角フラスコに入れて
滅菌をした。冷却後、この培地に、グルコース１０ｇ／
ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌを人工海水アクアマリン（八洲
薬品株式会社製）に溶解しｐＨ７．４に調整した培地で
予め７日間、１８０ｒｐｍ、２８℃で振盪培養したクリ
プテコディニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２１の培養
液５ｍｌを各々接種し、本培養として、２８℃で、５日
間回転振盪培養（１８０ｒｐｍ）を行なった。その後、
本培養で得られた培養液に、表４に記載の各前駆物質を
５．０ｍｌの蒸留水に溶解したものを濾過滅菌後添加
し、後培養として、２８℃で２日間回転振盪培養（１８
０ｒｐｍ）を行った。培養藻体から得た乾燥藻体重量と
ドコサヘキサエン酸の含有量は表３に示す結果を得た。

【００３８】（実施例１０〜１３）表４に記載されてい
る前駆物質（有機酸類）を５ｍｌの蒸留水に溶解したも
のを濾過滅菌したものを添加する以外は、実施例８およ
び９と同様に培養を行い、表４に示す結果を得た。

【００３９】（実施例１４）表４に記載されている前駆
物質（油脂）と５ｍｌの蒸留水とを混合し、高圧蒸気滅
菌したものを添加する以外は、実施例１および２と同様
に培養を行い、表４に示す結果を得た。

【００４０】（比較例３）後培養で、前駆物質を添加し
ない以外は、実施例１〜４と同様に、予め７日間前培養
した後、表１に記載される培地をもちいて本培養を行な
い、遠心分離して得られた培養藻体から得た乾燥藻体重
量とドコサヘキサエン酸の含有量は、表４に示す結果を
得た。

【００４１】

【表２】

【００４２】

【発明の効果】本発明の培養方法によれば、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する海洋性微細藻類を培養
する際に、培養して得られた藻体を、前駆物質を含む培
地中でさらに培養するか、または、前駆物質を添加する
ことにより、非常に良好な藻体の増殖を示すばかりでな
く、他の高度不飽和脂肪酸を含まず、脂質中のドコサヘ
キサエン酸の含量を顕著に上昇させることができる。従
来は、ドコサヘキサエン酸の製造は、魚油からの抽出に
より得ていたが、原料の供給が不安定で品質が一定せ
ず、独特の臭気をもち、また、高度な分離精製技術によ
りドコサヘキサエン酸を得ていたが、本発明の培養方法
により、ドコサヘキサエン酸を高濃度に安定して生産で
き、かつ、非常に簡便な分離精製技術により純度の高い
ものを供給できる点で工業的に有効な効果を奏するもの
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する藻類を培養して増殖さ
せた藻体よりドコサヘキサエン酸を製造するに際し、培
養して得られた藻体を、前駆物質を含有する培地中で、
さらに培養することを特徴とする海洋性微細藻類の培養
方法。
【請求項２】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する藻類を培養して増殖さ
せた藻体よりドコサヘキサエン酸を製造するに際し、培
養液に前駆物質を添加して培養することを特徴とする海
洋性微細藻類の培養方法。
【請求項３】前記藻類が、クリプテコディニウム・コー
ニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉ
ｉ）ＡＴＣＣ３００２１である請求項１に記載の海洋性
微細藻類の培養方法。
【請求項４】前記前駆物質が、炭水化物類である請求項
１〜３のいずれかに記載の海洋性微細藻類の培養方法。
【請求項５】前記前駆物質が、有機酸類である請求項１
〜３のいずれかに記載の海洋性微細藻類の培養方法。
【請求項６】前記前駆物質が、油脂類である請求項１〜
３のいずれかに記載の海洋性微細藻類の培養方法。