JPH06327464A

JPH06327464A - 海洋性微細藻類の培養方法

Info

Publication number: JPH06327464A
Application number: JP5119678A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Uehara; 原健一上; Tokio Iizuka; 塚時男飯; Daizo Takeuchi; 内大造武
Original assignee: Kawasaki Steel Corp
Current assignee: JFE Steel Corp
Priority date: 1993-05-21
Filing date: 1993-05-21
Publication date: 1994-11-29

Abstract

(57)【要約】【目的】藻体の安定した増殖と、ドコサヘキサエン酸以
外の高度不飽和脂肪酸を含まず、ドコサヘキサエン酸の
含量を顕著に上昇させる海洋性微細藻類の培養方法の提
供。【構成】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエ
ン酸を産生する能力を有する藻類を培養して増殖させた
該海洋性微細藻類の藻体からドコサヘキサエン酸を得る
に際し、培地中に有機窒素源類として以下の群から選ば
れる少なくとも１つを存在させる海洋性微細藻類の培養
方法。（１）コーンスティープリカー（２）コーンスティープリカーおよび酵素消化動物肉エ
キス（３）酵母エキス（４）スキムミルク

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ドコサヘキサエン酸を
産生する能力のある海洋性微細藻類を良好に増殖させド
コサヘキサエン酸の生産性を高めるための培養方法に関
するものである。ドコサヘキサエン酸は、近年、コレス
テロール低下作用、抗血液強固作用、学習機能向上作用
など多彩な生理作用が報告されている高度不飽和脂肪酸
である。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生理作用が報告されている高度不
飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸について、魚油以
外に起源を求め微生物などに選択的に産生させる検討が
行われてきた。中でも海洋性微細藻類に属するクリプテ
コディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）を
増殖させることによりドコサヘキサエン酸を産生させる
ことが検討されている。

【０００３】クリプテコディニウム・コーニーなど海洋
性微細藻類の培地は、採取する場所により生理的性質が
異なったり、滅菌によって沈殿を形成する海水を基本と
して、これに欠乏しやすい栄養物質を添加した天然培地
よりも、高圧滅菌によっても沈殿を形成せず実験の再現
性も保証される合成培地が好ましい。

【０００４】クリプテコディニウム・コーニーの培養に
ついて合成培地を用いたものを幾つか挙げて示すと、Ｒ
・ジェームス・ヘンダーソンらによるＡＸＭ培地（Phyt
ochemistry, 27 (6),1679-1683(1988)参照）やＲ・Ｃ・
タットュルらによるＭＬＨ培地（Phycologia, 14 (1),1
-8(1975)参照）が報告されているが、ドコサヘキサエン
酸の生産性への効果については触れられていない。

【０００５】また、マーテック社による検討では、ドコ
サヘキサエン酸の収量の増大を目的として天然海水また
は人工海水を基本とし、グルコースと酵母エキスを加え
た培地による培養が報告されている（ＷＯ９１／１１９
１８）が、合成培地の個々の成分が藻体増殖やドコサヘ
キサエン酸蓄積に及ぼす効果については触れられていな
い。

【０００６】一方、本発明者らは、特願平０４−３４４
２７９号で特定の糖類、有機窒素源類、無機塩類および
重金属元素を含有する成分を必須成分とする培地を用い
て、藻類の安定した増殖とドコサヘキサエン酸の高い生
産性を示した。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、海洋
性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生す
る能力を有する藻類を安定に増殖させ、藻体のまま利用
に供したりその藻体からの抽出によるドコサヘキサエン
酸を製造するに際し、脂質中のドコサヘキサエン酸の含
量をさらに高めるための簡便でかつ有効な培地組成の開
発が望まれている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決するために鋭意検討した結果、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する海洋性微細藻類をコー
ンスティープリカー、またはコーンスティープリカーお
よび酵素消化動物肉エキス、または酵母エキス、または
スキムミルクを存在させた培地で培養することにより、
藻体の安定した増殖と脂質中のドコサヘキサエン酸の含
量が顕著に上昇することを見いだし、本発明をなすに至
った。

【０００９】すなわち、本発明は海洋性微細藻類に属
し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を有する
藻類を培養して増殖させた海洋性微細藻類の藻体をその
まま利用に供したり、その藻体から抽出によるドコサヘ
キサエン酸を製造するに際し、コーンスティープリカー
または、コーンスティープリカーおよび酵素消化動物肉
エキス、または酵母エキス、またはスキムミルクを存在
させた培地で培養する海洋性微細藻類の培養方法を提供
する。

【００１０】さらに、前記海洋性微細藻類に属し、か
つ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を有する藻類
が、クリプテコディニウム・コーニー（Crypthecodiniu
m cohnii）ＡＴＣＣ３００２１である上述の海洋性微細
藻類の培養方法を提供する。

【００１１】そして、前記培地中に有機窒素源類として
コーンスティープリカーを濃度が０．１〜１５．０ｇ／
ｌであるのが好ましい。

【００１２】さらにまた、前記培地中に有機窒素源とし
てコーンスティープリカーの濃度が２．０〜８．０ｇ／
ｌ、酵素消化動物肉エキスの濃度が０．１〜１．９ｇ／
ｌの範囲であるのが好ましい。

【００１３】以下、本発明の方法を詳細に説明する。本
発明において利用される微生物は、海洋性微細藻類に属
し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生するものであれば
いずれでもよく、例えばクリプテコディニウム・コーニ
ーなどがある。これらの微生物としてＡＴＣＣ（Americ
an Type Culture Collection）などの各種保存機関から
入手できる公知のものも利用することが可能である。具
体例としては、クリプテコディニウム・コーニーＡＴＣ
Ｃ３００２１、３０５４３、３０５５６、３０５７１、
３０６７２、３０５７５、５００５１、５００５３、５
００５５、５００５６、５００５８、５００６０等が挙
げられる。特に、クリプテコディニウム・コーニーＡＴ
ＣＣ３００２１株が好ましい。このほか上記微生物に例
えば、紫外線照射や各種変異剤による処理等の公知の変
異処理を施した変異下部の使用も本発明に包含されるも
のである。

【００１４】本発明の海洋性微細藻類の培養方法で用い
る培地には、有機窒素源類、炭素源としての糖類、無機
塩類、重金属元素などを含有する。

【００１５】本発明において海洋性微細藻類の培養に用
いる培地中に有機窒素源として、コーンスティープリカ
ー、またはコーンスティープリカーおよび酵素消化動物
肉エキス、または酵母エキス、またはスキムミルクを必
須成分として含有することが肝要である。

【００１６】本発明の培養方法に用いられるコーンステ
ィープリカーは、例えば、トウモロコシの殻粒を、亜硫
酸を含んだ水に浸漬し、４５〜５０℃で４０〜４８時間
浸漬させた浸漬液の濃縮物として得ることができ、ペー
スト状のものであっても、ペースト状のものを噴霧して
得られる粉末であってもよい。具体的には、水分を約５
０％含むサンエイ糖化社製、日本食品化工社製などの商
品として市販されているものを使用することができる。

【００１７】本発明の培養方法に用いられる酵素消化動
物肉エキスは、牛などの獣肉をペプシン、トリプシン、
パパインなどのタンパク質分解酵素を用いて分解したも
ので、例えば、ポリペプトン−Ｐ１（日本製薬製）、チ
オトン（米国ＢＢＬ社製）、プロテオース・ペプトン
（Ｄｉｆｃｏ社製）などの商品として市販されているも
のを使用することができる。

【００１８】本発明の培養方法に用いられる酵母エキス
は、酵母の自己消化抽出液を濃縮したもので、具体的に
は、日本製薬製やＤｉｆｃｏ社の酵母エキスなどの商品
として市販されているものを使用することができる。

【００１９】本発明の培養方法に用いられるスキムミル
クは、牛乳を脱脂し、濃縮したもので、具体的には、Ｄ
ｉｆｃｏ社のスキムミルクなどの商品として市販されて
いるものを使用することができる。

【００２０】これらを添加しないか、またはこれら以外
の有機窒素源類では、藻体の安定した増殖が行われず、
よってドコサヘキサエン酸を得ることが不可能となるこ
とは特願平４−３４４２７９号に示した通りである。

【００２１】さらに、培地中に有機窒素源として、コー
ンスティープリカーのみを含有する場合、コーンスティ
ープリカーの濃度は、０．１〜１５．０ｇ／ｌ、好まし
くは１．０〜８．０ｇ／ｌである。コーンスティープリ
カーの濃度が０．１ｇ／ｌ未満では、高い藻体収率が得
られず、よってドコサヘキサエン酸を得ることが不可能
である。また、１５．０ｇ／ｌを超えると、増殖が遅く
なったり、藻体の産生する脂質量が大きく減少したりし
て、ドコサヘキサエン酸が減少し好ましくない。

【００２２】また、培地中に有機窒素源としてコーンス
ティープリカーおよび酵素消化動物肉エキスを共に含有
されるのも好ましい。培地中に、コーンスティープリカ
ーと酵素消化動物肉エキスを含有させる場合、コーンス
ティープリカーの濃度は、２．０〜８．０ｇ／ｌ、好ま
しくは４．０〜７．０ｇ／ｌで、酵素消化動物肉エキス
は、濃度が０．１〜１．９ｇ／ｌ、好ましくは０．５〜
１．５ｇ／ｌである。それぞれ、コーンスティープリカ
ーの濃度が２．０ｇ／ｌ未満または、酵素消化動物肉エ
キスの濃度が０．１ｇ／ｌ未満では、高い藻体収率が得
られず、よってドコサヘキサエン酸を得ることが困難で
ある。また、コーンスティープリカーが８．０ｇ／ｌを
超えるか、または酵素消化動物肉エキスが１．９ｇ／ｌ
を超えると、増殖が著しく遅くなったり、藻体の産生す
る脂質量が大きく減少したりして、ドコサヘキサエン酸
が減少し好ましくなく、同時に存在させる効果が得られ
ない。

【００２３】培地中に、酵母エキスを含有させる場合、
酵母エキスの濃度は、０．１〜１０．０ｇ／ｌ、好まし
くは０．５〜５．０ｇ／ｌである。０．１ｇ／ｌ未満で
は、高い藻体収率が得られず、したがって、ドコサヘキ
サエン酸を得ることが困難である。また、１０ｇ／ｌ超
では、増殖が著しくおそくなり好ましくない。

【００２４】培地中に、スキムミルクを含有させる場
合、スキムミルクの濃度は、０．１〜１０．０ｇ／ｌ、
好ましくは０．５〜５．０ｇ／ｌである。０．１ｇ／ｌ
未満では、高い藻体収率が得られず、従ってドコサヘキ
サエン酸を得ることが困難である。また、１０．０ｇ／
ｌ超では、増殖が著しくおそくなり好ましくない。

【００２５】本発明において用いられる糖類としては、
例えば、ガラクトース、グルコースなどがあげられ、さ
らにこれらの糖類を組み合わせることも可能である。

【００２６】無機塩類としては、市販の人工海水の濃縮
物を用いることも可能であるが、例えば塩化ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム等を組み合わせて用いることも可
能である。

【００２７】重金属元素を含む成分としては、例えば、
鉄、マンガン、コバルト、亜鉛などの単体、イオン、塩
化物、硫酸塩、硝酸塩など種々の塩が挙げられる。以上
のほか、重金属元素を含む成分の安定化のために例え
ば、ホウ酸やエチレンジアミン四酢酸を用いることも可
能である。

【００２８】培地のｐＨは通常５〜９、好ましくは６〜
８である。このｐＨ安定化のために例えば、トリスヒド
ロキシメチルアミノメタン、モルホリノエタンスルホン
酸などの緩衝剤を用いることも可能である。

【００２９】培養方法としては静置培養法を用いること
も可能であるが、海洋性微細藻類の藻体生産性と脂質中
のドコサヘキサエン酸の含量を考えると、振盪培養法ま
たは深部通気撹拌培養法による培養が好ましい。なお、
振盪培養法および深部通気撹拌培養法については、特願
平０４−０７７１８９号および特願平０４−３４４２７
９号の記載を引用して本発明の範囲とする。

【００３０】培養温度としては、通常１５〜３４℃で藻
体生産を行うことが可能である。培養終了後、培養液か
らの藻体の回収は一般的な方法、例えば、１０℃、８０
００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離法や、濾紙およびガラ
スフィルターによる濾過法等により行うことが可能であ
る。このように回収した藻体をそのまま湿潤藻体として
利用するか、あるいは凍結乾燥法、熱風乾燥法などによ
り乾燥藻体として利用することができる。さらに、これ
らの湿潤藻体または乾燥藻体から、ドコサヘキサエン酸
を高度に含有する粗脂質を抽出することが可能である。

【００３１】上述の培養方法によって得られた海洋性微
細藻類の藻体からドコサヘキサエン酸を高度に含有する
粗脂質の抽出の方法としては、Ｆｏｌｃｈ法やＢｌｉｇ
ｈ−Ｄｙｅｒ法に代表されるクロロホルム／メタノール
系等の有機溶媒による一般的な抽出方法を用いることが
可能である。

【００３２】粗脂質からのドコサヘキサエン酸の精製は
常法に従って行うことが可能である。例えば、粗脂質を
ＮａＯＨなどでケン化した後、そのままか、あるいは酸
またはアルカリ触媒によりアルコールエステルとするこ
とで、カラムクロマトグラフィーまたは分別、蒸留、超
臨界抽出などの方法によって容易に純品として得ること
が可能である。これは藻体中にドコサヘキサエン酸と物
性の非常に似通った高度不飽和脂肪酸が同時に含まれて
いないことによるもので、従来の魚油などからの精製に
比較して非常に簡便で効率良くドコサヘキサエン酸を得
ることが可能である。

【００３３】以上のように本発明によれば、海洋性微細
藻類を培養させる際に、コーンスティープリカー、また
はコーンスティープリカーおよび酵素消化動物肉エキ
ス、または酵母エキス、またはスキムミルクを存在させ
た培地で培養することにより藻体の安定した増殖を示す
ばかりでなく、他の高度不飽和脂肪酸を含まず、ドコサ
ヘキサエン酸の含量を顕著に上昇させたまま、生産性を
向上できる点で特筆すべきである。また、本発明の趣旨
に従い通常行なわれる改変は本発明に含まれる。

【００３４】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説
明するが、これらの実施例が本発明の範囲を限定するも
のでないことは言うまでもない。下記の実施例中、海洋
性微細藻類の藻体生産性は培養後の藻体の乾燥藻体重量
で示し、また、ドコサヘキサエン酸の含有量は乾燥藻体
からクロロホルム／メタノール（２：１）で抽出される
粗脂質を三フッ化ホウ素メタノール錯体で脂肪酸メチル
エステルとし、ヘプタデカン酸を内部標準として産生し
たドコサヘキサエン酸をガスクロマトグラフィーにより
定量することにより測定した。また、実施例および比較
例で使用したコーンスティープリカーは、実施例１で粉
末を使用した以外は、水分含有量５０重量％のものを用
いた。

【００３５】（実施例１〜５）グルコース１０ｇ／ｌ、
酵母エキス２ｇ／ｌを人工海水アクアマリン（八洲薬品
株式会社製、表１）に溶解しｐＨ７．４に調整した培地
（Ｉ）を用い２８℃でクリプテコディニウム・コーニー
ＡＴＣＣ３００２１を予め７日間静置して、培養液を得
た（前培養）。下記２に示す培地（II）、それぞれ１０
０ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコに入れて滅菌をし
た。冷却後、この培地（II）に、前培養で得られた培養
液５ｍｌを接種し、本培養として、２８℃で５日間回転
振盪培養（１８０ｒｐｍ）を行なった。培養藻体から得
た乾燥菌体の重量とドコサヘキサエン酸の含有量を表２
に示す。

【００３６】

【００３７】（比較例１）本培養時に、下記表２に示す
有機窒素源を含まない組成の培地を用いる点以外は実施
例１〜５と同様に培養を行い、表２に示す結果を得た。

【００３８】（比較例２〜５）本培養時に下記表２に示
す組成の培地を用いる点以外は実施例１〜５と同様に培
養を行い、表２に示す結果を得た。

【００３９】

【表１】

【００４０】（実施例６〜９）グルコース１０ｇ／ｌ、
酵母エキス２ｇ／ｌを人工海水アクアマリン（八洲薬品
株式会社製表）に溶解しｐＨ７．４に調整した培地
（Ｉ）を用い２８℃でクリプテコディニウム・コーニー
ＡＴＣＣ３００２１を予め７日間静置培養して、培養液
を得た（前培養）。下記表３に示す培地（ＩＩＩ）、そ
れぞれ１００ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコに入れて
滅菌をした。冷却後、この培地（III ）に、前培養で得
られた培養液５ｍｌを接種し、本培養として、２８℃で
５日間回転振盪培養（１８０ｒｐｍ）を行なった。培養
藻体から得た乾燥藻体の重量と、ドコサヘキサエン酸の
含有量を表３に示す。

【００４１】（比較例６）下記表３に示す有機窒素源と
してコーンスティープリカーを含まない組成の培地を用
いる点以外は実施例６〜９と同様に培養を行い、表３に
示す結果を得た。

【００４２】（比較例７および８）表３に示す組成の培
地を用いる点以外は実施例６〜９と同様に培養を行い、
表３に示す結果を得た。

【００４３】

【表２】

【００４４】（実施例１０〜１３）下記４に示す組成の
培地を用い、７日間本培養を行なった点以外は実施例６
〜９と同様に培養を行い、表４に示す結果を得た。

【００４５】

【表３】

【００４６】（実施例１４〜１６）グルコース１０ｇ／
ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌを人工海水アクアマリン（八洲
薬品株式会社製、表１）に溶解しｐＨ７．４に調整した
培地（Ｉ）を用い２８℃でクリプテコディニウム・コー
ニーＡＴＣＣ３００２１を予め７日間静置培養して、培
養液を得た（前培養）。下記表５に示す培地、それぞれ
１００ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコに入れて滅菌を
した。この培地（IV）に、前培養で得られた培養液５ｍ
ｌを接種し、本培養として、２８℃で５日間回転振盪培
養（１８０ｒｐｍ）を行なった。培養藻体から得た乾燥
藻体の重量とドコサヘキサエン酸の含有量を表５に示
す。

【００４７】（比較例９）下記表５に示す有機窒素源と
してコーンスティープリカーと酵素消化動物肉エキスを
含まない組成の培地を用いる点以外は実施例１４〜１６
と同様に培養を行い、表５に示す結果を得た。

【００４８】（比較例１０〜１２）下記表５に示す組成
の培地を用いる点以外は実施例１４〜１６と同様に培養
を行い、表５に示す結果を得た。

【００４９】

【表４】

【００５０】（実施例１７〜１９）下記表６に示す組成
の培地を用いる点以外は実施例１４〜１６と同様に培地
を行い、表６に示す結果を得た。

【００５１】（比較例１３〜１４）下記表６に示す組成
の培地を用いる点以外は実施例１４〜１６と同様に培養
を行い、表６に示す結果を得た。

【００５２】

【表５】

【００５３】

【発明の効果】本発明の培養方法によれば、藻体の安定
した増殖と、ドコサヘキサエン酸以外の高度不飽和脂肪
酸を含まず、ドコサヘキサエン酸の含量を顕著に上昇さ
せることができる。さらに、従来は原料の供給が不安定
で品質が一定せず、独特の臭気を持つ魚油からの抽出と
高度な分離精製技術により得ていたドコサヘキサエン酸
を高濃度に安定して生産でき、かつ、非常に簡便な分離
精製技術により純度の高いものを供給できる点で工業的
に有効な効果を奏するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する藻類を培養して増殖さ
せた該海洋性微細藻類の藻体からドコサヘキサエン酸を
得るに際し、培地中に有機窒素源類として以下の群から
選ばれる少なくとも１つを存在させることを特徴とする
海洋性微細藻類の培養方法。（１）コーンスティープリカー（２）コーンスティープリカーおよび酵素消化動物肉エ
キス（３）酵母エキス（４）スキムミルク
【請求項２】前記海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサ
ヘキサエン酸を産生する能力を有する藻類が、クリプテ
コディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）Ａ
ＴＣＣ３００２１である請求項１に記載の海洋性微細藻
類の培養方法。
【請求項３】前記培地中に有機窒素源類としてコーンス
ティープリカーの濃度が０．１〜１５．０ｇ／ｌの範囲
で存在する請求項１の海洋性微細藻類の培養方法。
【請求項４】前記培地中に有機窒素源としてコーンステ
ィープリカーの濃度が２．０〜８．０ｇ／ｌ、酵素消化
動物肉エキスの濃度が０．１〜１．９ｇ／ｌの範囲で存
在する請求項１に記載の海洋性微細藻類の培養方法。