JPH06253818A - 海洋性微細藻類の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】純度の高いドコサヘキサエン酸を高濃度で簡便
に得ることのできる微生物の培養方法の提供。 【構成】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエ
ン酸を産生する能力を有する藻類を培養して増殖させた
該藻類の藻体からの抽出によりドコサヘキサエン酸を製
造するに際し、界面活性剤を含有する培地を用いて培養
する海洋性微細藻類の培養方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ドコサヘキサエン酸を
産生する能力のある海洋性微細藻類を良好に増殖させド
コサヘキサエン酸の生産性を高めるための培養方法に関
するものである。ドコサヘキサエン酸は、近年、コレス
テロール低下作用、抗血液凝固作用、学習機能向上作用
など多彩な生理作用が報告されている高度不飽和脂肪酸
である。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生理作用が報告されている高度不
飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸について、魚油以
外に起源を求め、微生物などに選択的に産生させる検討
が行なわれてきた。中でも、海洋性微細藻類に属するク
リプテコディニウム・コーニーを増殖させることにより
ドコサヘキサエン酸を産生させることは従来から検討さ
れてきた。

【０００３】クリプテコディニウム・コーニーなど海洋
性微細藻類の培地は、採取する場所により生理的性質が
異なったり滅菌によって沈澱を形成する海水を基本とし
てこれに欠乏しやすい栄養物質を添加した天然培地より
も、高圧滅菌によっても沈澱を形成せず実験の再現性も
保証される合成培地が好ましい。

【０００４】クリプテコディニウム・コーニーの培養に
ついて合成培地を用いたものを幾つか挙げて示すと、Ｒ
・ジェームス・ヘンダーソンらによるＡＸＭ培地(Phyto
chemistry,27(6),1679-1683(1988) 参照）やＲ・Ｃ・タ
ットュルらによるＭＬＨ培地(Phycologia,14(1),1-8(19
75) 参照）が報告されているがドコサヘキサエン酸の生
産性への効果については触れられていない。

【０００５】また、マーテック社による検討では、ドコ
サヘキサエン酸の収量の増大を目的として天然海水また
は人工海水を基本とし、グルコースと酵母エキスを加え
た培地による培養が報告されている（ＷＯ９１／１１９
１８）が、合成培地の個々の成分の藻体増殖やドコサヘ
キサエン酸蓄積への効果については触れられていない。

【０００６】一方、本発明者らは、特願平０４−３４４
２７９号公報で特定の糖類、有機窒素源類、無機塩類お
よび重金属元素を含有する成分を必須成分とする培地を
用いて、海洋性微細藻類を接種し、藻類の安定した増殖
とドコサヘキサエン酸の高い生産性を示した。

【０００７】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は、海
洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生
する能力を有する藻類を安定に増殖させ、その藻体から
の抽出によるドコサヘキサエン酸を製造するに際し、脂
質中のドコサヘキサエン酸の含量をさらに高めるための
簡便でかつ有効な培地組成を開発することにある。

【０００８】

【問題点を解決するための手段】本発明では、これらの
問題点を解決するために、鋭意検討した結果、ドコサヘ
キサエン酸を産生する能力を有する海洋性微細藻類を、
界面活性剤を存在させた培地で培養することにより、藻
体の安定した増殖と脂質中のドコサヘキサエン酸の含量
が上昇することを見いだし、本発明をなすに至った。

【０００９】すなわち、本発明は、海洋性微細藻類に属
し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を有する
藻類を安定に増殖させ、その藻体からの抽出によるドコ
サヘキサエン酸を製造するに際し、界面活性剤を存在さ
せた培地で培養することを特徴とする海洋性微細藻類の
培養方法を提供するものである。

【００１０】海洋性微細藻類として、クリプテコディニ
ウム・コーニーなどに属する藻類を、ＨＬＢ（Ｈｙｄｒ
ｏｐｈｉｌｉｃ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｌａｎｃ
ｅ、親水性−親油性の均衡）が１６未満の界面活性剤を
濃度が０．０１〜１．０g/Lとなるように存在させた培
地で培養させると、良好な増殖を示すばかりでなく、高
度不飽和脂肪酸として、ドコサヘキサエン酸のみを脂質
中の割合を高度に上昇させたまま、生産性を向上できる
点で特筆すべきである。

【００１１】本発明において利用される微生物は、海洋
性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生す
るものであればいずれでもよく、例えば、クリプテコデ
ィニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ
ｃｏｈｎｉｉ）に属する藻類などがあり、これらはＡ
ＴＣＣ(American Type Culture Collection)などの各種
保存機関から入手できる公知のものも利用することが可
能である。具体的には、 Crypthecodinium cohnii ATCC
30021, 30543, 30556, 30571, 30572, 30775,50051, 5
0053, 50055, 50056, 50058, 50060 等が挙げられる。
このほか該微生物に、例えば、紫外線照射や各種変異剤
による処理等の公知の変異処理を施した変異株の使用も
本発明に包含されるものである。

【００１２】本発明において海洋性微細藻類の液体振盪
培養および液体深部培養による増殖およびドコサヘキサ
エン酸の産生に関しては界面活性剤を単独かまたはいく
つかの界面活性剤を混合することが肝要である。

【００１３】本発明に用いる培地は、界面活性剤、糖
質、有機窒素源、無機塩類、重金属元素を含む成分を含
有する。

【００１４】本発明において用いられる界面活性剤は、
デイビスの式によるＨＬＢ（親水性−親油性の均衡）値
が１６以下、好ましくは０〜１５のもの、さらに好まし
くは３〜５のものを用いる。ＨＬＢ値が１６を越えると
ドコサヘキサエン酸の生産性は界面活性剤が無添加の場
合に近く添加の効果は低い。界面活性剤ではないが負の
ＨＬＢをもつトリグリセライド類も多少の効果は示すが
添加の効果は低い。界面活性剤の具体例としては、上記
範囲のＨＬＢ値をもつノニオン系界面活性剤などが挙げ
られ、たとえば、アトラス社（Ａｔｌａｓ Ｐｏｗｄｅ
ｒ Ｃｏ．）製のツイン８０、ツイン８５、アトラス社
製のスパン８０、スパン８５、オレイルアルコール、オ
レイン酸モノグリセリド、オレイン酸トリグリセリド等
が挙げられる。

【００１５】界面活性剤は濃度が、０．０１〜１．０g/
L 、好ましくは０．０５〜１．０g/L 、となるように存
在させる。これらの濃度が０．０１g/L 未満であると、
界面活性剤の添加の効果は極めて低い。また、濃度が
１．０g/L を超えると、界面活性剤の添加の効果は得ら
れるが、藻体の回収やドコサヘキサエン酸の精製の効率
が落ちるので好ましくない。

【００１６】本発明において用いられる糖質としては、
例えば、グルコース、ガラクトースなどがあげられ、さ
らにこれらを組み合わせることも可能である。

【００１７】有機窒素源としては、例えば、酵母エキ
ス、牛肉エキス、ペプトン、廃糖蜜、コーンスティープ
リカーなどがあげられ、さらにこれらを組み合わせるこ
とも可能である。

【００１８】無機塩類としては、市販の人工海水の濃縮
物を用いることも可能であるが、例えば、塩化ナトリウ
ム、硫酸マグネシウムなどを組み合わせて用いることも
可能である。

【００１９】重金属元素を含む成分としては、例えば、
鉄、マンガン、コバルト、亜鉛などの単体、イオン、塩
化物、硫酸塩、硝酸塩などの種々の塩が挙げられる。以
上のほか、重金属元素を含む成分の安定化のために例え
ば、ホウ酸やエチレンジアミン四酢酸を用いることも可
能である。

【００２０】培地のｐＨは、通常５〜９、好ましくは６
〜８である。このｐＨ安定化のために、例えば、トリス
ヒドロキシメチルアミノメタン、モルホリノエタンスル
ホン酸などの緩衝剤を用いることも可能である。

【００２１】培養方法としては、静置培養法を用いるこ
とも可能であるが、海洋性微細藻類の藻体生産性と脂質
中のドコサヘキサエン酸の含量を考えると、振盪培養法
または深部通気攪拌培養法による培養が好ましい。

【００２２】培養温度としては、通常１５〜３４℃で藻
体生産を行なうことが可能である。培養終了後、培養液
からの藻体の回収は、一般的な方法、例えば、１０℃、
８０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離法や濾紙およびガ
ラスフィルターによる濾過法等により行なうことが可能
である。

【００２３】また、藻体から脂質を抽出し、ドコサヘキ
サエン酸を高度に含有する粗脂質を抽出して使用するこ
ともできる。

【００２４】藻体からドコサヘキサエン酸を高度に含有
する粗脂質の抽出の方法としては、Ｆｏｌｃｈ法やＢｌ
ｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法に代表されるクロロホルム／メタノ
ール系等の有機溶媒による一般的な抽出方法を用いるこ
とが可能である。

【００２５】粗脂質からのドコサヘキサエン酸の精製
は、常法に従って行なうことが可能である。例えば、粗
脂質をＮａＯＨなどでケン化した後、そのままか、ある
いは酸またはアルカリ触媒によりアルコールエステルと
することで、カラムクロマトグラフィーまたは分別、蒸
留、超臨界抽出などの方法によって容易に純品として得
ることが可能である。これは藻体中にドコサヘキサエン
酸と物性の非常に似通った高度不飽和脂肪酸が同時に含
まれていないことによるもので、従来の魚油などからの
精製に比較して非常に簡便で効率良くドコサヘキサエン
酸を得ることが可能である。

【００２６】以上のように本発明の培養方法によれば、
海洋性微細藻類を培養させる際に、界面活性剤を存在さ
せた培地で培養することにより、藻体の安定した増殖
と、他の高度不飽和脂肪酸を含まず、ドコサヘキサエン
酸の含量を上昇させることが可能であるが、本発明の趣
旨に従い通常行なわれる改変は本発明に含まれる。

【００２７】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに詳しく
説明するが、これらの実施例が本発明の範囲を限定する
ものでないことは言うまでもない。

【００２８】下記の実施例中、海洋性微細藻類の藻体生
産性は、培養後の藻体の乾燥藻体重量で示し、また、ド
コサヘキサエン酸の含有量は乾燥藻体からクロロホルム
／メタノール（２：１）で抽出される粗脂質を三フッ化
ホウ素メタノール錯体で脂肪酸メチルエステルとし、ヘ
プタデカン酸を内部標準として産生したドコサヘキサエ
ン酸をガスクロマトグラフィーにより定量することによ
り測定した。

【００２９】（実施例１〜９）表１に示す培地それぞれ
１００ｍｌを、３００ｍｌ容三角フラスコに入れて表２
に示す界面活性剤はそれぞれ０．０５g/L となるように
添加した後、滅菌をした。冷却後、これにグルコース１
０g/L 、酵母エキス２g/L を人工海水アクアマリン（八
洲薬品株式会社製）に溶解しｐＨ７．４に調整した培地
で予め７日間培養したクリプテコディニウム・コーニー
ＡＴＣＣ３００２１の培養液５ｍｌを接種し、２８℃で
５日間回転振盪培養（１８０ｒｐｍ）を行なった。培養
藻体から得た乾燥菌体収量とドコサヘキサエン酸含量
は、表２に示す結果を得た。

【００３０】（比較例１〜２）界面活性剤を添加しない
か、または表２に示す界面活性剤を用いる点以外は、実
施例１〜９と同様に培養を行ない、表２に示す結果を得
た。

【００３１】（実施例１０〜１２）界面活性剤としてス
パン８０を表３に示す濃度で培地へ添加する点以外は、
実施例１〜９と同様に培養を行ない、表３に示す結果を
得た。なお、比較に便利なように、比較例１および実施
例４を同表中にも示した。

【００３２】

【００３３】

【００３４】

【００３５】

【発明の効果】本発明の培養方法によると、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する海洋性微細藻類を培養
する際に界面活性剤を存在させた培地で培養することに
より藻体の安定した増殖と、他の高度不飽和脂肪酸を含
まず、ドコサヘキサエン酸の含量を上昇させることがで
きた。本発明法によれば、従来は原料の供給が不安定で
品質が一定せず、独特の臭気をもつ魚油からの抽出と高
度な分離精製技術により得ていたドコサヘキサエン酸を
高濃度に安定して生産でき、また、非常に簡便な分離精
製技術を用いて純度の高いドコサヘキサエン酸を供給で
きる点で、本発明法は、工業的に有効な効果を奏するも
のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキ
   サエン酸を産生する能力を有する藻類を培養して増殖さ
   せた該藻類の藻体からの抽出によりドコサヘキサエン酸
   を製造するに際し、界面活性剤を含有する培地を用いて
   培養することを特徴とする海洋性微細藻類の培養方法。
2. 【請求項２】前記界面活性剤のＨＬＢが、１６以下であ
   る請求項１に記載の海洋性微細藻類の培養方法。
3. 【請求項３】前記培地中の界面活性剤の濃度が、０．０
   １g/L 以上１g/L 以下である請求項２に記載の海洋性微
   細藻類の培養方法。
4. 【請求項４】前記海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサ
   ヘキサエン酸を産生する藻類が、クリプテコディニウム
   ・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈ
   ｎｉｉ）ＡＴＣＣ３００２１である請求項１に記載の海
   洋性微細藻類の培養方法。