JPH08214867A - 海洋性微細藻類の深部通気攪拌培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】藻体を安定して増殖し、ドコサヘキサエン酸を
高濃度で安定して生産できる深部通気攪拌培養方法の提
供。 【構成】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエ
ン酸を産生する能力を有する藻類を深部通気攪拌培養し
て増殖させるに際し、培地中にグルコースまたはガラク
トースを濃度が７０．０〜１５０．０ｇ／ｌとなるよう
に存在させ、培養液のｐＨ値を特定の範囲に維持する海
洋性微細藻類の深部通気攪拌培養方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ドコサヘキサエン酸を
産生する能力のある渦鞭毛藻類を良好に増殖させるため
の深部通気攪拌培養方法に関するものである。ドコサヘ
キサエン酸は、近年、コレステロール低下作用、抗血液
凝固作用、学習機能向上作用など多彩な生理作用が報告
されている高度不飽和脂肪酸である。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生理作用が報告されている高度不
飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸について、魚油以
外に起源を求めて微生物などに選択的に産生させる検討
が行なわれてきた。中でも海洋性微細藻類に属するクリ
プテコディニウム・コーニーを増殖させることによりド
コサヘキサエン酸を産生させることが検討されている。
クリプテコディニウム・コーニーなど海洋性微細藻類の
培養は、通常静置状態での培養が行なわれてきた。しか
しながら、工業的な規模での培養を目的とした場合、藻
体増殖速度とドコサヘキサエン酸含量を考えると振盪培
養法または深部通気攪拌培養法による培養が好ましい。

【０００３】クリプテコディニウム・コーニーの培養を
扱ったものについて幾つか挙げて示すと、Ｒ・Ｃ・タッ
トュルら（Phycologia, 14(1), 1-8(1975)参照）が培養
時の温度やｐＨ、照射光強度の世代時間への効果を報告
しているが、培養中のｐＨ値の変化と効果については全
く触れられていない。また、マーテック社による検討で
は、ドコサヘキサエン酸の収量の増大を目的として深部
通気攪拌培養方法が試みられている（ＷＯ91/11918）が
培養中のグルコース濃度が高い場合に、ｐＨ値が藻体増
殖やドコサヘキサエン酸蓄積にどのような効果をもたら
すかについては触れられていない。

【０００４】一方、本発明者らは、先に、特開平０５−
２７６９６３号公報で、ドコサヘキサエン酸産生能を有
する海洋性微細藻類の振盪培養方法や深部通気攪拌培養
方法について示し、また、特開平０６−２５３８１７号
である特定の炭素源を特定の濃度で存在させた振盪培養
で、極めて良好な藻体の増殖性とドコサヘキサエン酸の
生産性が得られることを示した。これらの技術は炭素源
が５０ｇ／Ｌ以下の低濃度のものであり、藻体収量が低
いものである。しかしながら、海洋性微細藻類の藻体収
量の向上を目的として、５０ｇ／Ｌを超える比較的高濃
度の炭素源が存在する条件で深部通気攪拌培養を行う
と、培養途中で培養液のｐＨ値が急激に塩基側にシフト
して海洋性微細藻類の増殖が行われない場合がしばしば
観察された。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は海洋性
微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する
能力を有する藻類を、海洋性微細藻類の藻体収量の向上
を目的として、深部通気攪拌培養で増殖させるに際し、
藻体を安定に増殖させるための簡便でかつ有効な深部通
気攪拌培養方法の開発が望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決するために鋭意検討した結果、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する海洋性微細藻類を藻体
収量の向上を目的として、深部通気攪拌培養方法で増殖
させるに際し、５０ｇ／Ｌを超える比較的高濃度の炭素
源が存在させ、培養液のｐＨ値を５．０〜８．０の範囲
となるようにコントロールした条件で深部通気攪拌培養
することにより、藻体の安定した増殖が得られることを
見いだし、本発明をなすに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、海洋性微細藻類に属
し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を有する
藻類を深部通気攪拌培養して増殖させるに際し、培地中
にグルコースおよび／またはガラクトースを濃度が７
０．０〜１５０．０ｇ／Ｌとなるように存在させ、培養
液のｐＨ値を特定の範囲に維持する海洋性微細藻類の深
部通気攪拌培養方法を提供する。そして、培養液のｐＨ
値の範囲が５．０〜８．０であるのが好ましい。

【０００８】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する藻類が、クリプテコデ
ィニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii)ＡＴＣ
Ｃ３００２１であるのが好ましい。

【０００９】以下に、本発明を詳細に説明する。海洋性
微細藻類としてクリプテコディニウム・コーニーなどに
属する藻類を、５０ｇ／Ｌを超える比較的高濃度の炭素
源が存在する条件で深部通気攪拌培養方法で増殖させる
に際し、培養液のｐＨ値が５．０〜８．０の範囲となる
ように厳密にコントロールした条件で培養させると、再
現性のある非常に安定した増殖を示すばかりでなく、高
度不飽和脂肪酸としてドコサヘキサエン酸のみを脂質中
の割合を高度に上昇させたまま、生産性を向上できる点
で特筆すべきである。

【００１０】本発明において利用される微生物は海洋性
微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する
ものであればいずれでもよく、例えばクリプテコディニ
ウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii)などがあ
る。これらの微生物としてＡＴＣＣ（American Type Cu
lture Collection）などの各種保存機関から入手できる
公知のものも利用することが可能である。具体例として
は、クリプテコディニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２
１、３０５４３、３０５５６、３０５７１、３０６７
２、３０７７５、５００５１、５００５３、５００５
５、５００５６、５００５８、５００６０等が挙げられ
るが、特に、クリプテコディニウム・コーニーＡＴＣＣ
３００２１であるのが、ドコサヘキサエン酸の生産性の
点で好ましい。このほか該微生物に例えば、紫外線照射
や各種変異剤による処理等の公知の変異処理を施した変
異株の使用も本発明に包含されるものである。

【００１１】本発明において海洋性微細藻類を深部通気
攪拌培養による増殖に関しては、５０ｇ／Ｌを超える比
較的高濃度の炭素源が存在する培地を用いて、培養液の
ｐＨ値が５．０〜８．０となるように調整することが肝
要である。培養液は、培地に海洋性微細藻類の藻体を接
種したものであって、培養中の液および培養が終了して
得られた液を包含する。

【００１２】本発明に用いる培地には、グルコースまた
はガラクトースあるいはグルコースとガラクトースとの
混合物が、７０．０〜１５０．０ｇ／Ｌ含有されている
のが好ましい。グルコースまたはガラクトースあるいは
その混合物の濃度が、７０．０ｇ／Ｌ未満では、藻体収
率が低く、１５０．０ｇ／Ｌ超では、増殖開始までのタ
イムラグが生じ生育が非常に遅くなる。グルコースまた
はガラクトースあるいはその混合物の濃度が、培養中、
培養液中の濃度が低下してくれば、適宜追加して上述の
範囲内の濃度に調節すればよい。

【００１３】本発明の培養中の培養液のｐＨ値は５．０
〜８．０の範囲に維持するのが好ましい。ｐＨ値が５．
０未満では、藻体増殖の速度が著しく遅くなり非効率的
で好ましくない。また、ｐＨ値が８．０を超えると藻体
が休止状態へ移行し増殖が実質的に行われなくなり好ま
しくない。

【００１４】ｐＨ値を調節する方法は、培養開始の時点
から培養液中のｐＨ値を測定し、ｐＨ値が５．０〜８．
０の範囲を外れたら、下記ｐＨ値を調節する試薬を用い
てｐＨ値を調整する。すなわち、ｐＨ５．０未満になっ
た場合は、下記塩基を適宜添加し、ｐＨ８．０超になっ
た場合は、下記酸を適宜添加することで、ｐＨ値を５．
０〜８．０の範囲に維持する。

【００１５】本発明において用いられる培養液のｐＨ値
を調整する試薬として、酸としては例えば、硫酸、塩
酸、硝酸、りん酸などの鉱酸類、酢酸、乳酸、こはく
酸、くえん酸などの有機酸類などが挙げられ、さらにこ
れらを組み合わせることも可能である。一方、塩基とし
ては例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア水などが挙げら
れ、さらにこれらを組み合わせることも可能である。

【００１６】さらに、培地には、ｐＨ値を安定化するた
めに、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、
モルホリノエタンスルホン酸などの緩衝剤を用いること
も可能である。

【００１７】さらに、本発明に用いる培地には、グルコ
ースまたはガラクトース以外の炭素源を含有していても
よい、そのような例として例えば、魚油、大豆油などの
油脂類、乳酸、酢酸などの有機酸類、エタノールなどの
アルコール類などが挙げられ、さらにこれらを組み合わ
せることも可能である。窒素源としては例えば、酵母エ
キス、牛肉エキス、ペプトン、廃糖蜜、コーンスティー
プリカーなど有機能窒素や、硝酸カリウム、塩化アンモ
ニウムなど無機能窒素があげられ、さらにこれらを組み
合わせることも可能である。

【００１８】無機塩類としては、市販の人工海水の濃縮
物を用いることも可能であるが、例えば、塩化ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどを組み合わ
せて用いることも可能である。重金属元素を含む成分と
しては、例えば、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛などの
単体、イオン、塩化物、硫酸塩、硝酸塩など種々の塩が
挙げられる。以上のほか、重金属元素を含む成分の安定
化のために例えば、ホウ酸やエチレンジアミン四酢酸を
用いることも可能である。

【００１９】本発明に用いる深部通気攪拌培養は、攪拌
速度５０〜４５０ｒｐｍ、通気量０．１〜１．５ｖｖｍ
で行うのが好ましい。そのために、気泡塔型、ドラフト
チューブ付塔型、多段塔型、循環式塔型などの塔型培養
槽、ジャーファーメンター等を培養槽を用いて酸素を供
給しつつ培養液が攪拌される培養槽を用いて培養すれば
よい。培養温度としては、通常１５〜３４℃で藻体生産
を行なうことが可能である。培養時間としては、３〜１
４日間行うことができる。

【００２０】さらに、培養終了後、培養液からの藻体の
回収は一般的な方法、例えば、１０℃、８０００ｒｐ
ｍ、１０分間の遠心分離法や濾紙およびガラスフィルタ
ーによる濾過法等により行なうことが可能である。この
ように回収した藻体をそのままか、あるいは凍結乾燥
法、熱風乾燥法などにより乾燥藻体としたのち、ドコサ
ヘキサエン酸を高度に含有する粗脂質を抽出することが
可能である。藻体からドコサヘキサエン酸を高度に含有
する粗脂質の抽出の方法としては、Ｆｏｌｃｈ法やＢｌ
ｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法に代表されるクロロホルム／メタノ
ール系等の有機溶媒による一般的な抽出方法を用いるこ
とが可能である。

【００２１】粗脂質からのドコサヘキサエン酸の精製
は、常法に従って行なうことが可能である。例えば、粗
脂質をＮａＯＨなどでケン化したのちそのままか、ある
いは酸またはアルカリ触媒によりアルコールエステルと
することで、カラムクロマトグラフィーまたは分別、蒸
留、超臨界抽出などの方法によって容易に純品として得
ることが可能である。これは藻体中にドコサヘキサエン
酸と物性の非常に似通った高度不飽和脂肪酸が同時に含
まれていないことによるもので、従来の魚油などからの
精製に比較して非常に簡便で効率良くドコサヘキサエン
酸を得ることが可能である。

【００２２】以上のように本発明によれば、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する海洋性微細藻類を藻体
収量の向上を目的として、深部通気攪拌培養方法で増殖
させるに際し、５０ｇ／Ｌを超える比較的高濃度の炭素
源が存在し、培養液のｐＨ値が５．０〜８．０の範囲と
なるようにコントロールした条件で深部通気攪拌培養す
ることにより、藻体の安定した増殖が得られることを見
いだしたが、本発明の趣旨に従い通常行なわれる改変は
本発明に含まれる。

【００２３】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説
明するが、これらの実施例が本発明の範囲を限定するも
のでないことは言うまでもない。下記の実施例中、海洋
性微細藻類の藻体生産性は培養後の藻体の乾燥藻体重量
で示し、また、ドコサヘキサエン酸の含有量は乾燥藻体
からクロロホルム／メタノール（２：１）で抽出される
粗脂質を三フッ化ホウ素メタノール錯体で脂肪酸メチル
エステルとし、ヘプタデカン酸を内部標準として産生し
たドコサヘキサエン酸をガスクロマトグラフィーにより
定量することにより測定した。

【００２４】（参考例１〜３）下記表１に示す培地３Ｌ
を５Ｌ容ジャーファーメンターに入れて滅菌をした。冷
却後、これにグルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／
Ｌを人工海水アクアマリン（八洲薬品株式会社製）に溶
解しｐＨ７．４に調整した培地で予め５日間液体振盪培
養したクリプテコディニウム・コーニーＡＴＣＣ３００
２１の培養液３００ｍｌを接種し、本培養として、２８
℃で７日間、攪拌速度２５０ｒｐｍ、通気量０．６７ｖ
ｖｍ、培養中のｐＨ値はコントロールせずに深部通気攪
拌培養を行なった。培養藻体から得た乾燥藻体の収量を
表１に示し、その乾燥藻体の収量の経時変化を図１に示
す。

【００２５】

【００２６】図１に示されるとおり、参考例１〜３のグ
ルコース濃度であれば、ｐＨ値をコントロールしなくて
も、安定した増殖が得られる。

【００２７】（比較例１〜２）下記表２に示す組成の培
地を用いる点以外は、参考例１〜３と同様に深部通気攪
拌培養を行ない、表２に示す結果を得た。さらに、乾燥
藻体の収量およびｐＨ値の経時変化を図２に示す。

【００２８】

【００２９】図２に示されるとおり、比較例１〜２の炭
素源濃度ではｐＨ値のコントロールを行わないと、ｐＨ
値が急激に塩基側へシフトして実質的に増殖が行われな
い。

【００３０】（実施例１〜２）下記表３に示す培地を用
い１Ｎ硫酸、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ値を７．０に
コントロールし、本培養の培養時間を１４日間にする以
外は、参考例１〜３と同様に深部通気攪拌培養を行なっ
た。培養藻体から得た乾燥藻体の収量を表３に示し、そ
の乾燥藻体の収量およびｐＨ値の経時変化を図３に示
す。

【００３１】

【００３２】図３に示されるとおり、実施例１または２
の条件でｐＨをコントロールすることで、比較的高濃度
のグルコースを含有した培地を用いて藻体を培養した場
合に藻体の増殖が得られるようになった。

【００３３】（実施例３〜５）下記表４に示す培地を用
い１Ｎ硫酸、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ値をそれぞれ
５．０、６．０、８．０にコントロールし、本培養の培
養時間を１４日間とする以外は、参考例１〜３と同様に
深部通気攪拌培養を行なった。培養藻体から得た乾燥藻
体の収量は表４に示す結果を得た。

【００３４】

【００３５】

【発明の効果】本発明の培養方法によって、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する海洋性微細藻類を藻体
収量の向上を目的として、深部通気攪拌培養方法で増殖
させるに際し、５０ｇ／Ｌを超える比較的高濃度の炭素
源が存在し、培養液のｐＨ値が５．０〜８．０となるよ
うにコントロールした条件で深部通気攪拌培養すること
により、藻体の安定した増殖が得られることを見いだし
たものであり、藻体の収量を大幅に増加することが可能
となった。したがって、従来は原料の供給が不安定で品
質が一定せず、独特の臭気をもつ魚油からの抽出と高度
な分離精製技術により得ていたドコサヘキサエン酸が、
本発明によって、高収率で安定して生産でき、かつ、非
常に簡便な分離精製技術により純度の高いものを供給で
きる点で工業的に有効な効果を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 参考例１〜３の本培養開始からの培養時間
（日）と乾燥藻体収量との関係を示すグラフである。

【図２】 比較例１および２の本培養開始からの培養時
間（日）と乾燥藻体収量との関係、および本培養開始か
らの培養時間（日）とｐＨ値との関係を示すグラフであ
る。

【図３】 実施例１および２の本培養開始からの培養時
間（日）と乾燥藻体収量との関係、および本培養開始か
らの培養時間（日）とｐＨ値との関係を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキ
   サエン酸を産生する能力を有する藻類を深部通気攪拌培
   養して増殖させるに際し、培地中にグルコースおよび／
   またはガラクトースを濃度が７０．０〜１５０．０ｇ／
   Ｌとなるように存在させ、培養液のｐＨ値を特定の範囲
   に維持することを特徴とする海洋性微細藻類の深部通気
   攪拌培養方法。
2. 【請求項２】前記培養液のｐＨ値の範囲が５．０〜８．
   ０である請求項１に記載の海洋性微細藻類の深部通気攪
   拌培養方法。
3. 【請求項３】前記海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサ
   ヘキサエン酸を産生する能力を有する藻類が、クリプテ
   コディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii)Ａ
   ＴＣＣ３００２１である請求項１または２に記載の海洋
   性微細藻類の深部通気攪拌培養方法。