KR20170032577A - Dha를 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 스키조키트리움 속 sh103 균주 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 고농도로 포함한 바이오오일을 생산하고, 고수율의 바이오오일 생산성을 가지는 미세조류인 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH103 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 고품질의 바이오오일의 생산을 가능케하고, 현재까지 보고된 결과들과 비교해 사용된 포도당 영양원 대비 가장 높은 DHA 오일의 생산수율을 보이는 것으로 나타나 생산 비용 절감 효과를 제공할 수 있어 DHA를 활용한 고부가가치 산업과 바이오오일 산업의 시장 경쟁력을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

DHA를 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 스키조키트리움 속 SH103 균주 및 이의 용도{Microalgae Schizochytrium sp. SH103 strain producing bio-oil containing high concentration of DHA and uses thereof}
본 발명은 DHA를 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 스키조키트리움 속 SH103 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 고농도로 포함한 바이오오일을 생산하고, 고수율의 바이오오일 생산성을 가지는 미세조류인 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH103 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 DHA 제조용 미생물 제제, 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 DHA를 분리하는 것을 특징으로 하는 DHA의 제조 방법, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 DHA 및 팔미트산 고함유 바이오오일 제조용 미생물 제제, 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조 방법 및 상기 균주를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법 및 글리세롤의 제조 방법에 관한 것이다.
해양 생태 먹이사슬의 최하위 계급을 차지하는 유기종속영양 미세조류인 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 DHA(docosahexaenoic acid)를 비롯한 다양한 다중불포화지방산(polyunsaturated fatty acid)을 고농도로 함유하는 트리아실글리세롤(Triacylglycerol)의 공급원으로 중요한 역할을 수행한다. 특히 다중불포화지방산 DHA는 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동신경능력 개발에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 치매 환자 뇌에서는 그 양이 현저하게 줄어드는 것으로 보고되었으며, 노안의 황반 변성 억제 등 다양한 항노화 기능들이 새롭게 밝혀지고 있다. 사람을 비롯한 대부분의 고등 동물은 정상적인 생체기능에 필요한 다중불포화지방산을 자체적으로 원활하게 합성하지 못하기 때문에 다중불포화지방산을 필수 영양소로 반드시 섭취하여야 하며, 세계보건기구는 하루 1g 이상의 DHA 함유 다중불포화지방산을 꾸준히 섭취할 것을 권장하고 있다.
전통적으로 DHA 다중불포화지방산의 공급원은 참치, 연어와 같은 해양 생태환경의 상위를 차지하는 심해성 어류들이다. 하지만, 해양환경의 오염이 심해지면서 심해성 어류의 체내에 수은을 비롯한 중금속, 환경호르몬, 방사성물질 등 오염물질의 축적으로 인해 심해어류 섭취에 대한 위험이 커지고 있다. 따라서 DHA 다중불포화지방산 오일을 안전하고, 안정적으로 공급할 수 있는 새로운 수단으로 트라우스토키트리드 미세조류가 주목을 받고 있다. 고기능 DHA 다중불포화지방산의 높은 함량뿐만 아니라 높은 지질 함량으로 인해 바이오디젤 생산을 위한 바이오오일의 공급원으로도 고유지성 트라우스토키트리드 미세조류는 산업적으로 중요한 가치를 지닌다.
DHA와 같은 고기능 다중불포화지방산의 함량이 높은 특성과 함께 트라우스토키트리드 미세조류의 오일은 유기용매의 사용 없이도 균체로부터 손쉽게 추출이 가능하다. 트라우스토키트리드 미세조류로부터 DHA 오일을 간단하게 추출할 수 있는 특징은 생산 비용을 절감하는 효과를 제공하는데, 이러한 장점은 트라우스토키트리드 미세조류의 세포벽 구조와 관계가 있는 것으로 보인다 (Darley et al. Arch Microbiol 1973, 90, 89-106). 반대로 오일 추출에 유리한 세포벽 구조는 트라우스토키트리드 미세조류의 배양 공정에서는 약점으로 작용할 수 있다. 트라우스토키트리드 미세조류의 배양을 통해 DHA 오일을 고농도로 생산하기 위해서는 일반적으로 유가식 공정이 개발되었는데, 배양 시간이 길어지면 균체가 쉽게 파괴되어 배지 중으로 유출된 DHA 오일이 변성되는 문제점이 발생할 수 있다. 이에 트라우스토키트리드 미세조류의 배양 과정 중에 배양기 내의 전단응력(shearing force)을 낮추기 위한 안정제를 첨가하거나(대한민국 등록특허 제1187813호), 전단응력에 대한 저항성이 증진된 변이 균주가 개발되기도 하였다(대한민국 등록특허 제1328090호). 트라우스토키트리드 미세조류 균체의 파쇄에 따른 오일의 산화적 변성을 최소화하기 위해서는 단시간 동안의 배양을 통해 DHA 오일을 생산하는 방법이 효과적이다. 하지만 트라우스토키트리드 미세조류의 단시간 배양을 통해 높은 오일 생산량과 DHA 농도를 동시에 얻는 것은 용이하지 않은데, 이는 트라우스토키트리드 미세조류의 균체 증식과 오일 생산에 적합한 배양 조건에서는 다중불포화지방산인 DHA의 합성이 원활하게 이루어지지 않기 때문이다.
한편, 한국등록특허 제1185596호에서는 'DHA 생산성을 향상시킨 스키조키트리움 속 JBF-06 균주와 이를 이용한 DHA 생산방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, 'DHA를 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 스키조키트리움 속 SH103 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 트라우스토키트리드 미세조류의 단시간 배양을 통해 바이오오일과 DHA의 함량 모두를 고농도로 생산함으로써 균체의 파쇄를 억제하여 고품질의 DHA 오일 생산에 적합한 균주를 개발하고자 하였다. 그 결과, 단시간 배양으로도 높은 오일 생산성을 보이면서 동시에 DHA 함량이 우수한 새로운 트라우스토키트리드 미세조류를 분리하였다. 새롭게 분리한 트라우스토키트리드 미세조류는 현재까지 보고된 결과들과 비교해 사용된 포도당 영양원 대비 가장 높은 DHA 오일의 생산수율을 보이는 것으로 나타나 생산 비용 절감 효과를 제공할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 고농도로 포함한 바이오오일을 생산하고, 고수율의 바이오오일 생산성을 가지는 미세조류인 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH103 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6) 제조용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 분리하는 것을 특징으로 하는 DHA의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6) 및 팔미트산 고함유 바이오오일 제조용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
상기 균주를 배양하는 단계;
상기 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 단계; 및
상기 분리된 바이오오일을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
상기 균주를 배양하는 단계;
상기 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 단계; 및
상기 분리된 바이오오일을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 글리세롤의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 DHA를 고농도로 포함한 바이오오일 고생산 미세조류인 스키조키트리움 속 SH103 균주는 단시간(36시간) 배양을 통해 높은 오일 생산성을 보이면서 동시에 DHA 함량이 우수하며, 사용된 포도당 영양원 대비 높은 생산수율을 보이는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 균주는 고품질의 바이오오일의 생산을 가능케하고, 현재까지 보고된 결과들과 비교해 사용된 포도당 영양원 대비 가장 높은 DHA 오일의 생산수율을 보이는 것으로 나타나 생산 비용 절감 효과를 제공할 수 있어 DHA를 활용한 고부가가치 산업과 바이오오일 산업의 시장 경쟁력을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 신규 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH103 균주의 광학 현미경(A) 및 전자현미경(B) 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 신규 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH103 균주의 분류학적 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 5ℓ 배양기를 이용한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH103 균주의 회분식 배양 결과를 나타낸 것이다. x축은 시간을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 고농도로 포함한 바이오오일을 생산하고, 고수율의 바이오오일 생산성을 가지는 미세조류인 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH103 균주를 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 SH103 균주는 제주도 남쪽 해역의 해수로부터 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 미세조류의 전형적인 특징인 유주자(zoospore) 낭을 형성하는 콜로니를 분리한 후, 가장 우수한 증식을 보이는 균주들의 배양액 시료 중에서 건조균체량, 오일 생산량, 포도당 대비 생산수율이 가장 우수한 균주를 분리하였다. 상기 분리한 균주의 분자생물학적 동정을 위해 18S rRNA 유전자 서열 상동성을 분석한 결과 스키조키트리움 속 균주로 동정되었고, 이를 스키조키트리움 속 SH103으로 명명하였다. 본 발명에서 분리한 상기 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH103 균주를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2015년 6월 25일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC12861BP).
본 발명의 일 구현 예에 따른 스키조키트리움 속 SH103 균주는 DHA 함량이 균주 건중량당 40~45%이고, 바이오오일 생산 수율은 0.3~0.4g/g 글루코스이고, 바이오오일 생산성은 10~20 g/ℓ·일일 수 있고, 바람직하게는 DHA 함량이 균주 건조중량당 42%이고, 바이오오일 생산 수율은 0.35g/g 글루코스이고, 바이오오일 생산성은 15.4 g/ℓ·일일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6) 제조용 미생물 제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH103 균주를 유효성분으로 포함할 수 있으며, DHA의 생산에 효과적으로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 분리하는 것을 특징으로 하는 DHA의 제조 방법을 제공한다.
상기 균주는 다양한 배양 온도에서 바이오오일을 고농도로 축적할 수 있으며, 상기 배양 온도는 바람직하게는 25 내지 35℃일 수 있다. 균주 배양액으로부터 DHA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6) 및 팔미트산 고함유 바이오오일 제조용 미생물 제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH103 균주를 유효성분으로 포함할 수 있으며, DHA 및 팔미트산의 생산에 효과적으로 이용될 수 있다. 상기 DHA는 탄소수가 22이며 이중결합수가 6인 지방산(22:6 지방산)이며, 팔미트산은 탄소수가 16이며 이중결합수가 0인 지방산(16:0 지방산)이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 DHA 및 팔미트산 고함유 바이오오일 제조용 미생물 제제에서, 상기 바이오오일은 바이오오일 총 중량 기준으로 DHA 35~45% 및 팔미트산 45~55%를 함유하는 것일 수 있고, 바람직하게는 바이오오일 총 중량 기준으로 DHA 38~40% 및 팔미트산 48~50%를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조 방법을 제공한다. 상기 균주는 다양한 배양 온도에서 바이오오일을 고농도로 축적할 수 있으며, 상기 배양 온도는 바람직하게는 25 내지 35℃일 수 있다. 균주 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 바이오오일의 제조 방법에서, 상기 균주는 단기간 배양을 통해 높은 오일 생산성을 보이면서 동시에 DHA 함량이 우수하며, 사용된 포도당 영양원 대비 높은 생산수율을 보이는 것으로, 바람직하게는 30~48시간 동안 배양하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 35~40시간 동안 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은
상기 균주를 배양하는 단계;
상기 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 단계; 및
상기 분리된 바이오오일을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 균주 배양 배지는 당업계에서 일반적으로 통용되는 배지를 이용할 수 있다. 상기 지방산 에스테르는 바람직하게는, 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 바이오디젤은 바이오매스에 포함된 지방산의 트랜스에스테르화 과정에 의해 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르 형태로 생산될 수 있으며, 상기 트랜스에스테르화 과정의 부산물로 글리세롤이 생성될 수 있다.
상기 트랜스에스테르화 과정은 바이오매스에 포함된 지방의 크고 가지를 낸 분자 구조를 정규 디젤 엔진이 요구하는 작고 직선 사슬의 분자로 변형시키는 방법을 말한다. 상기 트랜스에스테르화 과정의 유화제로서 Triton X-100 또는 Tween 60 등을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 유화제는 바이오오일의 계면 안정을 도모하고 잘 혼합되도록 하여 반응 수율을 높여서 바이오디젤의 회수 비용을 절약할 수 있게 한다. 또한, 상기 트랜스에스테르화 과정의 반응 촉매제로서 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 바이오디젤은 바이오연료로서 하기의 장점을 가질 수 있다; (1) 바이오연료는 일반적인 바이오매스 자원으로부터 손쉽게 얻을 수 있다. (2) 바이오연료는 연소에 있어서 이산화탄소의 순환을 나타낸다. (3) 바이오연료는 환경 친화적인 잠재력을 갖는다. (4) 바이오연료를 사용함으로써 환경, 경제 및 소비자에게 많은 이익을 준다. (5) 바이오연료는 자연계에서 미생물에 의해 무해한 물질로 분해될 수 있고, 지속가능성에 기여한다.
또한, 본 발명은
상기 균주를 배양하는 단계;
상기 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 단계; 및
상기 분리된 바이오오일을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 글리세롤의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 균주의 배양 배지 및 바이오오일 분리 방법은 전술한 바와 같다.
상기 글리세롤은 윤활제, 연고나 좌약과 같은 약품의 제조, 관장제, 식품이나 화장품의 건조방지제 또는 정미제, 부동액, 냉각제, 도료, 안료, 인쇄 잉크, 투명비누의 제조, 실험실의 분석 시약, 용제, 셀로판, 접착제, 알키드 수지 또는 다이나마이트 등의 제조에 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명에서 바이오오일과 지질은 같은 의미로 혼용하여 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 신규 스키조키트리움 속( Schizochytrium sp .) SH103 균주의 분리
제주도 남쪽 해역의 해수 시료를 50 ml 팔콘 튜브(falcon tube)를 이용하여 채취하고, 생리식염수 10 ml을 가하여 현탁한 후 적당히 희석하여 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 미세조류 분리용 B1 배지(1 g/L 효모 추출물, 1 g/L 펩톤, 10 g/L 아가를 300 mg/L 페니실린 G와 500 mg/L 스트렙토마이신 설페이트를 첨가한 천연해수 1 L에 녹임)에 도말하였다. 28℃에서 200 rpm으로 2-4일간 배양하여 얻어진 콜로니들을 B1 배지에 재접종하여 순수분리한 후 현미경으로 관찰하고 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 미세조류의 전형적인 특징인 유주자(zoospore) 낭을 형성하는 콜로니를 분리하였다.
분리한 콜로니들을 50 mL 기본배지(탄소원 포도당 60 g/L, 질소원 효모 추출물 10 g/L, 인공해수염 5 g/L, KH2PO4 9g/L)(250-mL 플라스크)를 이용하여 28℃에서 120 rpm으로 2일간 배양한 후, 균체를 회수하여 동결건조기에서 12시간 동안 건조하였다. 원심분리법으로 회수한 균체를 PBS 버퍼(phosphate buffered saline, pH 7.2)로 3회 세척한 후 동결건조기에서 12시간 건조하여 건조 균체 중량을 측정하였다.
DHA 함유 오일함량은 수정된 Bligh-Dyer법에 의하여 분석되었다. 건조 균체량 125 mg에 클로로포름 6.25 mL, 메탄올 12.5 mL, 50 mM K2HPO4 버퍼(pH 7.4) 5 mL을 가하여 28℃에서 200 rpm으로 1시간 동안 반응한 후 클로로포름 6.25 mL, K2HPO4 버퍼 6.25 mL을 첨가하여 30회 정도 섞어준 후 30분 동안 방치하여 수층과 오일이 함유된 유기용매층으로 분리되도록 하였다. 미리 무게를 측정해둔 알루미늄 접시로 클로로포름 층을 조심스럽게 옮긴 후 90℃에서 30분 동안 건조한 후 오일의 무게를 측정하였다. 전체 오일 함량은 아래와 같이 산출하였다.
총 오일함량 (%, 오일 g /건조균체량 100 g) = (WL - WD) x VC x 100/VP x WS
WL: 알루미늄 접시의 무게
WD: 알루미늄 접시 + 지질의 무게
VC: 클로로포름의 총 부피
VP: 알루미늄 접시에 옮긴 클로로포름의 부피
WS: 사용한 균체의 무게 (건조중량)
한편, 오일 중에 함유된 DHA의 함량은 기체 크로마토그래피법으로 측정하였다. 적당량의 건조된 균체를 5% 메탄올-황산 용액 6 mL에 현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응하여 지방산 에스테르를 생성한 다음 헥산 0.2 mL로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하였다.
그 결과, 배양 2일째에 가장 우수한 증식을 보이는 균주의 배양액 시료를 분석한 결과, 건조균체량 23.28 g/L이었으며, 이때 오일 생산량은 건조중량의 63.57%인 14.8 g/L인 것으로 나타났다. 오일의 지방산 조성은 표 1에 나타낸 바와 같다.
신규 분리 트라우스토키트리드 미세조류 유지의 지방산 조성
Fatty acids Content (%)
14:0 4.86
15:0 0.42
16:0 49.02
20:4 (ω6) 0.39
20:5 (ω3) 0.26
22:5 (ω6) 1.98
22:6 (ω3) 39.14
22:5 (ω3) 0.38
분리한 콜로니의 분자생물학적 동정을 위하여 18S rRNA 유전자 서열을 분석하였다. 하나의 콜로니로부터 전형적인 페놀-클로로포름법으로 염색체 DNA를 분리한 후, 이로부터 트라우스토키트리드 미세조류 18S rRNA 유전자 증폭용 프라이머 5'-ATGAACATCAAAAA-3'(P1, 서열번호 2)와 5'-ATGAACATCAAAAA-3'(P2, 서열번호 3) 을 이용하여 PCR법으로 18S rRNA 유전자 DNA를 증폭하였다. PCR 증폭은 EF Taq polymerase(Takara)(2.5 U), 폴리머라제 버퍼, dNTP 혼합물(각 1 mM), 각 프라이머(100 pmol) 1㎕, 주형 DNA 500ng을 함유하는 PCR 반응용액(50㎕)을 준비한 후, 유전자 증폭기(Takara, Japan)로 96℃ 30초, 43℃ 1분, 72℃ 3분 조건으로 30회간 수행하였다. PCR 반응액을 1% 아가로즈겔에서 전기영동하여 예상되는 크기의 DNA 단편이 증폭된 것을 확인하고, pGEM-TEasy 벡터(Promega, USA)를 이용하여 대장균 DH5α으로 형질도입하였다. 형질 전환된 재조합 대장균들로부터 플라스미드 DNA를 추출(Qiagen, USA)하고, 제한효소 EcoRI을 처리하여 원하는 크기의 DNA 단편이 클로닝된 것을 확인하였으며, 염기서열을 결정하였다(서열번호 1). 염기서열 상동성 분석을 실시한 결과를 토대로 신규 분리한 미세조류를 스키조키트리움 속 SH103으로 명명하고(도 2), 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호 KCTC12861BP).
실시예 2.　발효조를 이용한 신규 분리 미세조류의 배양을 통한 DHA 함유 오일의 생산
5ℓ 배양기를 이용한 스키조키트리움 속 SH103 균주의 배양을 수행하였다. 상기의 기본 배지에서 전배양한 균체를 3ℓ의 동일배지 (5ℓ jar fermentor)로 이식하여 28℃에서 2vvm의 조건으로 회분식 발효를 수행하면서 12시간 간격으로 균체를 회수하여 균체 성장과 오일 및 DHA 함량을 조사하였다. 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 배양 36시간째에 첨가한 포도당을 완전히 소모하였으며, 표 2에 나타낸 바와 같이 오일 생산량과 생산성은 각각 23.1 g/L, 15.4 g/L·day이었다. 사용된 포도당 영양원 대비 오일의 생산수율은 0.35g/g 글루코스 이었으며, DHA의 함량은 42.1%인 것으로 확인되었다(표 2). 문헌상으로 보고된 다른 스키조키트리움 속 미세조류의 결과들과 비교해 볼 때, 분리 균주는 우수한 오일 생산성과 생산수율 및 DHA 함량을 보이는 것으로 나타났다(참고문헌 : Schizochytrium sp. SR21(Rosa et al., 2010 Bioresour Technol. Apr;101(7):2367-74), Schizochytrium sp. CC44(대한민국 등록특허 제1328090호), Schizochytrium sp. G13/2S(Chi et al., 2009 Appl Microbiol Biotechnol. Jan;81(6):1141-8), Schizochytrium sp. HX-308(Qu et al., 2013 Bioprocess Biosyst Eng. Dec;36(12):1905-12)). 스키조키트리움 속 SR21 균주에 비해 오일의 생산량은 오일 생산성, 생산수율, DHA 함량이 높았으며, 스키조키트리움 속 CC44 균주에 비해 오일 생산량과 DHA 함량은 다소 낮지만 오일의 생산성과 생산수율은 월등히 높은 것으로 나타났다.
발효기를 이용한 스키조키트리움 속 미세조류의 배양을 통한 오일 생산성(lipid productivity), 생산수율(lipid yield) 및 DHA 함량(DHA content) 비교
Lipid productivity (g/L-day) Lipid yield (g/g glucose) DHA content (%)
Schizochytrium sp. SH103 15.4 0.35 42.1
Schizochytrium sp. SR21 11.8 0.30 31.4
Schizochytrium sp. CC44 3.6 0.19 51.0
Schizochytrium sp. G13/2S 7.8 0.11 38.1
Schizochytrium sp. HX-308 3.4 0.18 39.8
한국생명공학연구원 KCTC12861BP 20150625
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Microalgae Schizochytrium sp. SH103 strain producing bio-oil containing high concentration of DHA and uses thereof <130> PN15183 <160> 3 <170> KoPatentIn <210> 1 <211> 1884 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Schizochytrium sp. <400> 1 cagctccggc cgccatggcg gccgcgggaa ttcgatttac ctggttgatc ctgccagtag 60 tcatatgctc gtctcaaaga ttaagccatg catgtgtaag tataagcgat tgtactgtga 120 gactgcgaac ggctcattat atcagtaata atttcttcgg tagtttcttt tatatggata 180 cctgcagtaa ttctggaaat aatacatgct gtaagagccc tgtatggggc tgcacttatt 240 agattgatgc cgattttatt ggtgaatcat gataattgag cagattgact gttttggtcg 300 atgaatcgtt tgagttcctg ccccatcagt tgtcgacggt agtgtattgg actacggtga 360 ctataacggg tgacggagag ttagggctcg actccggaga gggagcctga gagacggcta 420 ccatatccaa ggatagcagc aggcgcgtaa attacccact gtggactcca cgaggtagtg 480 acgagaaata tcgatgcgaa gcgtgtatgc gttttgctat cggaatgaga gcaatgtaaa 540 accctcatcg aggatcaact ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc 600 tccagaagca tatgctaaag ttgttgcagt taaaaagctc gtagttgaat ttctggcatg 660 ggcgaccggt gctttccctg aatggggatt gattgtctgt gttgccttgg ccatctttct 720 catgctgtta ttggtatgag atctttcact gtaatcaaag cagagtgttc caagcaggtc 780 gtatgaccgg tatgtttatt atgggatgat aagataggac ttgggtgcta ttttgttggt 840 ttgcacgcct gagtaatggt tgtttggatt catttttgga cagaggcaga actcgggtga 900 atcttattgt ttagaggaag gtgaagtcgt aacaagcctt ccgtaggtga acctgcggaa 960 ggaatcacta gtgaattcgc ggccgcctgc aggtcgacca tatgggagag ctcccaccgc 1020 gtgagcagaa taggaacagt tgggggtatt cgtatttagg agctagaggt gaaattcttg 1080 gatttccgaa agacgaacta gagcgaaggc atttaccaag catgttttca ttaatcaaga 1140 acgaaagtct ggggatcgaa gatgattaga taccatcgta gtctagaccg taaacgatgc 1200 cgacttgcga ttgttgggtg ctttattaat gggcctcagc agcagcacat gagaaatcaa 1260 agtctttggg ttccgggggg agtatggtcg caaggctgaa acttaaagga attgacggaa 1320 gggcaccacc aggagtggag cctgcggctt aatttgactc aacacgggaa aacttaccag 1380 gtccagacat aggtaggatt gacagattga gagctctttc atgattctat gggtggtggt 1440 gcatggccgt tcttagttgg tggagtgatt tgtctggtta attccgttaa cgaacgagac 1500 ctcggcctac taaatagtgc gtggtatggc aacatagtac gtttttaact tcttagaggg 1560 acatgtccgg tttacgggca ggaagttcga ggcaataaca ggtctgtgat gcccttagat 1620 gttctgggcc gcacgcgcgc tacactgatg ggttcatcgg gttttaattc tgtttttatg 1680 gaattgagtg cttggtcgga aggcctggct aatccttgga acgctcatcg tgctggggct 1740 agatttttgc aattattaat ctccaacgag gaattcctag taaacgcaag tcatcagctt 1800 gcattgaata cgtccctgcc ctttgtacac accgcccgtc gcacctaccg attgaacggt 1860 ccgatgaaac catgggatgt ttct 1884 <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atgaacatca aaaa 14 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgaacatca aaaa 14

Claims (12)

  1. DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 고농도로 포함한 바이오오일을 생산하며, 기탁번호가 KCTC12861BP로 기탁된 미세조류인 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) SH103 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 상기 바이오오일을 높은 생산성과 생산 수율로 축적하는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 DHA 함량이 균주 건중량 당 40~45%인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제2항에 있어서, 상기 균주의 바이오오일 생산성은 10~20 g/ℓ·일이고, 바이오오일 생산 수율은 0.3~0.4g/g 글루코스인 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6) 제조용 미생물 제제.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)를 분리하는 것을 특징으로 하는 DHA의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6) 및 팔미트산 고함유 바이오오일 제조용 미생물 제제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 바이오오일은 지방산 총 중량 기준으로 DHA 35~45% 및 팔미트산 45~55%를 함유하는 것을 특징으로 하는 바이오오일 제조용 미생물 제제.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 균주는 30~48시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계;
    상기 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 바이오오일을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계;
    상기 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 바이오오일을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 글리세롤의 제조 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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FR3001736B1 (fr) * 2013-02-06 2016-03-04 Roquette Freres Biomasse de la microalgue schizochytrium mangrovei et son procede de preparation

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022124590A1 (ko) * 2020-12-07 2022-06-16 씨제이제일제당(주) 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 다중불포화지방산 생산방법
WO2023080399A1 (ko) * 2021-11-08 2023-05-11 씨제이제일제당 (주) 세포 내 오일 추출이 용이한 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법
WO2023080400A1 (ko) * 2021-11-08 2023-05-11 씨제이제일제당 (주) 세포 내 오일 함유량이 높은 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법

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