JPWO2008149542A1

JPWO2008149542A1 - 微生物発酵によるｄｈａ含有リン脂質の製造方法

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Publication number: JPWO2008149542A1
Application number: JP2009517720A
Authority: JP
Inventors: 英登志奥山; 善丈折笠; 孝伸西田
Original assignee: ROM CO., LTD.; Hokkaido University NUC
Current assignee: ROM CO., LTD.; Hokkaido University NUC
Priority date: 2007-06-04
Filing date: 2008-06-03
Publication date: 2010-08-19
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Abstract

微生物を用いた、ω３系不飽和脂肪酸特にＤＨＡを構成脂質とするＤＨＡリン脂質をより簡便に製造する方法を提供する。本発明は、炭素源を含む培地でω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を増殖させる工程、及び増殖させた前記微生物を、炭素源を含まない培地でさらに培養する工程を含む、ω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質の製造方法。本発明の方法によれば、ω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を用いて、ω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とする高付加価値のリン脂質を大量に生産することができる。

Description

本発明は、高付加価値を有するリン脂質を製造する方法に関する。より詳細には、本発明は、ω３系不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を用いた、ω３系不飽和脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を構成脂質とするリン脂質の製造方法に関する。

ω３系不飽和脂肪酸、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、血中脂質低下作用、脳視覚機能の改善などの生理効果を示すことから、機能性脂質と言われている。いずれもヒトに不可欠の栄養分であるが、食品からの摂取が不足しがちであるために、必要摂取量を補うためのＥＰＡやＤＨＡを含む健康食品素材あるいはサプリメントが広く市販されている。また、ＥＰＡについては、高純度のＥＰＡエチルエステルが脂質低下剤などの医薬としても利用されている。さらに、ＥＰＡとＤＨＡを成分とする健康食品が厚生労働省により特定健康用食品として２００４年に認可されて以来、ＥＰＡやＤＨＡを初めとするω３系不飽和脂肪酸の利用と市場は、より一層拡大するものと予想されている。

一方、脂肪酸そのものではなく、脂肪酸を構成脂質とするリン脂質についても、種々の有用な生理活性を有することが数多く報告されている。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の脳機能改善効果（非特許文献１）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）の動脈硬化症や神経機能障害の改善効果が、それぞれ報告されている。さらに最近は、健康補助食品への利用を目的として、ＰＳやＰＣにとどまらず、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリン脂質全般が注目を集めている。

この様な背景の下、ω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質、例えばＤＨＡを構成脂質とするＰＣやＰＥ（それぞれをＤＨＡ−ＰＣ、ＤＨＡ−ＰＥといい、以下、ＤＨＡを構成脂質とするリン脂質全体をＤＨＡリン脂質という）の抗腫瘍性や抗酸化性などの生理機能が、培養細胞を使った系にとどまらず、動物生体を使った系でも明らかになってきている。

例えば、Ｋａｆｒａｗｙら（非特許文献２）によれば、ＤＨＡ−ＰＣ、特にＰＣ１分子中に２分子のＤＨＡをもつもの（ＤＨＡ／ＤＨＡ−ＰＣ）が癌化した動物細胞（マウス白血病細胞）に選択的毒性を示すことを報告している。したがって、ω３系不飽和脂肪酸、特にＤＨＡを構成脂質とするリン脂質に対する需要は今後さらに高まっていくと期待される。

ω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質の代表的な例であるＤＨＡリン脂質の主な供給源は、イカ（特にムラサキイカの皮）や魚油、あるいはこれらの魚油の給餌により得られる鶏卵（特許文献１）などである。ムラサキイカは、リン脂質を多く含む上、そのリン脂質の５０％を占めるホスファチジルコリン（ＰＣ）の構成脂質の５０％がＤＨＡであり、脂質中のＤＨＡリン脂質の含有比率は高いという特徴を有している。

しかし、ＤＨＡリン脂質の工業的な生産を考えた場合、ムラサキイカや魚油等の海産物をＤＨＡリン脂質の供給源とすることは、漁獲高に依存した供給量の不安定性、季節や気候の変化を原因とする品質の不均一性、海洋汚染を原因とする安全性などの他に、魚油独自の臭気（いわゆる魚臭さ）による最終製品の品質や価値の低下、各種の構造類似の長鎖高度不飽和脂肪酸が魚油中に含まれることによる高い精製コスト等の多くの問題を抱えることになる。また鶏卵は、卵黄脂質の３０％がリン脂質であり、リン脂質の含有比率は高いが、総脂質量は低く、また卵黄のエタノール抽出物中のＤＨＡ含量は１２％程度に過ぎない。

上記の魚油や鶏卵の利用とは異なるω３系不飽和脂肪酸の供給源としては、ω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物、特にＤＨＡ生産能を有する微生物が知られている。微生物を用いたＤＨＡの製造方法は、アメリカ合衆国等では実用化されており、ＤＨＡ含有脂質の原料や、高ＤＨＡ含有飼料等が製品化されている。具体的には、例えば、トラウストキトリウム属、シゾキトリウム属の生育技術（特許文献２）、トロウストチトリアレ類から抽出されるω３系不飽和脂肪酸の利用技術（特許文献３）等が挙げられる。

日本国内においても、ラビリンチュラ類をＤＨＡの供給源として用いる技術は種々開発されている。具体的には、例えば、ラビリンチュラ属の微生物であるＳ３−２株を利用する技術（特許文献４〜特許文献６）、シゾキトリウム属の微生物であるＳＲ２１株およびその利用技術（特許文献７〜特許文献９）等が挙げられる。

しかし、上記の微生物を用いた方法で製造されるＤＨＡは、いずれもリン脂質の構成脂質ではなく、単なる脂肪（トリグリセリド）の構成脂質としてのＤＨＡであり、ＤＨＡリン脂質を構成するものではない。

本発明者らは、非光合成性の単細胞微生物であるラビリンチュラ類に属する新規微生物１２Ｂ株を単離し、これがＤＨＡリン脂質を製造することを見いだし、特許出願を行った（特許文献１０）。しかしながら、この微生物は、微生物の全脂肪に対して４０％を超えるＤＨＡを蓄積するが、ＤＨＡリン脂質の含有量は、微生物の全脂肪に対して１２〜１３％程度に過ぎない。

また、生物材料から調製されるＤＨＡリン脂質のほとんどは、リン脂質分子中に１分子のＤＨＡを持つだけであり、構成脂質としてのＤＨＡの含有量が５０％を超える、生物材料由来のリン脂質はほとんど報告されていない。従って、リン脂質中のＤＨＡ含量を高めることは、機能性食品の他に、医薬としての利用価値も高めることができる、重要な課題である。

酒井正士ら、「ホスファチジルセリンと脳機能」、２００２年、オレオサイエンス、第２巻、第２号、第２３−２８頁ＫａｆｒａｗｙＯら、ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．、１９９８年、第１３２巻（１−２）、第２３−２９頁特開昭５９−３９２５８号公報特表平８−２０２４０５号公報特表平８−５０９３５５号公報特開２００１−２７５６５６号公報特開２００４−２９８７９８号公報特開２００３−０００２９２号公報特開平９−０００２８４号公報特開平１０−０７２５９０号公報特開平１０−３１０５５６号公報特開２００６−２３０４０３号公報

本発明は、魚油や鶏卵を原料とせず、微生物を用いたω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質、特にＤＨＡを構成脂質とするＤＨＡリン脂質をより簡便に製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、ラビリンチュラ類１２Ｂ株に代表されるω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を、炭素源を含む通常の培地で培養するだけでなく、この様な培地で増殖させた微生物を、炭素源を含まない培地でさらに培養することによって、脂質全体におけるＤＨＡリン脂質の含有量ひいてはＤＨＡリン脂質の生産量自体も高めることができることを見いだし、下記の各発明を完成した。

（１）炭素源を含む培地でω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を増殖させる工程、及び増殖させた前記微生物を、炭素源を含まない培地でさらに培養する工程を含む、ω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質の製造方法。

（２）ω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物がラビリンチュラ類微生物又はトロウストチトリアレ類微生物である、（１）に記載の製造方法

（３）ラビリンチュラ類微生物がラビリンチュラ１２Ｂ株である、（２）に記載の製造方法。

（４）ラビリンチュラ類微生物が、ラビリンチュラ属微生物、トラウストキトリウム属微生物、及びシゾキトリウム属微生物よりなる群から選ばれる、（２）に記載の製造方法。

（５）ラビリンチュラ類微生物がラビリンチュラ属Ｓ３−２株又はシゾキトリウム属ＳＲ２１株である、（４）に記載の製造方法。

（６）ω３系不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である、（１）〜（５）の何れかに記載の製造方法。

（７）強制通気を行いながら炭素源を含まない培地での培養を行う、（１）〜（６）の何れかに記載の製造方法。

本発明の方法によれば、ω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を用いて、ω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とする高付加価値のリン脂質を大量に生産することができる。

本発明にいうω３系不飽和脂肪酸としては、リノレン酸、オクタデカテトラエン酸、エイコサテトラエン酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ酸を挙げることができるが、本発明で好ましいω３系不飽和脂肪酸は、ＥＰＡ又はＤＨＡであり、特に好ましくはＤＨＡである。

ω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物としては、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａなどのモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属微生物、Ｄｅｓｍａｒｅｓｔｉａａｃｃｕｌｅａｔａなどのデスマレスティア（Ｄｅｓｍａｒｅｓｔｉａ）属微生物、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉ等の渦鞭毛藻、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）類微生物等を挙げることができる。ラビリンチュラ類微生物の具体例としては、ラビリンチュラ科のラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、例えばラビリンチュラ属Ｓ３−２株（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７０９０）、ヤブレツボカビ科のラビリンチュロイド（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、コラロキトリウム（Ｃｏｒａｌｌｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アルトルニア（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、およびシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、例えばシゾキトリウム属ＳＲ２１株（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５０３４）等を挙げることができる。

また、本発明者らが単離し、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に所在する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に平成１７年１月２４日に受託番号ＮＩＴＥＰ−６８として寄託した、ラビリンチュラ類微生物であるラビリンチュラ１２Ｂ株を挙げることができる。本発明の製造方法において特に好ましい微生物は、このラビリンチュラ１２Ｂ株である。ラビリンチュラ１２Ｂ株の詳細な性状は、特許文献（特開２００６−２３０４０３）に記載されている。

本発明の製造方法は、炭素源を含む培地でω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を培養する工程を含む。この工程における培養は、特別な条件下で行う培養ではなく、利用するω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物にとって、その細胞数を増加させ、菌体内にトリグリセリドや脂肪酸、リン脂質その他の脂肪を蓄積させることのできる、糖その他の炭素源を含む培地を用いた標準的な条件で行われる培養である。従って、使用する微生物毎に報告されている当該微生物が良好に増殖する培養条件、例えば温度、培地組成、培地のｐＨ、酸素濃度、光、振蕩速度、培養時間等に従い、当該微生物の増殖に好適な炭素源を含む培地を適宜選択して使用すればよい。

培地の例としては、ラビリンチュラ科微生物に対してはＰＹ培地（約５０％の塩濃度をもつ人工海水１L当りポリペプトン１ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、Ｋｕｍｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００２年、第６０巻、第２７５−２８０頁）等を、ヤブレツボカビ科微生物に対しては酵母抽出物‐ペプトン‐ブドウ糖‐海水培地（水１L当りそれぞれ１０ｇ、１０ｇ、８０ｇ、５００ｍL）等を、また渦鞭毛藻に対しては酵母抽出物‐ブドウ糖‐海水塩培地（水１L当りそれぞれ２ｇ、９ｇ、２５ｇ）等を利用することができる。培地は、液体、固形、または形状保持性を有する半固形の何れかの形状を有していればよい。また、上記培養工程では、培地の形状が固形である場合に、当該培地に添加する水分量の下限を４５％（ｖ／ｗ）以上とすることが好ましく、水分量の上限を６０％（ｖ／ｗ）以下とすることが好ましい。特に好ましくは４５〜５０％の範囲内が好ましい。

炭素源は、上記の培地に予め添加する、及び／又は培養と共に培地に炭素源を添加することができる。また炭素源の量は、使用する微生物の細胞数が培養時間と共に増加し、菌体内にトリグリセリドや脂肪酸、リン脂質その他の脂肪を蓄積するに十分な量であればよい。また、上記培養工程では、静置培養または振盪培養の何れかを適宜選択することができる。

本発明の製造方法は、上記工程によって増殖させた微生物を、炭素源を含まない培地でさらに培養する工程を含む。以下の推察に拘束されるものではないが、炭素源を含む培地で良好に生育し、ω３系不飽和脂肪酸を含む多くの脂肪を菌体に蓄えたω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を、炭素源を含まない培地で更に培養することによって、菌体に蓄積された脂肪をω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質へと生物変換させ、リン脂質全体におけるω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質の含有量ひいてはω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質の生産量自体も高めることができるものと推察される。

本発明にいう「炭素源を含まない培地」とは、グルコースやデンプンに代表される糖類だけでなく、米糠やふすま、酢酸やエタノールなどを含め、本発明で使用される微生物が菌体内に蓄積された脂肪に先んじて利用を優先するような炭素源を含まない培地を意味する。また、本発明にいう「炭素源を含まない培地」とは、字句通りに炭素源を全く含まない培地のみを意味するものではなく、微生物をして菌体内に蓄積された脂肪を利用して増殖を行わせ、ω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質を生成させることができる限りにおいて、少量の炭素源が含まれる培地も意味するものである。例えば、「炭素源を含む培地」で増殖させた微生物を回収してそのまま利用する際の、いわゆる前培養からの持ち込みとしての炭素源、あるいは培地を構成するペプトンその他の成分に混在する微量の炭素源などを含む培地は、本発明にいう「炭素源を含まない培地」に該当する。

上記の意味における炭素源を含まないことの他は、本発明にいう「炭素源を含まない培地」は、微生物の増殖にとって必要あるいは良好な栄養素を含む培地であることが好ましく、その様な培地、培養条件及びそれらの例は、前記の「炭素源を含む」培地と、これを用いて微生物を培養して菌体に脂肪を蓄積させるときの培養条件と同じであってよい。また、炭素源を除くその他の培地を構成する成分、組成などは、使用する微生物に応じて、当該微生物に好適な成分や組成を採用して用いればよい。

本発明で特に好ましい態様は、微生物としてラビリンチュラ１２Ｂ株を利用したＤＨＡリン脂質の製造方法である。ラビリンチュラ１２Ｂ株は、炭素源としてグルコースを含む培地を用いて３０℃で培養すると、約１５ｇ／Ｌもの脂質（脂肪酸として）を細胞内に蓄積させることから、炭素源を含まない培地で増殖させる際に、炭素源として利用可能な脂肪（トリグリセリド）を豊富に含んでいる点で有利である。また、炭素源を含む培地で増殖させたラビリンチュラ１２Ｂ株に蓄積される脂肪酸の４０％以上がＤＨＡであり、当該ＤＨＡを利用してＤＨＡリン脂質へと変換する上でも、好適な微生物である。

またラビリンチュラ１２Ｂ株は、比較的単純な組成からなる培地、例えば５０％海水、１％ペプトン、１％酵母エキス、８％グルコースを含む培地（以下、Ｆ培地と表す）においても良好に増殖し、製造コストを抑制することができる点でも、本発明において有利な微生物である。

ラビリンチュラ１２Ｂ株を利用したＤＨＡリン脂質の製造方法において、上記のＦ培地は「炭素源を含む培地」の好適な例として使用することができる。また「炭素源を含まない培地」としては、上記のＦ培地からグルコースを抜き、他に米糠などの炭素源として利用可能な成分を含まない培地（以下、Ｚ１培地と表す）を好適な例として使用することができる。

ラビリンチュラ１２Ｂ株を利用したＤＨＡリン脂質の製造方法としては、適当量のＦ培地にラビリンチュラ１２Ｂ株細胞を接種し、３０℃で２４時間〜７２時間、振蕩培養を行ってラビリンチュラ１２Ｂ株を増殖させた後、この培養液の一部を、あるいは培養液から遠心分離等で回収した細胞を適当量のＺ１培地に加え、さらに３０℃で２４時間〜７２時間培養を行うことを例示することができる。この方法により、Ｆ培地で培養を終了した時点に比べて、ラビリンチュラ１２Ｂ株の細胞内にＤＨＡリン脂質をより多く含ませることができる。特に、「炭素源を含まない培地」における培養工程は、強制通気を行いながら培養することが好ましい。

本発明の製造方法は、上記の工程で得られたω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質を菌体から抽出ないし回収する工程、さらに必要に応じて当該リン脂質を精製する工程を含んでいてもよい。微生物菌体内に蓄積したリン脂質の回収並びに精製は、例えばＢｌｉｇｈら（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９５９年、第３７巻、第９１１−９１７頁）に記載の方法に従って行うことが出来る。

また、本発明によって製造されるω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質は、そのまま食品、食品添加物、飼料用添加物、医薬品等として用いることができ、また食品、サプリメント、飼料、医薬品又はこれらの原料に添加して利用してもよい。

本発明について、実施例を示してさらに詳しく説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではなく、当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、以下の実施例では、重量％は単に「％」と記載する。

＜実施例１＞
Ｂｙ＋培地（０．１％ペプトン、０．１％酵母エキス、０．５％ブドウ糖、５０％海水、１．０％寒天）を含む寒天平板培地で保存しているラビリンチュラ１２Ｂ株細胞の１白金耳（約１ｍｇ）を、１０ｍＬのＦ培地（５０％海水、１％ペプトン、１％酵母エキス、８％グルコース）に接種し、３０℃で７２時間培養した。培養後の培養液の濁度（ＯＤ₆₀₀）は約３６であった。この培養液４ｍＬを、Ｚ１培地（Ｆ培地からグルコースを除いた培地）２５ｍＬに接種し、３０℃で４８時間、培養を行った。培養中は経時的に培養液のＯＤ₆₀₀を測定し、また培養終了後の細胞の乾燥重量、乾燥細胞から抽出した全脂質の量、全脂質中のＴＧの量、リンの量、リンの量から算出されるリン脂質量と全脂質に対する比、及び全脂質脂肪酸中のＤＨＡの含量を求めた（表１）。

１白金耳のラビリンチュラ１２Ｂ株細胞は、乾燥重量に換算して約０．５ｍｇの菌体重量に相当する。この菌体を１０ｍＬのＦ培地に接種し、７２時間培養した場合の菌体の乾燥重量は、ＯＤ値から換算して２４６ｍｇとなる。一方、１白金耳のラビリンチュラ１２Ｂ株細胞を１０ｍＬのＺ１培地へ直接接種して７２時間３０℃で培養したが、培養終了時のＯＤ値から換算した細胞の乾燥重量は１６．３ｍｇであり、Ｆ培地で培養した場合の７％であった。このことから、Ｚ１培地を用いて直接培養を行ったときのラビリンチュラ１２Ｂ株の増殖性は極めて低いと考えられる。

一方、Ｆ培地で７２時間培養した培地４ｍＬに含まれるラビリンチュラ１２Ｂ株細胞の乾燥重量（換算値）は９０．６ｍｇであるが、これを接種したＺ１培地で４８時間培養して最終的に得られるラビリンチュラ１２Ｂ株細胞の乾燥重量（換算値）は２３５ｍｇと、２．６倍に増加していた。また、Ｚ１培地を用いた４８時間の培養において、細胞から抽出される全脂質量は３８．８ｍｇから２２．０ｍｇへと約４３％減少し、全脂質中のＴＧ（脂肪酸量として）は６６．８％から５．４％へと減少していた。

これらの結果は、炭素源を含まないＺ１培地における培養によって、ラビリンチュラ１２Ｂ株細胞に蓄積されていた内在性脂質、特にＴＧが、ラビリンチュラ１２Ｂ株の増殖のために消費されたことを示唆していると考えられる。

その一方、Ｚ１培地で４８時間培養後のラビリンチュラ１２Ｂ株細胞の細胞内全脂質中のリン脂質含量（リンの量からの換算値）は、５．０ｍｇから１４．８ｍｇへと約３倍増加し、全脂質中のリン脂質含量は１２．９％から６７．３％へと約５倍増加した。また、全脂質中のＤＨＡの含量は、Ｆ培地で培養した細胞では４４.７％であるのに対して、Ｚ１培地で培養した細胞では培養時間に応じて増加し、４８時間培養した場合は約５７％であり、ラビリンチュラ１２Ｂ株細胞において、リン脂質の構成脂質としてのＤＨＡ含量の上昇したことを示す。

＜実施例２＞
実施例１と同様にラビリンチュラ１２Ｂ株細胞を培養したＦ培地の培養液４ｍＬを、Ｚ１培地のペプトンと酵母エキスを２％としたＺ２培地、及びＺ１培地のペプトンと酵母エキスを４％としたＺ４培地各２５ｍＬに接種し、３０℃で４８時間培養した。培養後の濁度、回収された細胞の乾燥重量、乾燥細胞から抽出した全脂質量、全脂質中のリン量、リン量から算出されるリン脂質量とそれらの比及びＤＨＡ含量を求めた（表１）。リン脂質の定量はホスファチジルセリン（シグマ）を標準品として無機リン量を定量することにより求めた。

その結果、ペプトン、酵母エキスの含量を高めることでラビリンチュラ１２Ｂ株細胞の細胞収量は増加し（Ｚ１培地で２３５ｍｇ、Ｚ２培地で２４３ｍｇ、Ｚ４培地で３３９ｍｇ）、Ｚ４培地では、接種時（Ｆ培地で培養した培養液４ｍＬ中の細胞乾燥重量９０．６ｍｇ）の約４倍となった。また、全培養終了後の細胞から回収される全脂質量は、Ｚ２培地とＺ４培地でそれぞれ２８．５ｍｇと４０．０ｍｇであった。

また、Ｚ２培地、Ｚ４培地で培養したラビリンチュラ１２Ｂ株の細胞全脂質中のリン脂質含量はそれぞれ１４．９ｍｇ、２０．８ｍｇであり、Ｚ１培地で培養した場合の１４．８ｍｇよりも増加したが、割合はＺ２培地、Ｚ４培地でそれぞれ５２．３％及び５２．０％であり、Ｚ１培地の場合の６７．３％より低下した。また、全脂質に占めるＴＧの割合もＺ培地のペプトンや酵母エキスの濃度が上昇するにつれて増加した。

すなわち、Ｚ培地のペプトンや酵母エキス濃度を上げることは、全脂質に対するリン脂質の割合は低下させるが、細胞の増殖量の増加によってリン脂質の生産量を高めることが確認された。

＜実施例３＞
Ｚ１培地に、１ｍＭＫ_２ＰＯ_４、１ｍＭＫ_２ＰＯ_４と１ｍＭセリン、１ｍＭＫ_２ＰＯ_４と１ｍＭエタノールアミンをそれぞれ添加した培地（以下、それぞれＺ１ｐ、Ｚ１ｐｓ、Ｚ１ｐａと表す）を用意し、実施例１と同様の培養を行って、培養後の濁度、回収された細胞の乾燥重量、乾燥細胞から抽出した全脂質量、全脂質中のリン量、リン量から算出されるリン脂質量とそれらの比及びＤＨＡ含量を求めた。

その結果、Ｚ１ｐｓにおいてリン脂質量の増加（１５．２ｍｇ）が認められた。この結果は培地に無機リン及びアミノ酸を添加することにより、リン脂質の生産量を増加させることができることが確認された。

上記実施例１〜３における分析結果を表１に示す。

＜実施例４＞
１）ＢＹ＋培地の寒天プレートに保存しているラビリンチュラ１２Ｂ株の細胞の１白金耳分を５００ｍＬフラスコ中の２００ｍＬのＦ培地に接種し、３０℃、３日間前培養を行った。この前培養液１００ｍＬを、６２５ｍＬのＺ１培地／２．５Ｌ容積のジャーファーメンター（ＪＦ：東京理科器械社製）に加え、ＪＦの上部空間（ヘッドスペース）に対して通気（１０００ｍＬ／分）しながら、３０℃、攪拌速度３００ｒｐｍで２４時間培養した。この培養条件によって、消泡剤を使用することなく培養液の発泡による損失を抑制することができる。培養液３０ｍＬを回収し、細胞の乾燥重量、全脂質量、全リン脂質量を求め、全培養液当りに換算した。ＤＨＡ含量の含量は、全脂質をメタノリシス後、ＧＣにより求めた。また、容器をフラスコとし、通気を行なわずに培養時間を４８時間とした以外は上記と条件で培養したフラスコ培養を対照として用意した。

上記の培養条件において、培養後の培養液の細胞濃度は５．７ｍｇ／ｍＬとなり、時間当りのリン脂質量は５６５μｇ／ｍＬ／２４時間であった。この値は、対照（フラスコ培養：２２５μｇ／ｍＬ／２４時間）の約２倍であった。

２）ＪＦの撹拌速度を５００ｒｐｍとした他は上記１）と同じ条件で培養を行ったところ、培養後の培養液の細胞濃度は６．９ｍｇ／ｍＬに達し、時間当りのリン脂質量は６４２μｇ／ｍＬ／２４時間となった。

３）ＪＦの上部空間（ヘッドスペース）に加えて、培地中にも通気（１１０ｍＬ／分）を行った他は、上記１）と同じ条件で培養を行ったところ、培養後の培養液の細胞濃度は７．７ｍｇ／ｍＬとなり、リン脂質量の生成速度は７５５μｇ／ｍＬ／２４時間（対照であるフラスコ培養の約３倍）に上昇した。

上記１）、２）、３）の結果を表２に示す。

＜分析方法＞
上記の実施例における各種の分析は、次に示すとおりに行った。

１）全脂質の抽出
乾燥菌体よりクロロホルム−メタノールを用いた定法（非特許文献１１）によって抽出される脂質を全脂質とした。全脂質中の脂肪と極性脂質を分離するために、全脂質サンプル１００μｇを、シリカゲルプレート（メルク社製シリカゲルＧ６０）を用いて１次元薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行った。展開溶媒の組成はヘキサン−エーテル−酢酸（５０：５０：１、体積比）である。展開後、プリムリンをプレートに噴霧し、ＵＶ照射下でスポットの位置を確認した。ＴＧの同定は標準物質とＲｆ値の比較により行った。

２）リン脂質の同定
全脂質（１ｍｇ）を、クロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４，体積比）を展開溶媒Ａとした１次元展開、次いでクロロホルム−アセトン−メタノール−酢酸−水（５０：２０：１０：１０：１，体積比）を展開溶媒Ｂとした２次元展開による二次元ＴＬＣを行い、極性基に特異的な試薬を吹きつけた。対象となるスポットをプレートからかきとり、クロロホルム−メタノール混液を用いてリン脂質を抽出した。リン脂質の同定は、ＴＬＣプレート上での検出試薬との反応性、及び抽出物とリン脂質標準物質との異なる３種類の展開溶媒（展開溶媒Ａ、Ｂ及びクロロホルム−メタノール−アンモニア水（５０：２０：１０、体積比）からなる溶媒Ｃ）を用いた１次元ＴＬＣにおけるＲｆの比較により行った。

Ｆ培地で３０℃、７２時間培養後、及びＺ１培地で３０℃、４８時間培養後のラビリンチュラ１２Ｂから抽出した全脂質の１次元ＴＬＣの結果を、図１に示す。スポット１がＴＧ、スポット２が遊離脂肪酸である。原点（スポット３）が極性脂質である。ＴＧ、遊離脂肪酸、極性脂質、及びそれ以外の中性脂質の脂肪酸量を基にした割合を表２に示す。

Ｆ培地からＺ培地への移行によりＴＧが減少し、遊離脂肪酸と極性脂質の割合が増加した。Ｚ２培地、Ｚ４培地で培養した場合もＺ１培地で培養した場合と同様、ＴＧの減少、極性脂質の増加の傾向を示したが、Ｚ１培地の場合ほど顕著ではなかった。Ｚ２培地を用いて培養した細胞の場合を除いて極性脂質のＤＨＡ含量はＴＧのＤＨＡ含量を上回っていた。

全脂質の２次元ＴＬＣの結果を図２に示す。図２ａはプレートに蛍光物質（プリムリン）を噴霧した後に紫外線照射下で撮影したものであり、図２ｂは図２ａを模式的に図示したものである。各スポットには図２ｂに示すように番号を付した。各スポットを与える脂質の検出試薬に対する反応性を調べた。脂質１、２、３、４、６、７、８、９はＤｉｔｔｍｅｒ試薬に陽性であり、リン脂質であることがわかった。これらの脂質の他の検出試薬に対する反応性から、脂質２はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、脂質３と４はホスファチジルコリン（ＰＣ１とＰＣ２）、脂質６と７はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ１とＰＥ２）と同定された。この結果は、それぞれの標準物質とのＲ_ｆ値の比較によって確認された。ＰＣ、ＰＥともに２つのスポットを与えるのは、構成する脂肪酸（特にＤＨＡの含量）が異なるためであると考えられる。他のリン脂質を含む極性脂質は未同定である。０は原点をあらわし、スポット５と番号のないスポットはＤｉｔｔｍｅｒ試薬に対して陰性の脂質である。

３）リン脂質の組成とＤＨＡ含量
Ｚ１培地で３０℃４８時間培養後のラビリンチュラ１２Ｂ株細胞から抽出した全脂質に対して二次元ＴＬＣを行った後、Ｚ１培地由来の脂質の全スポットをかきとり、Ｉｓｔｏｋｏｖｉｃｓらの方法（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８８年、第４４巻、第１０５１−１０５９頁）に従ってリンを定量した。全リン脂質中、ＰＣは６１．３％、ＰＥは１１．９％、ＰＩは１２．５％、その他が１４．６％であった。ＰＣとＰＥについて脂肪酸量を基にした場合、ＰＣ１とＰＣ２はそれぞれ４６．０％、５４．０％であり、ＰＥ１とＰＥ２はそれぞれ４６．７％、５３．３％であった。

さらに、既知量（２００μｇ）の内部標準物質となるｈｅｎｅｉｃｏｓａｎｏｉｃａｃｉｄとともに定法によってメタノリシスし、脂肪酸メチルエステルをＧＣにより分析した。ＰＣ１とＰＣ２は全脂肪酸の３９．２％及び６６．８％がＤＨＡ、ＰＥ１とＰＥ２は全脂肪酸の２３．０％、３３．３％がＤＨＡであった。ＰＩのＤＨＡ含量は２０．９％であった。このことからＤＨＡがＰＣ、特にＰＣ２の構成脂質であることが分かった。計算で求めた全ＰＣ、全ＰＥのＤＨＡ含量はそれぞれ５４．０％と２８．４％であった。以上の結果を表３に示す。なお、表３のリン脂質のＤＨＡ含量の値は、Ｚ１培地で培養した細胞に由来する全脂質のＤＨＡ含量５６．５％（表１）や極性脂質のＤＨＡ含量５６．６％、ＴＧのＤＨＡ含量（５２．６％）に比べると低いが、これはＴＬＣあるいはＧＣの過程で多価不飽和脂肪酸の分解が起きているためである。

Ｆ培地及びＺ１培地で培養したラビリンチュラ１２Ｂ株細胞の全脂質の１次元ＴＬＣのクロマトグラムを示す。レーン１：Ｆ培地で３０℃、７２時間後の全脂質（２５０μｇ）、レーン２：Ｚ１培地で３０℃、２４時間培養後の全脂質（２５０μｇ）、レーン３：Ｚ１培地で３０℃、４８時間培養後の全脂質（２５０μｇ）。Ｆ培地及びＺ１培地で培養したラビリンチュラ１２Ｂ株細胞の全脂質の２次元ＴＬＣのクロマトグラム（プリムリンを噴霧後、ＵＶ照射下で撮影）を示す。パネル上：Ｆ培地で３０℃、７２時間培養後の全脂質（１ｍｇ）、パネル下：Ｚ１培地で３０℃、４８時間培養後の全脂質（１ｍｇ）。図２ａに示すクロマトグラムを模式的に記したものを示す。スポット１から９がリン脂質である。パネル上：Ｆ培地で３０℃、７２時間培養後の全脂質、パネル下：Ｚ１培地で３０℃、４８時間培養後の全脂質。

Claims

炭素源を含む培地でω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を増殖させる工程、及び増殖させた前記微生物を、炭素源を含まない培地でさらに培養する工程を含む、ω３系不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質の製造方法。
ω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物がラビリンチュラ類微生物又はトロウストチトリアレ類微生物である、請求項１に記載の製造方法
ラビリンチュラ類微生物がラビリンチュラ１２Ｂ株である、請求項２に記載の製造方法。
ラビリンチュラ類微生物が、ラビリンチュラ属微生物、トラウストキトリウム属微生物、及びシゾキトリウム属微生物よりなる群から選ばれる、請求項２に記載の製造方法。
ラビリンチュラ類微生物がラビリンチュラ属Ｓ３−２株又はシゾキトリウム属ＳＲ２１株である、請求項４に記載の製造方法。
ω３系不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である、請求項１〜５の何れかに記載の製造方法。
強制通気を行いながら炭素源を含まない培地での培養を行う、請求項１〜６の何れかに記載の製造方法。