JP3723822B2 - 高度不飽和脂肪酸の製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を利用して、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサテトラエン酸(DTA)、ドコサペンタエン酸(DPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)などの高度不飽和脂肪酸を高収率で製造する方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
ラビリンチュラ(Labyrinthula)類には、スラウストキトリウム科(Thraustochytrid)及びラビリンチュラ科(Labyrinthulid)の2つの科が存在し、そのうちラビリンチュラ科はラビリンチュラ属の1属からなる微生物である。これらはアラキドン酸、EPA、DTA、DPA、DHAなどの高度不飽和脂肪酸を蓄積する微生物として知られている。
【0003】
しかしながら、ラビリンチュラ科の微生物は、自然界からの単離が困難な上に、有効な培養方法が無いため、これまでこの微生物を利用して長鎖高度不飽和脂肪酸を製造することは行われていなかったが、最近、それを容易に単離しうる方法が知られ(特許第2976027号)、これを油脂含有寒天培地を用いて培養することにより、高度不飽和脂肪酸を製造する方法が提案されるに至った(特願2000−94441号)。
【0004】
この方法は、グルコース、酵母エキス、ペプトンなどの栄養源と寒天5〜20g/リットルを含む天然海水又は人工海水からなる基本培地に炭素源として油脂又は脂肪酸を加え、これにラビリンチュラ属微生物を接種し、20〜30℃で7〜14日間培養することにより、高度不飽和脂肪酸を生産する方法であるが、高度不飽和脂肪酸の生産量はせいぜい寒天培地1g当り0.1〜0.76mgであり、最高含有量0.76mgにおける高度不飽和脂肪酸の含有率は7%以下という低い値であった。また、含有率を10%以上に高めようとすると、高度不飽和脂肪酸の生産量が寒天培地1g当り0.23mgに低下するため、工業的に高度不飽和脂肪酸を回収、精製するのに望ましい条件、すなわち寒天培地1g当り高度不飽和脂肪酸1mg以上で含有率10%以上を考えると、この方法は工業的には必ずしも満足できるものとはいえない。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、ラビリンチュラ科に属する微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を生産するに当り、その生産効率を高め、高収率で高度不飽和脂肪酸を得るための改良方法を提供することを目的としてなされたものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ラビリンチュラ科に属する微生物を培養して、高度不飽和脂肪酸を生産させる際に、基本培地にレシチンを添加することにより、従来の油脂や脂肪酸を炭素源とした場合に比べ、著しく高い収率で高度不飽和脂肪酸が得られることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【0007】
すなわち、本発明は、高度不飽和脂肪酸生産能を有するラビリンチュラ科(Labyrinthulid)に属する微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を製造するに当り、栄養源及び海水を含む基本培地にレシチンを添加することを特徴とする高度不飽和脂肪酸の製造方法を提供するものである。
【0008】
ここで用いるレシチンは、ホスファチジルコリンとも呼ばれ、動物、酵母、カビ類に広く存在するリン脂質で、哺乳動物の膜リン脂質では全リン脂質の50%近くを占めている。このものは、一般式
【化1】
(式中のR及びR′は脂肪酸残基である)
で表わされる化学構造を有し、その多くはRが飽和脂肪酸残基、R′が不飽和脂肪酸残基である。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明方法で用いる高度不飽和脂肪酸生産能を有するラビリンチュラ科に属する微生物としては、例えば石垣島で採取されたオヒルギの落葉から分離されたラビリンチュラ・エスピーS3−2(Labyrinthula sp.S3−2株、受託番号FERM BP−7090)、ラビリンチュラ・ゾーステラエ(Labyrinthula zosterae、ATCC76120)、ラビリンチュラ・L4、L22、L25、L29などがある。
【0010】
次に、本発明においては、基本培地として、例えばグルコースのような糖類、ペプトン、無機塩及び酵母エキスのような栄養源0.1〜10g/リットルと寒天5〜20g/リットルを含む海水を滅菌したものが用いられる。この際の海水濃度としては、通常の海水濃度の25〜125%、特に50〜90%の範囲に調整されたものを用いるのが好ましい。
また、無機塩としては、NaCl、KCl、NaNO3、MgSO4・7H2O、K2HPO4、KH2PO4、FeSO4・7H2O、(NH4)2SO4などが用いられるが、海水中に含まれる成分については、特に添加する必要はない。
【0011】
本発明方法において用いるレシチンについては、特に制限はなく、植物由来、動物由来のいずれのものも用いることができるが、安価に入手できるという点で大豆レシチンや卵黄レシチン、特に大豆レシチンが好ましい。このレシチンは、基本培地1リットル当り、通常5〜40g、好ましくは5〜25gの範囲で添加された場合、培地中の目的物含量が高くなるが、所望ならばさらに高い濃度で用いることができ、このようにすれば全脂質中の高度不飽和脂肪酸の含有率をより高くすることができる。
【0012】
本発明方法を好適に実施するには、例えば塩分濃度を通常の海水における濃度の50%に調整した海水に、グルコース1.0g/リットル、ペプトン0.5g/リットル、酵母エキス0.25g/リットル及び少量の無機塩を溶解し、これに寒天5〜20g/リットルを加えて調製した培地を蒸気滅菌する。
【0013】
蒸気滅菌後、所要量のレシチンを加え、通常の培養用シャーレに混入し、冷却固化させる。レシチンを加える際、その分散を促進するためにTween80のような界面活性剤を培地中に添加しておくのが好ましい。次いで、これにラビリンチュラ属微生物を接種し、2〜14日間、好ましくは7〜10日間静置培養する。この際の至適温度は20〜30℃、至適pHは7〜9の範囲である。
したがって、培養条件としては、pH7〜9、温度20〜30℃、海水濃度25〜125%の範囲で選ぶのが好ましい。
【0014】
このようにして得られた培養物から、常法に従い、非水溶性有機溶剤で抽出処理し、抽出液から有機溶剤を蒸発除去することにより、所望の高度不飽和脂肪酸、例えばアラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの高度不飽和脂肪酸を含むトリアシルグリセロール混合物として回収することができる。そして、そのトリアシルグリセロール混合物を加水分解し、クロマトグラフィー処理により各高度不飽和脂肪酸を分離、回収することができる。
【0015】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
【0016】
なお、各例における基本培地としては、ポリぺプトン1g/リットル、酵母エキス0.5g/リットル、KH2PO4・7H2O0.2g/リットル、MgSO40.2g/リットル、Tween80 1.25g/リットル及び寒天15g/リットルを含む50%濃度人工海水を、また実施例7以外は菌株としてはラビリンチュラS3−2(寄託番号FERM BP−7090)を用いた。
そして、脂肪酸組成分析は、培養物の一部を採取し、ガスクロマトグラフィーにより、その中に含まれる全脂肪酸量及び高度不飽和脂肪酸生産量を測定することにより行った。
【0017】
実施例1
あらかじめ液体培地でサイクロバクタ属微生物(寄託番号FERM BP−7412)を増殖させた培養液を、表1に示す量すなわち0〜25g/リットルの大豆レシチンを加えた基本培地上に塗布し、その中央にラビリンチュラ属微生物を、レシチンを5g/リットルの濃度で加えた基本培地で培養した培養物(約25mm2の寒天片)を植菌し、25℃において7日間又は14日間培養した。
培養後、寒天培地の高度不飽和脂肪酸の生産量を分析し、その結果を全脂肪酸中の高度不飽和脂肪酸の含有率とともに表1に示す。
【0018】
【表1】
【0019】
この表から分るように、7日間の培養では、大豆レシチン濃度の高い方が、高度不飽和脂肪酸の生産量が高くなるが、14日間の培養では15g/リットルの濃度で最高値を示した。また、高度不飽和脂肪酸含有率は14日間の培養において、レシチン濃度5〜15g/リットルで最高値(約30質量%)を示した。
【0020】
実施例2
大豆レシチン濃度を5g/リットルとし、25℃から35℃までの異なった温度において、他の条件は実施例1と同様にして7日間培養した。
このときの高度不飽和脂肪酸の生産量及び全脂質中の高度不飽和脂肪酸の含有率を表2に示す。
【0021】
【表2】
【0022】
この表から明らかなように、低温域の20℃及び高温域の32.5℃、35℃において、高度不飽和脂肪酸はほとんど生産されず、25℃及び30℃において生産量、含有率ともに高い値を示した。また、生産量は30℃で含有率は25℃で最高値を示した。
【0023】
実施例3
大豆レシチン濃度を5g/リットルとし、異なったpH条件下、他の条件は実施例1と同様にして7日間培養を行った。この結果を表3に示す。
【0024】
【表3】
【0025】
この表から分るように、生産量はpH8で最高値を示し、含有率はpH6〜9の間で高い値を示しているので至適pHは8付近であると考えられる。
なお、培養終了後における培地のpHはいずれもほぼ中性となるため、このpH条件は培養初期において、ラビリンチュラ属微生物の増殖に好適な条件となっていると考えられる。
【0026】
実施例4
大豆レシチン濃度を5g/リットルとし、通常海水における塩分濃度の0〜125%の異なる塩分濃度に調整した人工海水を用い、他は実施例1と同様の条件下で7日間培養した。この結果を表4に示す。
【0027】
【表4】
【0028】
この表から明らかなように、海水濃度と同じ100%が生産量で最高値を示したが、含有率では75%で最高値を示した。
【0029】
実施例5
大豆レシチン濃度を5g/リットルとし、基本培地の異なる寒天濃度において、実施例1と同様にして7日間培養を行った。この結果を表5に示す。
【0030】
【表5】
【0031】
この表から明らかなように、生産量、含有率ともに濃度5g/リットルにおいて最高値を示した。このことより、寒天濃度はあまり高くしない方がよいことが分る。
【0032】
実施例6
大豆レシチン濃度15g/リットル、塩分濃度100%の人工海水、寒天濃度5g/リットルに調整した培地を用い、温度28℃、初期pH8の条件下で、7日間又は14日間培養したところ、高度不飽和脂肪酸生産量は、7日間で0.99mg/g−寒天、14日間で1.38mg/g−寒天を示し、また含有率は7日間で35.0質量%、14日間で33.4質量%という高い値を示した。
【0033】
実施例7
実施例6で用いた培地の大豆レシチン濃度を40g/リットルに変え、特許第2976027号の方法によって小笠原その他で得られた分離株4株(L4、L22、L25、L29)を用い、7日間、14日間又は21日間培養を行った。その結果を表6に示す。
【0034】
【表6】
【0035】
この表から分るように、実施例1に示したように、ラビリンチュラS3−2株を用いた場合においては、大豆レシチン濃度を15g/リットルよりも高くして生産量は増加せず、含有率はむしろ低下する傾向がみられたが、別の菌株を用いると、大豆レシチン濃度をさらに上げると生産量が増加することが分った。
すなわち、L25株は21日後において培地1g当り3.0mg以上の生産量を示すが、この値は大豆油のようなトリアシルグリセロールを添加した場合の約10倍に相当する。
【0036】
比較例
基本培地に、大豆油、トリオレイン、オレイン酸、オレイン酸エチル、γ‐リノレン酸含有微生物油(モールド油)、ゴマ油、ココナッツ油、オリーブ油、パーム油、アマニ油、牛脂の11種類の油脂をそれぞれ5g/リットル加えたもの、及び大豆レシチンを5g/リットル加えたものを用いて25℃において7日間培養した。なお、各油脂は、界面活性剤(tween−80)を加えることによって分散性を高め、基本培地とは別にオートクレーブを用い、クリーンベンチ内で無菌的に混合した。
培養終了後、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成分析を行った結果を棒グラフとして図1及び図2に示す。図1は、高度不飽和脂肪酸の生産量のグラフであり、図2は含有率のグラフである。
これらの図から明らかなように、生産量、含有率ともに大豆レシチンを用いた場合、油脂を用いた場合に比べ著しく高い値を示した。
【0037】
【発明の効果】
本発明によれば、植物油の抽出の際に副生し、これまでほとんど利用されていなかった大豆レシチンのようなレシチンを添加した基本培地を用いて、ラビリンチュラ属に属する微生物を培養することにより、効率よく高度不飽和脂肪酸を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 各種油脂又は大豆レシチンを添加した基本培地を用いたときの高度不飽和脂肪酸の生産量を示す棒グラフ。
【図2】 同じく含有率を示す棒グラフ。
Claims (4)
- 高度不飽和脂肪酸生産能を有するラビリンチュラ科(Labyrinthulid)に属する微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を製造するに当り、栄養源及び海水を含む基本培地にレシチンを添加することを特徴とする高度不飽和脂肪酸の製造方法。
- 基本培地に対し、レシチン5〜40g/リットルの割合で添加する請求項1記載の高度不飽和脂肪酸の製造方法。
- レシチンが大豆レシチンである請求項2記載の高度不飽和脂肪酸の製造方法。
- pH7〜9、温度20〜30℃、海水濃度25〜125%の培養条件で行う請求項1、2又は3記載の高度不飽和脂肪酸の製造方法。
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