JP5903214B2

JP5903214B2 - 微生物発酵によるｄｈａ含有ホスファチジルセリンの製造方法

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Publication number: JP5903214B2
Application number: JP2011013708A
Authority: JP
Inventors: 英登志奥山; 直史坂口; 若浜貴宏; 竜二堀; イスカンダルビンハジモハマッドタハアマッド; 眞美子佐藤; 堯子金子; 芳雄清水; 貴士木元
Original assignee: Bizen Chemical Co Ltd
Current assignee: Bizen Chemical Co Ltd
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2031-01-26
Also published as: JP2012152130A

Description

本発明は、高付加価値を有するホスファチジルセリンを製造する方法に関し、特には、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を構成脂肪酸とするホスファチジルセリンを製造する方法に関する。

ホスファチジルセリンは動植物、微生物にほぼ普遍的に存在するリン脂質である。しかし、一般的にその含量は全リン脂質の１０％以下と低いが、動物の脳細胞中の含量は３０％を超える場合がある（非特許文献１）。従って、狂牛病の発生までは、ホスファチジルセリンの原料として牛の脳が使われていた。現在、実用化されているホスファチジルセリン生成技術はエステル交換法である。これはホスフォリパーゼＤの極性基交換反応を利用するものであり（非特許文献２）、例えばホスファチジルコリン及びセリンにホスフォリパーゼＤを働かせることにより、コリンとセリンとの交換反応が起こり、ホスファチジルセリンが生成される。この方法はＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンの生成にも使用可能であるが、その前提として、基質としてＤＨＡを高い割合で含むリン脂質、例えばＤＨＡ結合型ホスファチジルコリン（以下、ＤＨＡ−ＰＣともいう）やＤＨＡ結合型ホスファチジルエタノールアミン（以下、ＤＨＡ−ＰＥともいう）等が必要であり、ＤＨＡに富んだリン脂質を基質として用いる必要があることから、実際上ＤＨＡ結合型ホスファチジルセリン（以下、ＤＨＡ−ＰＳともいう）の合成には不向きであると考えられる。

一方、ＤＨＡは血中脂質低下作用、脳視覚機能の改善などの生理効果を示すことから、機能性脂質と言われており、ヒトに不可欠の栄養分であるが、食品からの摂取が不足しがちであるため、必要摂取量を補うためのＤＨＡを含む健康食品素材又はサプリメントが広く市販されている。また、ホスファチジルセリンとＤＨＡとの組合せが重要であるとの認識から、ホスファチジルセリンとＤＨＡとの混合物がサプリメントとして市場に出ている。より具体的には大豆に由来するホスファチジルセリンに、魚油に由来するＤＨＡを混合したものや、これらの化合物を抱合したもの（conjugate）である（例えば、Ｅｎｚｙｍｏｔｅｃ社製のＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ-ＳｅｒｉｎｅＤＨＡＯｐｔｉｍｉｚｅｄ（非特許文献３）。；但し、後者の場合、抱合の具体的方法、抱合された物質の分子形態は不明である。また、これらの物質はＤＨＡ結合型リン脂質（ＤＨＡ−ＰＬともいう）そのものではない。従って、現在は、高いＤＨＡ含量をもつＰＳを高い収率で直接生産する方法は存在していないのが実情である。

一方、特許文献１には、微生物発酵によるＤＨＡ含有リン脂質の製造方法が開示されている。この方法によれば、ＤＨＡ含有リン脂質を簡便に製造することができるが、この方法によって得られるＤＨＡ含有リン脂質中のホスファチジルセリンの含有量は未同定リン脂質を含めても全リン脂質のおおよそ１５％以下と見積もられ、高いものではなかった。

ＷＯ２００８／１４９５４２

The AOCS Lipid Library. http://lipidlibrary.aocs.org/lipids/ps/index.htm M Hosokawa, T Shimatani, T Kanada, Y Inoue, and K Takahashi (2000) Conversion to docosahexaenoic acid-Containing phosphatidylserine from squid skin lecithin by phospholipase D-mediated transphosphatidylation. J. Agric. Food Chem. 48: 4550-4554 http://www.vitasprings.com/phosphatidyl-serine-dha-optimized-60-capsules-source-naturals.html

本発明は、微生物を用いることにより、ＤＨＡを構成脂肪酸とする、ＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンを簡便に製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、炭素源を含む培地でドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物を増殖させる工程、及び増殖させた前記微生物を、炭素源を含まない液体培地中で更に振盪培養する工程を有する培養方法において、培養容器と液体培地の容量との比率を特定の範囲にすることにより、ＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンの生産性が向上し得ることを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、炭素源を含む培地でドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物を増殖させる工程、及び増殖させた前記微生物を、炭素源を含まない液体培地中で更に振盪培養する工程を含む、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法であって、振盪培養が培養容器中で行われ、上記容器の容量と上記液体培地の容量との比率が２０：１〜５：１である、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法である。

ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物としては、ラビリンチュラ類微生物又はトロウストチトリアレ類微生物が挙げられる。
ラビリンチュラ類微生物としてはラビリンチュラ１２Ｂ株が挙げられる。
振盪培養は、２７〜３３℃の温度で行なうことができる。
また、振盪培養は、１８〜２２℃の温度で行なうことができる。

本発明の方法によれば、ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物を用いて、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを大量に生産することができる。

細胞由来の全脂質の１次元ＴＬＣの結果を示す写真である。細胞内構造を透過電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。

本発明のドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法は、炭素源を含む培地でドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物を増殖させる工程、及び増殖させた前記微生物を、炭素源を含まない液体培地中で更に振盪培養する工程を含む、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法であって、振盪培養が培養容器中で行われ、上記容器の容量と上記液体培地の容量との比率が２０：１〜５：１である。

本発明において用いられる、ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物としては、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａなどのモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属微生物、Ｄｅｓｍａｒｅｓｔｉａａｃｃｕｌｅａｔａなどのデスマレスティア（Ｄｅｓｍａｒｅｓｔｉａ）属微生物、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉ等の渦鞭毛藻、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）類微生物等を挙げることができる。ラビリンチュラ類微生物の具体例としては、ラビリンチュラ科のラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、例えばラビリンチュラ属Ｓ３−２株（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７０９０）、ヤブレツボカビ科のラビリンチュロイド（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、コラロキトリウム（Ｃｏｒａｌｌｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アルトルニア（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、およびシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、例えばシゾキトリウム属ＳＲ２１株（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５０３４）等を挙げることができる。

また、本発明において用いられる、ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物として、本発明者らが単離し、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に所在する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に平成１７年１月２４日に受託番号ＮＩＴＥＰ−６８として寄託した、ラビリンチュラ類微生物であるラビリンチュラ１２Ｂ株を挙げることができる。本発明の製造方法において特に好ましい微生物は、このラビリンチュラ１２Ｂ株である。ラビリンチュラ１２Ｂ株の詳細な性状は、特開２００６−２３０４０３号公報（特許第４０４７３５４号）に記載されている。

本発明の方法は、炭素源を含む培地でドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物を培養する工程を含む。この工程における培養は、特別な条件下で行う培養ではなく、利用するドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物にとって、その細胞数を増加させ、菌体内にトリグリセリドや脂肪酸、リン脂質その他の脂肪を蓄積させることのできる、糖や、その他の炭素源を含む培地を用いた標準的な条件で行われる培養である。従って、使用する微生物毎に報告されている当該微生物が良好に増殖する培養条件、例えば温度、培地組成、培地のｐＨ、酸素濃度、光、振蕩速度、培養時間等に従い、当該微生物の増殖に好適な炭素源を含む培地を適宜選択して使用すればよい。

培地の例としては、ラビリンチュラ科微生物に対してはＰＹ培地（約５０％の塩濃度をもつ人工海水１Ｌ当りポリペプトン１ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、Ｋｕｍｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００２年、第６０巻、第２７５−２８０頁）等を、ヤブレツボカビ科微生物に対しては酵母抽出物−ペプトン−ブドウ糖−海水培地（水１Ｌ当りそれぞれ１０ｇ、１０ｇ、８０ｇ、５００ｍL）等を、また渦鞭毛藻に対しては酵母抽出物−ブドウ糖−海水塩培地（水１Ｌ当りそれぞれ２ｇ、９ｇ、２５ｇ）等を利用することができる。培地は、液体、固形、または形状保持性を有する半固形の何れかの形状を有していればよい。また、上記培養工程では、培地の形状が固形である場合に、当該培地に添加する水分量の下限を４５％（ｖ／ｗ）以上とすることが好ましく、水分量の上限を６０％（ｖ／ｗ）以下とすることが好ましい。特に好ましくは４５〜５０％の範囲内が好ましい。

炭素源は、上記の培地に予め添加してもよく、又は培養と共に培地に炭素源を添加してもよい。また、予め添加し、更に培養と共に培地に添加してもよい。また炭素源の量は、使用する微生物の細胞数が培養時間と共に増加し、菌体内にトリグリセリドや脂肪酸、リン脂質その他の脂肪を蓄積するに十分な量であればよい。また、上記培養工程では、静置培養または振盪培養のいずれかを適宜選択することができる。

本発明の方法においては、上記工程によって増殖させた微生物を、炭素源を含まない培地でさらに培養する工程を含む。以下の推察に拘束されるものではないが、炭素源を含む培地で良好に生育し、ドコサヘキサエン酸を含む多くの脂肪を菌体に蓄えたω３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を、炭素源を含まない培地で更に培養することによって、菌体に蓄積された脂肪をドコサヘキサエン酸を構成脂肪酸とするホスファチジルセリンへと生物変換させ、リン脂質全体におけるドコサヘキサエン酸を構成脂肪酸とするホスファチジルセリンの含有量、ひいてはドコサヘキサエン酸を構成脂肪酸とするホスファチジルセリンの生産量自体も高めることができるものと推察される。

本明細書において用いられる場合、「炭素源を含まない培地」とは、グルコースやデンプンに代表される糖類だけでなく、米糠やふすま、酢酸やエタノールなどを含め、本発明において用いられる微生物が菌体内に蓄積された脂肪に先んじて利用を優先するような炭素源を含まない培地を意味する。また、本明細書において用いられる場合、「炭素源を含まない培地」とは、字句通りに炭素源を全く含まない培地のみを意味するものではなく、微生物をして菌体内に蓄積された脂肪を利用して増殖を行わせ、ドコサヘキサエン酸を構成脂肪酸とするホスファチジルセリンを生成させることができる限りにおいて、少量の炭素源が含まれる培地も意味するものである。例えば、「炭素源を含む培地」で増殖させた微生物を回収してそのまま利用する際の、いわゆる前培養からの持ち込みとしての炭素源、あるいは培地を構成するペプトンその他の成分に混在する微量の炭素源などを含む培地は、本発明にいう「炭素源を含まない培地」に該当する。

上記の意味における炭素源を含まないことの他は、本明細書で用いられる場合、「炭素源を含まない培地」は、微生物の増殖にとって必要あるいは良好な栄養素を含む培地であることが好ましく、そのような培地、培養条件及びそれらの例は、前記の「炭素源を含む」培地と、これを用いて微生物を培養して菌体に脂肪を蓄積させるときの培養条件と同じであってよい。また、炭素源を除くその他の培地を構成する成分、組成などは、使用する微生物に応じて、当該微生物に好適な成分や組成を採用して用いればよい。

本発明で特に好ましい態様は、微生物としてラビリンチュラ１２Ｂ株を利用したドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンの製造方法である。ラビリンチュラ１２Ｂ株は、炭素源としてグルコースを含む培地を用いて３０℃で培養すると、約１５ｇ／Ｌもの脂質（脂肪酸として）を細胞内に蓄積させることから、炭素源を含まない培地で増殖させる際に、炭素源として利用可能な脂肪（トリグリセリド）を豊富に含んでいる点で有利である。また、炭素源を含む培地で増殖させたラビリンチュラ１２Ｂ株において、脂肪を含む全脂質脂肪酸の４０％以上がＤＨＡであり、当該ＤＨＡを利用してＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンへと変換する上でも、好適な微生物である。

また、ラビリンチュラ１２Ｂ株は、比較的単純な組成からなる培地、例えば５０％海水、１％ペプトン、１％酵母エキス、８％グルコースを含む培地（以下、Ｆ培地と表す）においても良好に増殖し、製造コストを抑制することができる点でも、本発明において有利な微生物である。

ラビリンチュラ１２Ｂ株を利用したＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンの製造方法において、上記のＦ培地は「炭素源を含む培地」の好適な例として使用することができる。また「炭素源を含まない培地」としては、上記のＦ培地からグルコースを抜き、他に米糠などの炭素源として利用可能な成分を含まない培地（以下、Ｚ培地と表す）を好適な例として使用することができる。

ラビリンチュラ１２Ｂ株を利用したＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンの製造方法としては、適当量のＦ培地にラビリンチュラ１２Ｂ株細胞を接種し、３０℃で２４時間〜７２時間、振蕩培養を行ってラビリンチュラ１２Ｂ株を増殖させた後、この培養液の一部を、あるいは培養液から遠心分離等で回収した細胞を適当量のＺ培地に加え、さらに振盪培養することを例示することができる。この方法により、Ｆ培地で培養を終了した時点に比べて、ラビリンチュラ１２Ｂ株の細胞内にＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンをより多く含ませることができる。「炭素源を含まない培地」における培養工程は振盪培養により行う。振盪培養は培養容器中で行われ、容器の容量と上記液体培地の容量との比率が２０：１〜５：１であり、好ましくは１５：１〜７：１である。容器の容量と液体培地の容量との比率が２０：１を超えると増殖が異常に早まり、また酸素消費が活発になる結果、ＴＧの蓄積量が減るが、高い細胞収量は得られない、一方、５：１未満であると通気量が不足になるため呼吸が不活発になるため、脂肪酸合成に不可欠な還元当量（還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（NADPH）など）やATPの生成量が減じ、高いＴＧ蓄積が起こらず、また細胞収量を上げるために非常に長い時間を要する。なお、本発明において用いられる培養容器とは、一般に三角フラスコのことを意味する。例えば、３００ｍＬ容量の三角フラスコを用いる場合、容器内に液体培地を１５〜６０ｍＬ、好ましくは２０〜４３ｍＬ程度、通常は３０ｍＬ入れて振盪培養を行なう。

「炭素を含まない培地」における培養工程は、通常は１８〜３３℃程度の温度で、１〜３日程度行なうことが好ましい。温度が１８℃よりも低いと、ＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンの収量が低くなる場合があり、３３℃を超える温度で増殖を行っても同じように収量が低くなる場合がある。また、培養時間が１日よりも短いとＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンの収量が低すぎ、一方、３日以上培養を行っても、それ以上のＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンの生産が認められないので、上記範囲で行うことが好ましい。
「炭素を含まない培地」における培養工程を行う際の温度及び回転数は、容器の大きさ等によって異なるが、例えば、３００ｍＬ〜３Ｌ容の三角フラスコで培養を行う場合には、２７〜３３℃の温度、好ましくは２９〜３１℃の温度で培養容器を１９０〜２２０ｒｐｍ、好ましくは１９５〜２１０ｒｐｍで回転させて行うことが好ましい。また、同じ大きさの三角フラスコで培養を行う場合には、１８〜２２℃の温度、好ましくは１９〜２１℃の温度で、培養容器を１３０〜１７０ｒｐｍ、好ましくは１４０〜１６０ｒｐｍで回転させて行うことが好ましい。上記条件で培養を行うことにより、ＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンを効率よく生産させることが可能となる。

本発明の製造方法は、上記の工程で得られたＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンを菌体から抽出ないし回収する工程、さらに必要に応じて、得られたＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンを精製する工程を含んでいてもよい。微生物菌体内に蓄積したＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンの回収並びに精製は、例えばＢｌｉｇｈら（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９５９年、第３７巻、第９１１−９１７頁）に記載の方法に従って行うことが出来る。

また、本発明によって製造されるＤＨＡ結合型ホスファチジルセリンは、そのまま食品、食品添加物、飼料用添加物、医薬品等として用いることができ、また食品、サプリメント、飼料、医薬品又はこれらの原料に添加して利用してもよい。

本発明について、実施例を示してさらに詳しく説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではなく、当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、以下の実施例では、重量％は単に「％」と記載する。

実施例１
Ｂｙ＋培地（０．１％ペプトン、０．１％酵母エキス、０．５％ブドウ糖、５０％海水、１．０％寒天）を含む寒天平板培地で保存している１２Ｂ株細胞１白金耳（約 1 mg）を５０ｍＬの三角フラスコ中の１０ｍＬのＦ培地（５０％海水、１％ペプトン、１％酵母エキス、８％ブドウ糖を含む）に接種し、３０℃、１５０ｒｐｍで３日間又は６日間培養を行った。
Ｆ培地で培養を行った細胞の細胞収量、全脂質量及び全脂質量に対する脂肪及びリン脂質の含量を測定した。細胞収量、全脂質量及びリン脂質含量は以下のように測定した。

１）細胞重量
細胞を遠心分離により回収し、１％ NaCl で洗浄を行い、次いで凍結乾燥し、重量を測定し、細胞重量とした。
２）全脂質量
１）で得られた乾燥細胞５０ｍｇを用い、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法（EG Bligh and WJ Dyer (1959) A rapid method for total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37:911-917）に従い、全脂質を抽出し、総脂質重量を測定し、乾燥細胞重量あたりの総脂質量を求めた。結果を表１に示す。

３）リン脂質含量
全脂質を１次元薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した。ＴＬＣプレートとしてメルク社のシリカゲルＧ６０を、展開液としてヘキサン−エーテル−酢酸（５０：５０：１、体積比）を用いた。展開後、ＴＬＣプレート全体にプリムリン溶液を噴霧し、紫外線下でスポットを検出し、鉛筆でマークした。このとき、原点にのこるスポット（脂質）は極性の高い脂質であることから、リン脂質（ＰＬ）とみなし、ＴＧ（ＤＨＡをアシル成分とする脂肪を含む）は標準品ＴＧ（トリオレイン：シグマ社製）とのＲｆ値を比べることにより同定した。遊離脂肪酸を含む他のスポットはその他の脂質として一括して扱った。ＰＬ、ＴＧ、その他の脂質の重量比はＴＬＣプレートのおのおののスポットをかき取り、これをメタノールの１０％塩化アセチル溶液を用いて、１００oＣ，１時間のメタノリシス処理を行い、ヘキサンで回収した脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をガスクロマトグラフィ（ＧＣ）により定量することにより表した。なお、メタノリシスする際の内部標準物質として２００μｇのヘンエイコ酸（２１：１と略記）を用いた。脂肪酸の同定は、Z. Perveen, H. Ando, A. Ueno, Y. Ito, Y. Yamamoto, Y. Yamada, T. Takagi, T. Kaneko, K. Kogame,and H. Okuyama (2006) Isolation and characterization of a novel thraustochytrid-like microorganism that efficiently produces docosahexaenoic acid. Biotechnol Lett 28: 197-202及びH. Okuyama, Y. Orikasa, and T. Nishida (2007) In vivo conversion of triacylglycerol to docosahexaenoic acid-containing phospholipids in a thraustochytrid-like microorganism, strain 12B. Biotechnol Lett 29: 1977-1981に従い、ＧＣ−ＭＳによって行った（非特許文献１，２）

全培養液あたりの細胞の乾燥重量は、Ｚ培地へ接種する培養液４ｍＬあたりの重量である。

表１から明らかなように、Ｆ培地で３０℃、１５０ｒｐｍ、３日間培養した時の１２Ｂ株細胞細胞収量、全脂質収量、ＰＬ収量はそれぞれ５６．９ｍｇ、１６．１ｍｇ、１．７ｍｇであった。全脂質当たりのＴＧ、およびＰＬの含量はそれぞれ７０．８％、１０．３％であった。表２にはＦ培地で、同条件で６日間培養した細胞に関する測定結果も記載されているが、Ｆ培地での長時間の培養（６時間培養）は細胞収量、全脂質収量、ＰＬ収量、及び全脂質に対するＴＧとＰＬの含量の顕著な変化はもたらさなかった。

実施例２
実施例１の方法によりＦ培地で３日間培養した培養液４ｍＬを、２５ｍＬのＺ培地（５０％海水、１％ペプトン、１％酵母エキスを含む）を含む３００ｍＬのフラスコに接種し、表２に示す培養条件（温度、振盪速度、培養時間）で培養した。培養後、実施例１と同様に操作を行い、細胞収量、全脂質量及び全脂質量に対する脂肪及びリン脂質の含量を測定した。結果を表２に併せて示す。

表２にはＺ培地での培養を、異なる５種類の条件で行なった時の結果を示している。最も高い細胞収量は、２０oＣ、１５０ｒｐｍ、４日間（合計で７日間の培養）で、３７２．０ｍｇであった。全培養液当たりの全脂質及びＰＬ収量はそれぞれ４０．９ｍｇ、１１．２ｍｇであった。全培養液当たり最も高いＰＬ収量を示したのは、３０oＣ、２００ｒｐｍ、２日間（合計で５日間培養）の場合で、その値は１５．０ｍｇであった。３０oＣ、１５０ｒｐｍ、２日間（合計で５日間）の培養では１１．１ｍｇのＰＬが得られた。３０oＣでの高速振盪（２００ｒｐｍ）と、低温（２０oＣ）での長時間培養が高いＰＬ収量をもたらすことが分かった。特に２０oＣ、１５０ｒｐｍ、７日間（合計で１０日間）培養の場合、全脂質の約８０％がＰＬであったが、細胞収量と（１７８．５ｍｇ）、全脂質収量（１２．１ｍｇ）が低いため、ＰＬの収量は９．９ｍｇであった。

実施例３
実施例１及び２で得られた１２Ｂ株細胞全脂質のリン脂質組成を調べるために、実施例１と同様の操作で１次元ＴＬＣを行なった。展開溶媒は、酢酸メチル−１-プロパノール−クロロフォルム−メタノール−０．２５％水酸化カリウム水溶液（５：５：５：２：１．８、体積比）を用いた。展開後は実施例１に記載の方法に従って操作を行った。Ｄｉｔｔｅｍｅｒ試薬に陽性の脂質をＰＬとし、各脂質クラスの同定は、Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ試薬に陽性の脂質は第４級アミノ脂質（ＰＣ），ニンヒドリン試薬に陽性の脂質はＰＥまたはＰＳとみなし、最終的にＰＬの標準品（シグマ社製）とのＴＬＣ上での移動度を比較することによって各リン脂質クラスを同定した。
定量は、ＴＬＣにより分離した各スポットをかき取り、これに内部標準物質として２００μｇの２１：１を加え、実施例１と同様の操作によりメタノリシスし、ＦＡＭＥを得た。これをＧＣにより分析、定量した。結果を表３及び表４に示す。表中、ＮＤは測定していないことを示す。

また、Ｆ培地で、３０℃、１５０ｒｐｍ、３日間培養後、その一部をＺ培地に接種し、３０℃、１５０ｒｐｍ、４日間培養した細胞由来の全脂質の１次元ＴＬＣの結果を図１に示す。標準ＰＬとしてＰＳとＰＣを用いた。左の図はプリムリン試薬噴霧後、脂質のスポットを紫外線下で観察したものである。右の図はニンヒドリン試薬を噴霧後、ＴＬＣプレートを１２０oＣで加熱し、アミノ脂質を発色させたものである。ニンヒドリン陽性のスポットは原点から順に原点上のスポット、ＰＳ，未同定アミノリン脂質、ＰＥであった。ＰＣと同定したＰＬはＤｉｔｔｍｅｒ試薬、Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ試薬に対して陽性であった。原点上のスポットはＰＳを含むアミノ脂質の分解物に由来するアミノ基を含む物質と考えられる。

次に、全培養液当たりの各脂質クラスの収量、ＤＨＡ含量、及び真核生物としてはその存在が稀な奇数炭素数脂肪酸ペンタデカン酸（１５：０）の含量を実施例１に記載されたＧＣ−ＭＳを用いて測定した。その結果を表２に示す。最もＰＳの収量が高かったＺ培地、３０oＣ，２００ｒｐｍ、２日間培養細胞の場合のＰＳ収量は２．２ｍｇであり、そのＤＨＡおよび１５：０の含量はＰＳ全脂肪酸のそれぞれ５９．９％、１７．９％であった。２．２ｍｇというＰＳの収量はＦ培地で３０oＣ，３日間培養した場合の１１倍であった。Ｚ培地で３０oＣ，２００ｒｐｍ、２日間培養細胞の場合とほぼ同程度のＰＳ収量を示したのはＺ培地、２０oＣ，１５０ｒｐｍ、４日間の時であり、その値は２．１ｍｇであった。この時のＰＳのＤＨＡおよび１５：０の含量はそれぞれ５６．９％、１５．７％であった。一般的に、低温（２０oＣ）での培養の方がより高いＤＨＡ含量を示す傾向が認められた。

表３及び４から以下のことがわかる。Ｆ培地で３０oＣ、１５０ｒｐｍ、３日間培養した時の１２Ｂ株細胞の全ＰＬ重量に占めるＰＣ、ＰＳ、ＰＥ、その他のリン脂質（合計量が１００％であるので、ＰＣ、ＰＳ及びＰＥの量から計算でき、表中には示していない）の割合はそれぞれ５９．９％、１１．９％、１５．６％、１２．６％であった。Ｆ培地で３０oＣ，１５０ｒｐｍ、３日間培養した細胞をＺ培地に接種し、さまざまな条件で培養した際の、各ＰＬクラスの含量は多少変動したが、最もＰＬの収量の高い、Ｚ培地で３０oＣ，２００ｒｐｍ、２日間培養細胞の場合のＰＣ，ＰＳ，ＰＥの割合はそれぞれ６２．８％、１７．４％、１１．２％であり、その他のＰＬ含量は８．６％であった。この培養条件と同様にＰＳの割合が高かったのは、２０oＣ，１５０ｒｐｍ、４日間（全培養時間７日間）の、１７．６％であった。ＰＳの工業的な製造の場合、培養時間はより短く、低温条件維持の高コストを考慮すればＺ培地での３０oＣ，２００ｒｐｍ、２日間の培養条件の方がより望ましいと考えられる。

また、全培養液当たりの各脂質クラスの収量とＤＨＡ含量、および真核生物としてはその存在が稀な奇数炭素数脂肪酸ペンタデカン酸（１５：０）の含量については、最もＰＳの収量が高かったＺ培地、３０oＣ、２００ｒｐｍ、２日間培養細胞の場合のＰＳ収量は２．２ｍｇであり、そのＤＨＡおよび１５：０の含量はＰＳ全脂肪酸のそれぞれ５０．９％、１７．９％であった。２．２ｍｇというＰＳの収量はＦ培地で３０oＣ，３日間培養した場合の１１倍であった。Ｚ培地で３０oＣ，２００ｒｐｍ、２日間培養細胞の場合とほぼ同程度のＰＳ収量を示したのはＺ培地、２０oＣ、１５０ｒｐｍ、４日間の時であり、その値は２．１ｍｇであった。この時のＰＳのＤＨＡおよび１５：０の含量はそれぞれ５６．９％、１５．７％であった。一般的に、低温（２０oＣ）での培養の方がより高いＤＨＡ含量を示す傾向が認められた。

実施例４
Ｆ培地で３０oＣで，１５０ｒｐｍ、３日間培養した１２Ｂ株細胞、Ｆ培地で２０oＣで，１５０ｒｐｍ、６日間培養した細胞、Ｆ培地で３０oＣで，１５０ｒｐｍ、３日間培養した１２Ｂ株細胞をＺ培地に接種した後、３０oＣ，１５０ｒｐｍで２日間と４日間、３０oＣ，２００ｒｐｍで２日間、及び２０oＣ，１５０ｒｐｍで４日間と７日間培養した細胞のサイズを測定した。具体的には、倍率を４０×１０とし、直径を光学顕微鏡下で約１００個の細胞を任意に選択して測定した。結果を表５に示す。

１２Ｂ株細胞は、その生活史において様々な細胞形態をとるが、液体培地で振盪培養を続けている限り１つの球形細胞が多数の同形の細胞へ分裂することを繰り返すことが知られている（Z. Perveen, H. Ando, A. Ueno, Y. Ito, Y. Yamamoto, Y. Yamada, T. Takagi, T. Kaneko, K. Kogame,and H. Okuyama (2006) Isolation and characterization of a novel thraustochytrid-like microorganism that efficiently produces docosahexaenoic acid. Biotechnol Lett 28: 197-202.）。各培養条件で培養した培養液の一部をとり、球形細胞の直径を計測した。表５に示すようにＦ培地を用いた場合は、培養温度に関わらず、細胞の直径は平均で約８μｍであった。これに対し、Ｆ培地で３０oＣ、１５０ｒｐｍ、３日間培養した細胞をＺ培地に接種した場合、培養条件により細胞の直径は大きく変化した。Ｚ培地で３０oＣ、１５０ｒｐｍで培養した場合、培養時間とともに細胞の直径は大きくなり、２日間で８．２μｍ、４日間で約９．６μｍとなった。Ｚ培地で３０oＣ、２００ｒｐｍ、２日間の場合は１０．４μｍであった。一方、Ｚ培地、１５０ｒｐｍ、２０oＣ培養の場合は細胞の直径は小さくなり、４日間、７日間培養でそれぞれ６．１μｍ、６．５μｍであった。

細胞のサイズは細胞１個当たりの表面積（細胞膜の質量、すなわちリン脂質の質量（重量））に大きな影響を与える。表５において示されるように、Ｚ培地において２０oＣで培養した時に細胞が小さくなるのは全脂質に占めるリン脂質の割合が増加する結果（表３）と附合する。一方で、リン脂質収量が最も高いＺ培地、３０oＣ、２００ｒｐｍの条件で培養した時の細胞の直径は最大値（１０．４μｍ）を示した。この場合は、細胞の表面積の増加がリン脂質の収量を増加させた要因ではないと見られる。より多くの細胞中の内膜系、特にミトコンドリアや小胞体などが発達した結果と考えられる。

実施例５
前記実施例において培養を行った１２Ｂ株細胞のうち、Ｆ培地で培養した細胞、Ｚ培地で３０oＣ、１５０ｒｐｍで２日間培養した細胞、Ｚ培地で３０oＣ、２００ｒｐｍで２日間培養した細胞を回収し、その細胞内構造を透過電子顕微鏡（transmission electron microscope; ＴＥＭ）によって観察した。試料を１％グルタールアルデヒド／ 0.1 Ｍ phosphate buffer (ＰＢ)を用いて４℃で一晩固定した。同緩衝液で3回洗浄した後、2% 四酸化オスミム／0.1 Ｍカコジル酸緩衝液を用いて4℃で2時間固定した。試料を同緩衝液で洗浄した後、２％アガロースに包埋し、１mm角程度に切り出した。その後、アルコールシリーズ（50、70、80、95、99.5%、および無水アルコール）で脱水を行った。途中70%エタノールで脱水後、1％酢酸ウラン／70%エタノールでブロック染色を行った。樹脂交換剤としてはメチルグリシンエーテルを用い、Quetol 812で包理した。超薄切片を作製後、4%酢酸ウランと0.4%クエン酸鉛で電子染色を施し、透過電子顕微鏡JEM1200EXS（日本電子）を用い、加速電圧80 kVで観察した。結果を図２に示す。

図２に示すように１２Ｂ株のＴＥＭによる細胞内構造は、培養条件によって著しい変化を示した。Ｆ培地で３０oＣ、１５０ｒｐｍで３日培養した細胞（Ａ）は、細胞内に白く抜けた部分が広範囲に認められ、これは液胞で、その中にやや電子密度が高い円形状構造物が認められ、これは、ＴＧが蓄積しているオイルボディと判断される。Ｆ培地で３０oＣ、１５０ｒｐｍで３日培養した細胞の高いＴＧ含有率から、本来、液胞の中はオイルボディで占有されていると思われる。しかし、全くオイルボディが観察されない液胞もあることから、オイルボディは細胞調製中に失われていると思われる。（Ｂ）はＺ培地で３０oＣ、１５０ｒｐｍで２日培養した細胞であり、オイルボディが占める面積はむしろＦ培地で培養した細胞に比べて目立っている。この細胞の場合は、オイルボディが調製中に失われることは少ないと思われる。Ｆ培地の細胞に比べて、ミトコンドリアの数が増加している。Ｚ培地で３０oＣ、２００ｒｐｍで２日培養した細胞（Ｃ）はほとんど液胞もその中のオイルボディは見られず、細胞内全体の電子密度が高くなっている。これは小型のミトコンドリア数が増加したことと、小胞体の発達によると判断される。ミトコンドリアや小胞体はＰＬを主成分とする生体膜（ミトコンドリアの場合は内外二層の膜）からなる。ブドウ糖を炭素源として添加しなかったＺ培地では、１２Ｂ株をその炭素源を細胞内に蓄積しているＴＧ（オイルボディ）に求め、それをより効率的に炭素源、エネルギー源として利用し、増殖するために多数のミトコンドリアを持ち、小胞体を発達させたものと考えられる。結果的に細胞当たりの生体膜の占める割合が高くなり、ＰＬ含量の増加、特に細胞膜、小胞体膜に高い割合で存在するＰＳの含量が増加したものと考えられる。

Claims

グルコースを含む培地で、ドコサヘキサエン酸生産能を有するラビリンチュラ１２Ｂ株を培養してドコサヘキサエン酸生産能を有するラビリンチュラ１２Ｂ株を増殖させる工程、
及び増殖させた前記微生物を、グルコースを含まない液体培地中で、更に振盪培養する工程を含む、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法であって、
振盪培養が培養容器中で行われ、上記容器の容量と上記液体培地の容量との比率が２０：１〜５：１であり、振盪培養を、(i)２７〜３３℃の温度で、培養容器を１９０〜２２０ｒｐｍ、又は(ii)１８〜２２℃の温度で、培養容器を１３０〜１７０ｒｐｍで回転させて１〜７日間行なう、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法。