JP2012152130A - 微生物発酵によるdha含有ホスファチジルセリンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 炭素源を含む培地でドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物を増殖させる工程、及び増殖させた前記微生物を、炭素源を含まない液体培地中で更に振盪培養する工程を含む、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法であって、
振盪培養が培養容器中で行われ、上記容器の容量と上記液体培地の容量との比率が20:1〜5:1である、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法。
【選択図】 なし
Description
すなわち、本発明は、炭素源を含む培地でドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物を増殖させる工程、及び増殖させた前記微生物を、炭素源を含まない液体培地中で更に振盪培養する工程を含む、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法であって、振盪培養が培養容器中で行われ、上記容器の容量と上記液体培地の容量との比率が20:1〜5:1である、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法である。
ラビリンチュラ類微生物としてはラビリンチュラ12B株が挙げられる。
振盪培養は、27〜33℃の温度で行なうことができる。
また、振盪培養は、18〜22℃の温度で行なうことができる。
「炭素を含まない培地」における培養工程を行う際の温度及び回転数は、容器の大きさ等によって異なるが、例えば、300mL〜3L容の三角フラスコで培養を行う場合には、27〜33℃の温度、好ましくは29〜31℃の温度で培養容器を190〜220rpm、好ましくは195〜210rpmで回転させて行うことが好ましい。また、同じ大きさの三角フラスコで培養を行う場合には、18〜22℃の温度、好ましくは19〜21℃の温度で、培養容器を130〜170rpm、好ましくは140〜160rpmで回転させて行うことが好ましい。上記条件で培養を行うことにより、DHA結合型ホスファチジルセリンを効率よく生産させることが可能となる。
By+培地(0.1%ペプトン、0.1%酵母エキス、0.5%ブドウ糖、50%海水、1.0%寒天)を含む寒天平板培地で保存している12B株細胞1白金耳(約 1 mg)を50mLの三角フラスコ中の10mLのF培地(50%海水、1%ペプトン、1%酵母エキス、8%ブドウ糖を含む)に接種し、30℃、150rpmで3日間又は6日間培養を行った。
F培地で培養を行った細胞の細胞収量、全脂質量及び全脂質量に対する脂肪及びリン脂質の含量を測定した。細胞収量、全脂質量及びリン脂質含量は以下のように測定した。
細胞を遠心分離により回収し、1% NaCl で洗浄を行い、次いで凍結乾燥し、重量を測定し、細胞重量とした。
2)全脂質量
1)で得られた乾燥細胞50mgを用い、Bligh−Dyer法(EG Bligh and WJ Dyer (1959) A rapid method for total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37:911-917)に従い、全脂質を抽出し、総脂質重量を測定し、乾燥細胞重量あたりの総脂質量を求めた。結果を表1に示す。
全脂質を1次元薄層クロマトグラフィー(TLC)に供した。TLCプレートとしてメルク社のシリカゲルG60を、展開液としてヘキサン−エーテル−酢酸(50:50:1、体積比)を用いた。展開後、TLCプレート全体にプリムリン溶液を噴霧し、紫外線下でスポットを検出し、鉛筆でマークした。このとき、原点にのこるスポット(脂質)は極性の高い脂質であることから、リン脂質(PL)とみなし、TG(DHAをアシル成分とする脂肪を含む)は標準品TG(トリオレイン:シグマ社製)とのRf値を比べることにより同定した。遊離脂肪酸を含む他のスポットはその他の脂質として一括して扱った。PL、TG、その他の脂質の重量比はTLCプレートのおのおののスポットをかき取り、これをメタノールの10%塩化アセチル溶液を用いて、100oC,1時間のメタノリシス処理を行い、ヘキサンで回収した脂肪酸メチルエステル(FAME)をガスクロマトグラフィ(GC)により定量することにより表した。なお、メタノリシスする際の内部標準物質として200μgのヘンエイコ酸(21:1と略記)を用いた。脂肪酸の同定は、Z. Perveen, H. Ando, A. Ueno, Y. Ito, Y. Yamamoto, Y. Yamada, T. Takagi, T. Kaneko, K. Kogame, and H. Okuyama (2006) Isolation and characterization of a novel thraustochytrid-like microorganism that efficiently produces docosahexaenoic acid. Biotechnol Lett 28: 197-202及びH. Okuyama, Y. Orikasa, and T. Nishida (2007) In vivo conversion of triacylglycerol to docosahexaenoic acid-containing phospholipids in a thraustochytrid-like microorganism, strain 12B. Biotechnol Lett 29: 1977-1981に従い、GC−MSによって行った(非特許文献1,2)
全培養液あたりの細胞の乾燥重量は、Z培地へ接種する培養液4mLあたりの重量である。
実施例1の方法によりF培地で3日間培養した培養液4mLを、25mLのZ培地(50%海水、1%ペプトン、1%酵母エキスを含む)を含む300mLのフラスコに接種し、表2に示す培養条件(温度、振盪速度、培養時間)で培養した。培養後、実施例1と同様に操作を行い、細胞収量、全脂質量及び全脂質量に対する脂肪及びリン脂質の含量を測定した。結果を表2に併せて示す。
実施例1及び2で得られた12B株細胞全脂質のリン脂質組成を調べるために、実施例1と同様の操作で1次元TLCを行なった。展開溶媒は、酢酸メチル−1-プロパノール−クロロフォルム−メタノール−0.25%水酸化カリウム水溶液(5:5:5:2:1.8、体積比)を用いた。展開後は実施例1に記載の方法に従って操作を行った。Dittemer試薬に陽性の脂質をPLとし、各脂質クラスの同定は、Dragendorff試薬に陽性の脂質は第4級アミノ脂質(PC),ニンヒドリン試薬に陽性の脂質はPEまたはPSとみなし、最終的にPLの標準品(シグマ社製)とのTLC上での移動度を比較することによって各リン脂質クラスを同定した。
定量は、TLCにより分離した各スポットをかき取り、これに内部標準物質として200μgの21:1を加え、実施例1と同様の操作によりメタノリシスし、FAMEを得た。これをGCにより分析、定量した。結果を表3及び表4に示す。表中、NDは測定していないことを示す。
F培地で30oCで,150rpm、3日間培養した12B株細胞、F培地で20oCで,150rpm、6日間培養した細胞、F培地で30oCで,150rpm、3日間培養した12B株細胞をZ培地に接種した後、30oC,150rpmで2日間と4日間、30oC,200rpmで2日間、及び20oC,150rpmで4日間と7日間培養した細胞のサイズを測定した。具体的には、倍率を40×10とし、直径を光学顕微鏡下で約100個の細胞を任意に選択して測定した。結果を表5に示す。
前記実施例において培養を行った12B株細胞のうち、F培地で培養した細胞、Z培地で30oC、150rpmで2日間培養した細胞、Z培地で30oC、200rpmで2日間培養した細胞を回収し、その細胞内構造を透過電子顕微鏡(transmission electron microscope; TEM)によって観察した。試料を1%グルタールアルデヒド/ 0.1 M phosphate buffer (PB)を用いて4℃で一晩固定した。同緩衝液で3回洗浄した後、2% 四酸化オスミム/0.1 Mカコジル酸緩衝液を用いて4℃で2時間固定した。試料を同緩衝液で洗浄した後、2%アガロースに包埋し、1mm角程度に切り出した。その後、アルコールシリーズ(50、70、80、95、99.5%、および無水アルコール)で脱水を行った。途中70%エタノールで脱水後、1%酢酸ウラン/70%エタノールでブロック染色を行った。樹脂交換剤としてはメチルグリシンエーテルを用い、Quetol 812で包理した。超薄切片を作製後、4%酢酸ウランと0.4%クエン酸鉛で電子染色を施し、透過電子顕微鏡JEM1200EXS(日本電子)を用い、加速電圧80 kVで観察した。結果を図2に示す。
Claims (5)
- 炭素源を含む培地でドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物を増殖させる工程、及び増殖させた前記微生物を、炭素源を含まない液体培地中で更に振盪培養する工程を含む、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法であって、
振盪培養が培養容器中で行われ、上記容器の容量と上記液体培地の容量との比率が20:1〜5:1である、ドコサヘキサエン酸結合型ホスファチジルセリンを製造する方法。 - ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物がラビリンチュラ類微生物又はトロウストチトリアレ類微生物である、請求項1記載の製造方法。
- ラビリンチュラ類微生物がラビリンチュラ12B株である、請求項2記載の製造方法。
- 振盪培養を、27〜33℃の温度で行なう、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 振盪培養を、18〜22℃の温度で行なう、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
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