KR20080091858A

KR20080091858A - 긴 사슬 다불포화 지방산을 그의 성분으로서 함유하는 포스포리피드의 미생물 발효-기재 제조

Info

Publication number: KR20080091858A
Application number: KR1020087021960A
Authority: KR
Inventors: 아키코 시라이시; 히로시 가와시마
Original assignee: 산또리 가부시키가이샤
Priority date: 2006-02-10
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2008-10-14
Also published as: US20100216197A1; ATE507301T1; EP1981982A1; EP1981982B1; CA2641595A1; DE602007014183D1; JP2007209272A; WO2007091731A1; AU2007212967A1; DK1981982T3; CN101041838A

Abstract

본 발명은 하기 단계를 포함하는 긴 사슬 다불포화 지방산을 성분으로서 함유하는 포스포리피드(LCPUFA-PL)의 제조 방법에 관한 것이다: (i) 미생물 내에서 LCPUFA-PL 의 세포내 축적을 허용하는 조건 하에 모르티에렐라 에스피.에 속하는 미생물을 배양하는 단계; 및 (ii) 미생물의 배양 생성물로부터 LCPUFA-PL 를 수득하는 단계(여기서 분지 지방산인 이소팔미트산의 조성 비율은 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스포리피드(PL)의 성분으로서 함유된 지방산의 총량에 대해 5 % 이하임). 본 발명은 또한 본 방법 발명에 의해 수득된 포스포리피드에 관한 것이다.

Description

긴 사슬 다불포화 지방산을 그의 성분으로서 함유하는 포스포리피드의 미생물 발효-기재 제조{MICROBIAL FERMENTATION-BASED PRODUCTION OF PHOSPHOLIPIDS CONTAINING LONG-CHAIN POLYUNSATURATED FATTY ACIDS AS THEIR CONSTITUENTS}

본 발명은 긴 사슬 다불포화 지방산을 성분으로서 함유하는 포스포리피드(즉, 긴 사슬 다불포화 지방산-포스포리피드; LCPUFA-PL)의 제조 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 방법은 미생물 내에서 LCPUFA-PL 의 증가된 세포내 축적을 허용하는 조건 하에 모르티에렐라 에스피.(Mortierella sp .)에 속하는 미생물을 배양하고, LCPUFA-PL 를 미생물의 배양 생성물로부터 추출함을 포함한다.

포스포리피드(PL)는 다양한 생리적 기능, 예컨대 뇌 기능 개선 효과, 항-스트레스 효과, 및 콜레스테롤-저하 효과를 갖는 것으로 공지되었다. 몇가지 유형의 PL 이 존재하며, 주로, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜에탄올라민(PE) 및 포스파티딜이노시톨(PI)을 포함한다. 이들 PL 는 상호 상이한 기능 및 물리적 성질을 갖는다.

PL 중에서, C₂₀ 이상의 긴 사슬 다불포화 지방산("LCPUFA" 로 약칭함)을 성분으로서 함유하는 것(설명의 편의를 위해, 상기 포스포리피드를 "LCPUFA-PL" 로 약칭함)은 높은 뇌 기능 개선 효과를 가지며, 따라서 LCPUFA 를 성분으로서 함유하지 않는 포스포리피드(설명의 편의를 위해, "비-LCPUFA-PL"로 약칭함)보다 더 높은 효과를 갖는다(비-특허 문헌 1 참조). LCPUFA 의 구체적인 예는, 예를 들어, 도코사헥사에노산(DHA) 및 아라키돈산(ARA)을 포함한다.

마찬가지로, 비-포스포리피드 유형의 LCPUFA 유도체가 또한 뇌 기능 개선 효과를 갖는 것으로 공지되었다(특허 문헌 1 참조). 그러나, 비-포스포리피드 유형의 LCPUFA 유도체에 있어서, 그의 뇌 기능 개선 효과는, LCPUFA-PL 및 비-LCPUFA-PL 를 포함하는 상기 포스포리피드와는 달리, 대뇌 내 해마에 대한 그의 작용에 의해 매개되는 것으로 보인다.

LCPUFA-PL 가 더 높은 뇌 기능 개선 효과를 갖는 이유는 하기를 포함한다: (1) LCPUFA-PL 는 뇌 내에 실제로 존재하는 구조이고; (2) LCPUFA-PL 는 혈-뇌 장벽을 통과할 수 있고; (3) LCPUFA-PL 는 그의 흡수가 간에 의해 매개되지 않기 때문에 간에서 포획 또는 변형되지 않은 채 표적 조직(예, 뇌)에 도달한다.

각 이유의 상세한 설명이 이하 주어진다. 첫째로, 이유 (1) 에 관해, 뇌 내 LCPUFA 는 우세하게 포스포리피드 형태로 존재하는 것으로 공지되었다. 더욱 구체적으로, LCPUFA 는 주로 화합물 예컨대 상기 PC, PS, PE 또는 PI 로서 존재하며, 뇌 내에서 다양한 기능을 나타낸다. 둘째로, 이유 (2) 에 관해, 표지된 포스포리피드가 경구 섭취되는 경우 뇌 조직 내에서 탐지가능하므로, 포스포리피드가 뇌 조직에 도달하는 것으로 밝혀졌다(비-특허 문헌 2 참조). 또한, 이유 (3) 에 관해, 포스포리피드가 흡수되는 동안, 두 개의 구성 지방산 중 하나가 소화기관 내에서 가수분해되어 리소포스포리피드를 제조한다. 이 리소포스포리피드가 소장에 의해 흡수되고 소장 세포 내에서 포스포리피드 내로 재구성되고, 이것이 그후 림프관을 통해 흡수된다(비-특허 문헌 3 참조). 이런 이유로, LCPUFA-PL 는 간을 통과하지 않은 채 전신에 전달된다.

LCPUFA-PL 는 LCPUFA-PL 이 풍부한 물질, 예컨대 동물 기관 및 알로부터의 제조 또는 정제를 통해 종래에 제조되어 왔다. 구체적 예는 소 뇌로부터의 제조 및 돼지 간 또는 생선 알로부터의 포스포리피드 분획의 정제를 포함한다(특허 문헌 2 및 3 참조). 특정 종류의 해양 박테리아가 LCPUFA-PL 를 생산하고(비-특허 문헌 4 참조), 아라키돈산의 생산 능력이 있는 사상 진균이 아라키돈산-함유 포스포리피드를 그의 세포 내에 함유함이 또한 공지되었다(비-특허 문헌 5 참조).

포스포리피드의 산업적 제조를 위한 현재 기술에 있어서, 포스포리피드는 통상 원천 물질로부터 추출될 때 트리글리세리드가 풍부한 지방과 함께 추출된다. 추출에 이용되는 용매는 헥산을 포함한다. 추출된 지방은 고무성 물질을 함유하며, 이는 지방의 변색 및 거품화를 야기한다. 따라서, 상기 고무성 물질은 고무제거 단계에서 제거되어야 한다; 그러나 거의 모든 포스포리피드가 이 단계에서 고무성 물질로 전이된다. 포스포리피드는 그러므로 고무성 물질을 정제함으로써 제조된다.

그러나, 상기 종래의 기술에 의해 제조된 LCPUFA-PL 는 안정된 공급을 달성하지도 않고 신뢰할만한 품질을 항상 보증하지도 않는다. 더욱 구체적으로, 현재 입수가능한 LCPUFA-PL 는 일반적으로 동물 기관, 알 노른자 및 생선 알을 포함 하는 상기 물질로부터 유래된다. 이들 동물 및 식물 오일-유래 원천은 문제 예컨대 그의 공급 및 LCPUFA 함량의 날씨-유도 변이 뿐만 아니라 환경 오염에 의해 야기된 영향과 연관된다. 더욱이, 광우병 유행의 결과 소 뇌를 포함한 동물 기관의 이용과 관련하여 큰 어려움이 존재한다. 이들 이유로, 종래의 기술은 LCPUFA-PL 의 효과적이고 안정된 제조를 보증하기 곤란하다는 문제에 처했다.

미생물 기술을 이용하는 경우에, 해양 박테리아로부터 유래된 LCPUFA-PL 는 영양 조성으로서 적절하지 않은데, 이는 그의 주요 성분으로서 인간 및 다른 동물에서 발견하기 힘든, 박테리아 특유의 분지 지방산을 함유하기 때문이다.

반면, 아라키돈산을 생산하는 사상 진균의 구성원인 코니디오볼루스 에스피.(Conidiobolus sp .)를 이용하는 LCPUFA-PL 제조가 제안되나(특허 문헌 4 참조), 이 균주는 다량은 분지 지방산 예컨대 이소미리스트산(iso14:0) 및 이소팔미트산(iso16:0)을 함유하는 것으로 보고되었다(비-특허 문헌 6 및 7 참조). 더욱이, 어떤 진균은 엔토모프토랄(entomophthorale)(엔토프모프토로시스로 불림, 진균증의 종류, 먼저 비강내 점막에서 발달한 후 인두, 비강내 기도 및 얼굴 전체에 확장됨) 특유의 진균증을 야기할 수 있으며, 다른 진균은 건강한 사람(생물안전 등급 2)에게 감염을 야기하는 능력을 갖는다(비-특허 문헌 8 및 9 참조). 게다가, 상기 진균은 곤충 및 다른 소형 동물 상에 기생할 수 있고(참조 비-특허 문헌 10) 따라서 인간 및 환경에 대한 그의 해로운 효과의 면에서 산업적으로 이용되는 미생물로서는 적절하지 않다.

마찬가지로, 아라키돈산-함유 트리글리세리드의 산업적 제조에 현재 이용되 는 모르티에렐라 에스피.에 있어서, 아라키돈산 제조를 위한 다양한 조건을 검토하기 위해 활발한 노력이 있어 왔다. 무엇보다, 다양한 광물 염의 첨가 및/또는 배지 pH 및 배양 온도를 포함한 조건이 아라키돈산의 생산성을 개선하는 것으로 보고되었다. 더욱 구체적으로, 다양한 광물 염의 첨가가 미생물 세포 내에 축적되는 LCPUFA-함유 트리글리세리드 및 LCPUFA-PL 둘다의 생산성에 대해 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다(비-특허 문헌 11). 개시 pH 에 관하여, (1) 배양에 최적인 개시 pH 는 6.0 내지 6.6 이고(비-특허 문헌 11), (2) 배양 후기 단계에서 pH 를 상승시키는 경우 아라키돈산-함유 트리글리세리드의 수율이 증가됨이 공지되었다(특허 문헌 5). 그러나, 포스포리피드 분획에 최적인 정보가 없다. 또한, 배양 온도에 관해, 저온에서 5 일 이상 동안 배양함으로써 포스포리피드 내 LCPUFA 함량이 증가됨이 공지되었다(비-특허 문헌 12). 그러나, 저온에서의 상기 장기 배양은 비용의 관점에서 산업적 제조에 적절하지 않고, 상기 조건들은 모두 트리글리세리드의 성분으로서 존재하는 LCPUFA 의 제조에 초첨을 맞춘다. 이처럼, LCPUFA-PL 제조에 특이적인 배양 조건은 현 상황에서 아직 연구되지 않았다. 이들 배양 기술에 의해 제조된 미생물 세포 내에서, LCPUFA-PL 가 상당량의 트리글리세리드 내로 혼합된 소량의 성분으로서 탐지되며, 그의 함량은 매우 낮다(11.7 mg/건조 세포의 g; 비-특허 문헌 5 참조). 더욱이, LCPUFA-PL 가 트리글리세리드 제조의 부산물이므로, 그의 품질 및 공급이 안정화되지 않는다. 따라서, LCPUFA-PL 의 충분한 이용에 대한 기대가 없다.

상기의 관점에서, 식품 및 동물 사료에 더욱 안전하고 더욱 안정되게 이용될 수 있는 LCPUFA-PL-함유 지방의 개발에 대한 요구가 있어 왔다.

[특허 문헌 1] JP 2003-48831 A (2003 년 2월 21 일에 공고됨)

[특허 문헌 2] JP 11-35587 A (1999 년 2 월 9 일에 공고됨)

[특허 문헌 3] JP 8-59678 A (1996 년 3 월 5 일에 공고됨)

[특허 문헌 4] JP 6-2068 B (1994 년 1 월 12 일에 공고됨)

[특허 문헌 5] 일본 특허 국내 공표 No. 10-512444 (1998 년 12 월 2 일에 공고됨)

[비-특허 문헌 1] A. Bruni, et al., Nature, Vol. 260, p331-333 (1976)

[비-특허 문헌 2] G. Toffano, et al. Clinical Trials Journal, Vol. 24, pl8-24 (1987)

[비-특허 문헌 3] Katsumi Imaizumi, Rinsyo-Eiyo (Clinical Nutrition), Vol. 67, p119 (1985)

[비-특허 문헌 4] Kazuyoshi Yazawa, et al., Yukagaku (Oil Science), Vol. 44, p787-793 (1995)

[비-특허 문헌 5] S. Shimizu, et al., JAOCS, Vol. 68, No. 4, p254-258 (1991)

[비-특허 문헌 6] D. Tyrrell, Can. J. Microbiol., Vol. 17, p1115-1118 (1971)

[비-특허 문헌 7] D. Tyrrell, et al., Can. J. Microbiol., Vol. 22, p1058-1060 (1976)

[비-특허 문헌 8] G. S. de Hoog, et al. , ATLAS OF CLINICAL FUNGI, 2nd edition, p.118-123

[비-특허 문헌 9] Japanese Society for Bacteriology, Biosafety Guideline for Pathogenic Bacteria, revised 2nd edition, p7 (2002)

[비-특허 문헌 10] Takeharu Hasegawa, et al., Classification and Identification of Microorganisms, pl9-20, University of Tokyo Press (1975)

[비-특허 문헌 11] K. Higashiyama, et al., JAOCS, Vol. 75, p1501-1505 (1998)

[비-특허 문헌 12] S. Jareonkitmongkol, et al., Arch. Microbiol., Vol. 161, p316-319 (1994)

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명의 목적은 식품 및 동물 사료에서의 안전한 이용을 위한 신뢰할 만한 품질의 LCPUFA-PL 의 효율적이고 안정된 공급을 가능케 하는 기술을 제공하는 것이다. 이 기술은 긴 사슬 다불포화 지방산을 성분으로서 함유하고, 분지 지방산의 함량이 낮은 포스포리피드(LCPUFA-PL)를 높은 함량으로 축적하는 미생물의 배양 생성물을 수득함으로써 달성된다.

과제를 해결하기 위한 수단

상기 문제를 극복하기 위해, 본 발명의 발명자들은 분지 지방산 함량이 낮은 LCPUFA-PL 의 효율적 제조 방법을 개발하기 위해 노력해 왔다. 결과로서, 본 발명자들은 모르티에렐라 에스피.가 이 목적을 위해 긴 사슬 다불포화 지방산(LCPUFA)-함유 지질을 생산하는 지질-생산 미생물로서 바람직하다는 것을 밝혔다.

더욱이, LCPUFA-PL 가 생체막의 성분이기 때문에 그의 세포내 합성에 대해 엄격히 제어됨이 예견됨에도 불구하고, 본 발명자들은 세포 당 LCPUFA-PL 의 양이 현저히 증가될 수 있는 조건을 발견했고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 LCPUFA 를 성분으로서 함유하고, 분지 지방산의 함량이 낮은 포스포리피드(LCPUFA-PL)의 제조 방법을 제공하며, 여기서 상기 지질-생산 미생물은 그의 세포 내에서 LCPUFA-PL 의 증가된 축적을 보증하도록 배양된다. 상기 방법은 또한, 상기 지질-생산 미생물의 배양 단계 후에, LCPUFA-PL 의 공급 원천으로서의 이용을 위해 입수가능한 건조 세포를 수득하는 단계, 및 LCPUFA-PL-함유 지방이 그 세포로부터 추출되는 지방 추출 단계를 포함한다.

이처럼, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함하는 LCPUFA-PL 의 제조 방법이다:

(i) 미생물 내에서 LCPUFA-PL 의 세포내 축적을 허용하는 조건 하에 모르티에렐라 에스피.에 속하는 미생물을 배양하는 단계; 및

(ii) 미생물로의 배양 생성물로부터 LCPUFA-PL 를 수득하는 단계로서, 여기서 분지 지방산인 이소팔미트산의 조성 비율은 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스포리피드(PL)의 성분으로서 함유된 지방산의 총량에 대해 5% 이하임.

대안적으로, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함하는 LCPUFA-PL 의 제조 방법이다:

(i) 미생물 내에서 LCPUFA-PL 의 세포내 축적을 허용하는 조건 하에 모르티에렐라 에스피.에 속하는 미생물을 배양하는 단계;

(ii) 미생물의 배양 생성물로부터 지질 성분을 총 지질 분획으로서 추출한 후, 트리글리세리드 및 포스포리피드 분획으로 분별하는 단계; 및

(iii) 포스포리피드 분획으로부터 LCPUFA-PL 를 수득하는 단계로서, 여기서 분지 지방산인 이소팔미트산의 조성 비율은 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스포리피드(PL)의 성분으로서 함유된 지방산의 총량에 대해 5% 이하임.

본 방법 발명에 이용된 미생물

본 방법 발명에 이용된 미생물은 그것이 모르티에렐라 에스피.에 속하고 LCPUFA-PL 를 생산하는 능력이 있는 한 어떤 식으로도 제한되지 않는다. 본 방법 발명에 이용된 모르티에렐라 에스피.의 미생물은 바람직하게는 모르티에렐라 아속(Mortierella subgenera)의 그것이다. 모르티에렐라 아속의 미생물은 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina), 모르티에렐라 폴리세팔라(Mortierella polycephala), 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua), 모르티에렐라 히그로필라(Mortierella hygrophila) 및 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata)를 포함한다. 본 방법 발명에 이용된 모르티에렐라 에스피.의 더욱 바람직한 미생물은 모르티에렐라 알피나이다.

모르티에렐라 에스피.에 속하는 미생물과 관련하여, 아라키돈산(ARA)을 그의 성분 LCPUFA 로서 함유하는 LCPUFA-PL("ARA-PL"로 약칭함)를 생산하는 능력을 갖는 것으로 공지된 많은 종 및 균주가 있다. ARA-PL 를 생산하는 능력을 갖는 모르티에렐라 에스피.로부터 선택되는 경우, 모르티에렐라 에스피.의 미생물은 바람직하게는 모르티에렐라 아속이다. 모르티에렐라 아속의 미생물은 모르티에렐라 알피나, 모르티에렐라 폴리세팔라, 모르티에렐라 엑시구아, 모르티에렐라 히그로필라, 및 모르티에렐라 엘롱가타를 포함한다.

ARA-PL 를 생산하는 능력을 갖는 모르티에렐라 아속의 미생물의 더욱 구체적인 균주는, 예를 들어, 모르티에렐라 폴리세팔라(M. 폴리세팔라) IFO6335, 모르티에렐라 엘롱가타(M. 엘롱가타) CBS125.71, 모르티에렐라 엑시구아(M. 엑시구아) IFO8571, 모르티에렐라 벨자코바에(Mortierella beljakovae)(M. 벨자코바에) CBS601.68, 모르티에렐라 슈무케리(Mortierella schmuckeri)(M. 슈무케리) NRRL2761, 모르티에렐라 히그로필라(M. 히그로필라) IFO5941 뿐만 아니라, 모르티에렐라 알피나(M. 알피나) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70 및 CBS754.68 을 포함한다. 이들 균주는 모두 Institute for Fermentation, Osaka(IFO), American Type Culture Collection(ATCC) 및 Centrralbureau voor Schimmelcultures(CBS)로부터 어떠한 제한도 없이 입수가능하다. 또한, ARA-PL 를 생산하는 능력을 갖는 모르티에렐라 아속의 다른 균주는, 본 발명의 발명자를 포함하는 연구 집단에 의해 토양으로부터 단리된 균주인, 모르티에렐라 엘롱가타(M. 엘롱가타) SAM0219(FERM P-8703, FERM BP-1239)를 포함한다.

마찬가지로, 디호모-γ-리놀렌산(DGLA)을 그의 성분 LCPUFA 로서 함유하는 LCPUFA-PL("DGLA-PL"로 약칭함)를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 더욱 구체적인 균주는, 본 발명의 발명자를 포함하는 연구 집단에 의해 토양으로부터 단리된 균주인, 모르티에렐라 엘롱가타(M. 엘롱가타) SAM1860(FERM BP-3589)을 포함한다.

또한, 미드산(Mead acid)을 그의 성분 LCPUFA 로서 함유하는 LCPUFA-PL("미드산-PL"로 약칭함)를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 더욱 구체적인 균주는, 본 발명의 발명자를 포함하는 연구 집단에 의해 토양으로부터 단리된 균주인, 모르티에렐라 알피나(M. 알피나) SAM2086(FERM P-15766)를 포함한다.

본 방법 발명에 이용된 모르티에렐라 에스피.에 속하는 미생물의 이들 균주는 제조되는 LCPUFA 의 유형에 따라, 단독 또는 조합으로의 이용을 위해 선택될 수 있다.

이 명세서 내에서, 본 방법 발명에 이용된 미생물은 또한 "지질-생산 미생물"로 및 간단히 "진균"으로 언급될 수 있다. 이들 용어는 본원에서 동의어이다.

본 방법 발명에 있어서 미생물의 배양 단계

본 방법 발명에 이용된 미생물의 배양 조건은 어떤 식으로도 제한되지 않고, 배양되는 균주의 유형에 따라 적절히 결정될 수 있다.

본 발명에 이용된 상기 균주를 포함한 미생물을 배양하기 위해, 포자, 균사 또는 각 균주의 예비-배양된 용액이/들이 액체 배지 내로 또는 고체 배지 상으로 접종된 후 배양된다. 액체 배지의 경우, 임의의 통상 이용되는 탄소 원천이 이용될 수 있고, 글루코오스, 프룩토오스, 크실로오스, 사카로오스, 말토오스, 가용성 전분, 당밀, 글리세롤 및 만니톨을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 질소 원천으로서, 천연 질소 원천 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 고기 추출물, 카사미노산, 옥수수 침지수(steep liquor), 대두 단백질, 탈지 대두 가루 또는 면실 가루 뿐만 아니라, 유기 질소 원천 예컨대 우레아 및 무기 질소 원천 예컨대 소듐 니트레이트, 암모늄 니트레이트 또는 암모늄 설페이트를 이용하는 것이 가능하다. 특히 바람직한 것은 대두-유래 질소 원천으로서, 대두, 탈지 대두 가루, 대두 플레이크, 식용 대두 단백질, 대두 섬유, 두유, 대두 분말 등으로 구체적으로 예시된다. 마찬가지로, 열 변성된 탈지 대두 가루, 및 더욱 바람직하게는 약 70 ℃ 내지 90 ℃ 에서 열 처리되고 추가로 에탄올-가용성 성분을 제거하도록 처리된 것이, 단독으로 또는 조합으로, 또는 상기 임의의 질소 원천과의 조합으로 이용될 수 있다. 실용적 목적을 위해, 일반적으로, 첨가되는 탄소 원천의 총량은 바람직하게는 0.1 중량% 내지 40 중량% 의 범위 내, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 25 중량% 의 범위 내이다. 마찬가지로, 첨가되는 질소 원천의 총량은 바람직하게는 0.01 중량% 내지 10 중량% 의 범위 내, 더욱 바람직하게는 0.1 중량% 내지 10 중량% 의 범위 내이다. 또한, 유가(fed-batch) 배지의 경우, 첨가되는 탄소 원천의 개시량이 1 중량% 내지 5 중량% 의 범위 내로 설정되는 한편, 첨가되는 질소 원천의 개시량은 0.1 중량% 내지 6 중량% 의 범위 내로 설정되는 것이 바람직하다. 배양되는 동안 첨가되는 배지 성분은 탄소 및 질소 원천 둘다로 이루어질 수 있는 한편, 오직 탄소 원천만을 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 탄소 및 질소 원천 이외의 성분들도 또한 어떤 식으로도 제한되지 않으며, 필요한 경우, 공지된 미량 영양소 원천 등이 적절히 선택되고 첨가될 수 있다. 미량 영양소 원천의 예는 포스페이트 이온, 알칼리 금속 또는 알칼린 토금속 이온 예컨대 칼슘 이온, 소듐 이온, 및 마그네슘 이온; VIIB 내지 VIII 족 금속 이온 예컨대 철, 니켈, 코발트 및 망간; IB 내지 IIB 족 금속 이온 예컨대 구리 및 아연; 뿐만 아니라 다양한 비타민을 포함한다. 액체 배지 내의 각 성분의 함량(첨가 비율)은 어떤 식으로도 제한되지 않으며, 그것이 본 방법 발명에 이용된 미생물의 성장이 방해되지 않는 농도인 한 공지된 범위 내로 설정될 수 있다.

특히 포스포리피드의 생산성의 면에서, 포스페이트 염을 첨가하는 것이 바람직하다. 첨가되는 포스페이트 염의 예는 포타슘 모노히드로젠 포스페이트, 포타슘 디히드로젠 포스페이트, 소듐 모노히드로젠 포스페이트, 및 소듐 디히드로젠 포스페이트를 포함한다. 첨가되는 포스페이트 염의 농도는 그것이 본 방법 발명에 이용된 미생물의 성장이 방해되지 않는 농도인 한 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 바람직하게는 3.7 mM 내지 147 mM 의 범위 내, 더욱 바람직하게는 3.7 mM 내지 44 mM 의 범위 내, 및 특히 바람직하게는 22 mM 내지 44 mM 의 범위 내이다. 이는 지질-생산 미생물 세포 내의 포스포리피드 함량의 증가를 가능케 한다.

배양 용액의 pH 는 그것이 본 방법 발명에 이용된 미생물의 성장이 방해되지 않는 범위 내인 한 어떤 식으로도 제한되지 않는다. 예를 들어, 개시 pH 는 pH 4 내지 pH 10 의 범위, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 6 의 약산성 범위 내일 수 있고, 더욱 바람직하게는 pH 4 내지 pH 5 로 조정된다. 배양되는 동안의 pH 는 제어되거나 제어되지 않을 수 있다. 본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 배양되는 동안의 pH 가 제어된다. 본 발명에 이용된 모르티에렐라 에스피.가 액체 배지 내에서 배양되는 경우, 배양의 후기 단계에서, 특히 탄소 원천의 고갈 후 배양 용액의 pH 가 상승한다. 배양의 개시부터 배양 전 기간에 걸쳐 pH 가 pH 4 내지 pH 6 의 낮은 범위, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 5.5 의 범위에서 유지되도록 배양이 제어되고 상기 pH 의 상승이 방지되는 경우, 세포 내에 축적되는 포스포리피드의 양이 개선됨으로써 세포 당 LCPUFA-PL 의 양을 증가시킬 수 있다.

배양 온도는 그것이 본 방법 발명에 이용된 미생물의 성장이 방해되지 않는 온도인 한 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 통상 5 ℃ 내지 4O ℃ 의 범위 내, 및 더욱 바람직하게는 20 ℃ 내지 3O ℃ 의 범위 내일 수 있다. 배양 기간이 또한 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 통상 2 내지 20 일의 범위 내일 수 있다. 산업적 목적을 위해, 배양 기간은 바람직하게는 3 내지 10 일의 범위 내, 및 더욱 바람직하게는 3 내지 6 일의 범위 내이다.

바람직한 구현예에 있어서, 본 방법 발명의 배양 온도 및 배양 기간은 하기와 같이 제어된다. 첫째로, 보통의 사상 진균에 대한 최적 성장 온도인 약 28 ℃ 의 비교적 높은 온도 범위 내에서, 2 내지 20 일, 바람직하게는 3 내지 10 일, 더욱 바람직하게는 3 내지 6 일, 더욱더 바람직하게는 2 내지 4 일, 및 가장 바람직하게는 4 일 동안 배양이 수행되어 미생물 세포를 성장시킨다. 그 세포들을 그후 개시 배양 온도보다 저온ㅊ 범위에서 배양함으로써 생산된 불포화 지방산 내 다불포화 지방산(PUFA)의 백분율이 증가되도록 한다. 이 경우에 이용되는 더 저온 범위는 바람직하게는 10 ℃ 내지 25 ℃, 더욱 바람직하게는 15 ℃ 내지 25 ℃, 및 실용적 적용에 있어서 특히 바람직하게는 2O ℃ 내지 25 ℃ 이다. 상기 저온 배양의 기간은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 바람직하게는 4 시간 내지 18 시간의 범위 내, 및 더욱 바람직하게는 12 시간 내지 18 시간의 범위 내이다. 상기 단-기간 온도 제어는 비용 절감 및 수득된 포스포리피드 내 LCPUFA 의 백분율의 증가를 가능케 한다.

배양되는 동안 임의의 외부 처리가 배지 상에 수행될 수 있고, 임의의 공지 배양 기술, 예컨대 통기-교반 배양, 진탕 배양 또는 정적 배양이 적절히 선택될 수 있다. 특히 통기-교반 배양에 있어서, 배양 용액의 유동성이 교반에 의해 증가되는 경우 LCPUFA-PL 의 생산성이 개선될 수 있다. 이 경우, 요구 최대 교반력 KLA (= (P/V)^0.95·Vs^0.67) 은 8.0 이상, 바람직하게는 8.3 이상이다.

상기 배양 조건들, 즉, 교반력 뿐만 아니라 개시 pH, 배양되는 동안의 pH 제어, 배지에 첨가되는 포스페이트 염의 농도, 배양 온도 및 기간을 포함하는 조건들이, 단독으로 또는 조합으로 이용되어 표적 LCPUFA-PL 의 증가된 세포내 축적을 달성할 수 있다.

본 방법 발명에 있어서, LCPUFA 를 포함한 불포화 지방산의 수율을 증가시키기 위해, 불포화 지방산의 전구체 및/또는 기질이 배지에 첨가될 수 있다. 불포화 지방산의 전구체 및/또는 기질의 구체적인 예는, 히드로카본(예, 헥사데칸, 옥타데칸); 지방산(예, 올레산, 리놀산, 도코사헥사에노산) 또는 그의 염; 지방산 에스테르(예, 에틸 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르); 및 오일(예, 올리브 오일, 대두 오일, 평지씨 오일, 면씨 오일, 코코넛 오일, 생선 오일)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이들 물질은 단독으로 또는 조합으로 적절히 이용될 수 있다. 불포화 지방산의 상기 전구체 및/또는 기질은 임의의 양으로 첨가될 수 있으나, 통상 배지의 총 중량에 대해 0.001 % 내지 10 % 의 범위에서, 및 바람직하게는 0.5 % 내지 10 % 의 범위에서 첨가될 수 있다. 대안적으로, 이들 전구체 및/또는 기질은 지질-생산 미생물을 배양하기 위한 단일 탄소 원천으로서 이용될 수 있다. 이런 식으로, 적절한 기질이 배지에 첨가되는 경우, 표적 지방산이 포스포리피드 내로 효율적으로 함입될 수 있다.

본 방법 발명에 있어서 LCPUFA - PL 의 추출 및 정제 단계

이렇게 준비된 배양 생성물로부터 LCPUFA-PL 를 수득하기 위해, 본 발명의 방법은 포스포리피드(PL) 추출 단계를 핵심 단계로서 갖는다. 이 PL 추출 단계에 있어서, 미생물 세포로부터 PL 의 추출을 위해 임의의 기술이 이용될 수 있으나, 추출 배지에 의해 추출을 수행하는 것이 바람직하다.

본 방법 발명에 있어서, LCPUFA-PL 추출에 이용되는 배양 생성물은 상기와 같이 수득된 배양 용액일 수 있고, 이는 직접 이용되거나 추가로 멸균될 수 있다. 대안적으로, 배양 생성물은 그의 배양 용액으로부터의 수집 후 직접 이용되거나(즉, 생 세포로서 이용되거나), 추가로 멸균될 수 있는 배양 세포일 수 있다. 상기 배양 용액은 배양되는 동안 또는 배양의 완료후 즉시 수득될 수 있다. 수집된 세포는 직접 펠렛 형태로 이용되거나 판, 섬유, 낱알 또는 분말과 같은 임의의 형태로 형상화될 수 있다. 세포 수집에 임의의 기술이 이용될 수 있음에도 불구하고, 배양되는 세포의 부피가 작은 경우 표준 원심 분리기를 이용한 원심분리가 수행될 수 있다. 배양되는 세포의 부피가 큰 경우, 바람직하게는 연속 원심분리에 의해 분리되고, 이는 추가로 막 등을 통한 여과와 조합될 수 있다. 대안적으로, 수집된 세포는 습윤 상태로 직접 이용될 수 있거나, 이들 습윤 세포를 건조시킴으로써 건조 세포로서 이용될 수도 있다. 특히 본 발명에 있어서, 건조 세포가 이용에 바람직하다. 이는 지방의 효율적 추출을 가능케 한다. 습윤 세포를 건조시키는 데 임의의 기술이 이용될 수 있고, 공지의 건조 처리법 예컨대 공기-건조, 열 처리, 진공 처리 또는 동결건조로 예시될 수 있다.

추출 배지에 의한 상기 추출에 있어서, 이용되는 추출 배지는 어떤 식으로도 제한되지 않고, 초임계 이산화 탄소 기체 뿐만 아니라 적어도 지방족 유기 용매 및 물로부터 선택되는 임의의 추출 용액을 일반적으로 포함한다. 이들 추출 용액 중에서, 지방족 유기 용매의 구체적인 예는 포화 히드로카본 예컨대 헥산 및 페트롤륨 에테르; 케톤 예컨대 아세톤; 알코올 예컨대 메탄올 및 에탄올; 에스테르 예컨대 에틸아세테이트; 할로겐화 히드로카본 예컨대 클로로포름; 시아니드화 히드로카본 예컨대 아세토니트릴; 및 에테르 예컨대 디에틸에테르를 포함한다. 이들 추출 용액은 단독으로 또는 조합으로 적절히 이용될 수 있다. 이들 추출 용액 중에서, 포스포리피드의 효율적 추출에 바람직한 지방족 유기 용매는 포화 히드로카본, 알코올, 포화 히드로카본 및 알코올의 혼합 용매, 또는 할로겐화 히드로카본 및 알코올의 혼합 용매이다. 헥산을 포화 히드로카본으로서 이용하고, 에탄올을 알코올로서 이용하고, 헥산/에탄올 혼합 용매를 포화 히드로카본 및 알코올의 혼합 용매로서 이용하고, 클로로포름/메탄올 혼합 용매를 할로겐화 히드로카본 및 알코올의 혼합 용매로서 이용하는 것이 바람직하다. 이들 유기 용매 중에서, 헥산 및/또는 에탄올이/들이 특히 식품에서의 이용에 바람직하다. 헥산/에탄올 혼합 용매 또는 에탄올이 이용되는 경우, 소량의 물이 이 용매에 첨가될 수 있음에 유의해야 한다.

추출 배지에 의한 상기 추출 처리는 배치 방식으로 또는 연속 방식으로 달성될 수 있다. 마찬가지로, 추출 배지에 의한 추출은 임의의 조건 하에, 즉, 추출되는 PL 의 유형 및 미생물 세포의 양(부피 또는 중량)에 따라, 적절한 온도에서, 적절한 양의 추출 배지를 이용하여 적절한 기간 동안 수행될 수 있다. 추출하는 동안에, 세포들은 바람직하게는 추출 배지 내에 분산된 후 온화하게 교반된다. 이는 효율적 추출을 가능케 한다.

본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 는 높은 농도의 LCPUFA 를 함유하는 액체 지방(예, 트리글리세리드) 내에 용해된 조성물로서 추출될 수 있다. 높은 농도의 LCPUFA 를 함유하는 상기 액체 지방(예, 트리글리세리드)의 예는 트리글리세리드, 디글리세리드, 모노글리세리드, 지방산 및 지방산 알코올 에스테르를 포함한다. 높은 농도의 LCPUFA 를 함유하는 상기 액체 지방(예, 트리글리세리드)의 성분으로서의 LCPUFA 는, 그것이 이중 결합을 지닌 불포화 구조를 갖는 C₂₀ 이상의 지방산인 한 어떤 식으로도 제한되지 않는다. 본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 는 또한 지용성 물질 예컨대 스테롤, 스테롤 에스테르, 글리코리피드, 스핑고리피드, 왁스, 색소, 카로티노이드, 토코페롤 등을 함유하는 조성물로서 추출될 수 있다.

임의의 기술이 PL 정제 단계에서 이용될 수 있다, 즉, 상기 PL 추출 단계에서 수득된 미정제 PL 를 정제하는 데 이용될 수 있다. 박층 크로마토그래피(TLC), 칼럼 크로마토그래피 및 용매 분획법(예, 아세톤 분획법)을 포함한 공지의 정제 기술을 이용하는 것이 가능하다. 임의의 운반체가 이용에 바람직한 공지된 것과 함께 크로마토그래피에 이용될 수 있다. 마찬가지로, 임의의 용매가 이용에 바람직한 공지된 것과 함께 용매 분획법에 이용될 수 있다.

본 방법 발명에 의해 제조된 지질

본 방법 발명에 의해 제조된 포스포리피드는 긴 사슬 다불포화 지방산(LCPUFA)을 성분으로서 함유한다. 본원에 이용된 LCPUFA 는 이중 결합을 지닌 불포화 구조를 갖는 C₂₀ 이상의 지방산을 언급한다.

본 방법 발명에 의해 수득된 건조 미생물 세포 내에 함유된 포스포리피드는 그것이 LCPUFA 를 성분으로서 함유하는 한(즉, LCPUFA-PL) 어떤 식으로도 제한되지 않는다. 모든 공지된 포스포리피드가 포함될 수 있고, 예컨대 글리세로포스포리피드, 스핑고포스포리피드 및 리소포스포리피드이다. 구체적인 예는 글리세로포스포리피드로는 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜에탄올라민(PE), 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티딜글리세롤(PG), 카르디올리핀(CL) 등; 스핑고포스포리피드로는 스핑고미엘린(SP) 등; 및 리소포스포리피드로는 리소포스파티딜콜린(LPC), 리소포스파티딜세린(LPS), 리소포스파티딜에탄올라민(LPE), 리소포스파티딜이노시톨(LPI), 리소포스파티딜글리세롤(LPG), 포스파티드산 등을 포함한다. 이들 포스포리피드 중에서, PC, PS, PE, PI, 포스파티드산 및 CL 이 바람직하다.

본 방법 발명에 의해 제조된 포스포리피드 내에 성분으로서 함유된 LCPUFA 는 그것이 이중 결합을 지닌 불포화 구조를 갖는 C₂₀ 이상의 지방산인 한 어떤 식으로도 제한되지 않는다. 바람직한 것은 오메가-9(ω9) 다불포화 지방산, 오메가-6(ω6) 다불포화 지방산 및 오메가-3(ω3) 다불포화 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 LCPUFA 이다. 본원에 이용된, ω9, ω6 및 ω3 은 각 불포화 지방산 내 이중 결합의 위치에 상응하는 시리즈를 각각 의미한다. 더욱 구체적으로, ω9, ω6 및 ω3 은 지방산의 카르복실기 반대쪽 탄소로부터 시작하여 탄소를 번호매길 때 9-, 6- 및 3-위치에서 각각 이중 결합을 지닌 불포화 지방산의 시리즈를 의미한다. LCPUFA 의 구체적인 예는 ω9 다불포화 지방산에 있어서 5,8,11-에이코사트리에노산(미드산; 20:3, ω9), 7,10,13-도코사트리에노산(22:3, ω9), 및 4,7,10,13-도코사테트라에노산(22:4, ω9)을 포함한다. 마찬가지로, ω6 다불포화 지방산에 있어서, 구체적인 예는 11,14-에이코사디에노산(20:2, ω6), 8,11,14-에이코사트리에노산(디호모-γ-리놀렌산; 20:3, ω6), 5,8,11,14-에이코사테트라에노산(아라키돈산; 20:4, ω6), 13,16-도코사디에노산(22:2, ω6), 7,10,13,16-도코사테트라에노산(22:4, ω6), 및 4,7,10,13,16-도코사펜타에노산(22:5, ω6)을 포함한다. ω3 다불포화 지방산에 있어서, 구체적인 예는 11,14,17-에이코사트리에노산(α-리놀렌산; 20:3, ω3), 8,11,14,17-에이코사테트라에노산(20:4, ω3), 5,8,11,14,17-에이코사펜타에노산(20:5, ω3), 7,10,13,16,19-도코사펜타에노산(22:5, ω3), 및 4,7,10,13,16,19-도코사헥사에노산(22:6, ω3)을 포함한다. 각 LCPUFA 이름 뒤의 괄호 안의 콜론 양쪽의 두 개의 수는 탄소 사슬 길이 및 지방산의 불포화도를 나타내고, "(탄소 사슬 길이) : (이중 결합의 수)"로 표현됨에 유의해야 한다. LCPUFA 의 상기 예 중에서 아라키돈산(ARA) 및/또는 4,7,10,13,16,19-도코사헥사에노산(DHA)이/들이 이용에 더욱 바람직하다. 이들 LCPUFA 는 LCPUFA-PL 의 성분으로서 단독으로 또는 조합으로 함유될 수 있다.

상기 LCPUFA 에 있어서, 그의 구조 내에 함유된 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합(-C=C-)은 공액 이중 결합일 수 있다. 이 공액 이중 결합은 카르보닐기(C=O)와 접합된 것일 수 있거나, 서로 인접한 탄소-탄소 이중 결합들 사이에서 형성될 수 있다.

본 발명의 방법은 그러므로 상기 더 자세히 기술된 LCPUFA-PL 의 제조 방법이다. 마찬가지로, 본 방법 발명에 의해 제조된 포스포리피드는 또한 본 발명의 범위 내에 속한다.

본 방법 발명에 의해 제조된 포스포리피드는 상기 열거된 포스포리피드를 하나 이상 포함할 수 있거나, 그들 중 둘 이상을 포함할 수 있다. 정제 단계를 거치지 않는 미정제 포스포리피드의 경우, 다양한 소량 성분을 함유할 수 있다. 상기 소량 성분의 예는 지질-생산 미생물에서 유래된 포스포리피드 이외의 지질 성분(예, 지방)을 포함한다.

본 방법 발명에 의해 수득된 포스포리피드의 조성 특성

본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 의 조성은 당업자에게 공지된 임의의 절차에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 포스포리피드의 지방산 부분에 대한 정성적 및 정량적 분석이 하기와 같이 달성될 수 있다: 포스포리피드의 성분으로서 지방산은 당업자에게 공지된 HCl-메탄올 방법에 의해 그의 메틸 에스테르 형태로 유도된 후, 기체 크로마토그래피에 의해 평가된다. 포스포리피드의 친수성 부분에 대한 분석이 공지된 분리 기술, 예컨대 박층 크로마토그래피(TLC), 칼럼 크로마토그래피, 질량 분광측정법, 용매 분획법(예, 아세톤 분획법) 등에 의해 달성될 수 있다.

본 방법 발명에 따른 배양 생성물로부터 수득된 포스포리피드는 그의 성분으로서 함유된 분지 지방산, 예컨대 이소미리스트산(iso14:0) 및 이소팔미트산(iso16:0)의 함량이 낮음을 특징으로 한다. 분지 지방산의 함량은, 예를 들어, 이소팔미트산의 함량으로서 평가될 수 있다. 더욱 구체적으로, "분지 지방산의 함량이 낮음"은, 이소팔미트산의 조성 비율이 모든 PL 의 성분으로서 함유된 모든 지방산의 총량에 대해 5 % 이하, 바람직하게는 0.5 % 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 % 이하임을 의미한다.

본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 를 포함하는 포스포리피드에 있어서, 분지 지방산인 이소팔미트산의 조성 비율은 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스포리피드의 성분으로서 함유된 지방산의 총량에 대해 5 % 이하일 수 있고, 아라키돈산의 조성 비율은 지방산의 총량에 대해 13 % 이상일 수 있다. 바람직하게는, 이소팔미트산의 조성 비율은 0.5 % 이하 또는 0.1 % 이하일 수 있고, 아라키돈산의 조성 비율은 20 % 이상 또는 25 % 이상일 수 있다.

대안적으로, 본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 를 포함하는 포스포리피드에 있어서, 분지 지방산인 이소팔미트산의 조성 비율은 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스포리피드의 성분으로서 함유된 지방산의 총량에 대해 5 % 이하일 수 있고, 이소팔미트산의 조성 비율은 또한 지방산의 총량에 대해 아라키돈산의 조성 비율의 1/6 이하일 수 있다. 바람직하게는, 이소팔미트산의 조성 비율은 0.5 % 이하 또는 0.1 % 이하일 수 있고, 이소팔미트산의 조성 비율은 또한 아라키돈산의 조성 비율의 1/10 이하 또는 1/20 이하일 수 있다.

본 방법 발명에 의해 수득된 포스포리피드에 관하여, 건조 세포의 g 당 함유된 모든 포스포리피드의 성분으로서 함유된 지방산의 양은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 바람직하게는 34.7 mg 이상, 더욱 바람직하게는 36.3 mg 이상, 더욱더 바람직하게는 47.7 mg 이상, 및 특히 바람직하게는 65.2 mg 이상이다.

본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 가 아라키돈산(ARA)을 그의 성분 LCPUFA 로서 함유하는 경우, 건조 세포의 g 당 함유된 모든 포스포리피드의 성분으로서 함유된 ARA 의 양은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 바람직하게는 12.1 mg 이상, 더욱 바람직하게는 15.1 mg 이상, 및 더욱더 바람직하게는 19.9 mg 이상이다.

마찬가지로, 본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 가 디호모-γ-리놀렌산(DGLA)을 그의 성분 LCPUFA 로서 함유하는 경우, 건조 세포의 g 당 함유된 모든 포스포리피드의 성분으로서 함유된 DGLA 의 양은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 바람직하게는 1.5 mg 이상 , 더욱 바람직하게는 1.8 mg 이상, 및 더욱더 바람직하게는 2.0 mg 이상이다.

본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 가 포스파티딜콜린(PC)인 경우, 건조 세포의 g 당 함유된 모든 PC 의 성분으로서 함유된 지방산의 양은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 5.99 mg 이상, 바람직하게는 10.0 mg 이상, 더욱 바람직하게는 15.0 mg 이상, 및 더욱더 바람직하게는 20.0 mg 이상이다. 마찬가지로, 본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 가 포스파티딜에탄올라민(PE)인 경우, 건조 세포의 g 당 함유된 모든 PE 의 성분으로 함유된 지방산의 양은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 7.62 mg 이상, 바람직하게는 10.0 mg 이상, 더욱 바람직하게는 15.0 mg 이상, 및 더욱더 바람직하게는 20.0 mg 이상이다. 또한, 본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 가 포스파티딜세린(PS)인 경우, 건조 세포의 g 당 함유된 모든 PS 의 성분으로 함유된 지방산의 양은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 1.09 mg 이상, 바람직하게는 2.0 mg 이상, 및 더욱 바람직하게는 3.0 mg 이상이다.

본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 가 아라키돈산(ARA)을 성분으로서 함유하는 포스파티딜콜린(ARA-PC)을 포함하는 경우, 모든 포스파티딜콜린의 성분으로서 함유된 아라키돈산의 양은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 건조 세포의 g 당 1.0 mg 이상, 바람직하게는 1.08 mg 이상, 더욱 바람직하게는 4.0 mg 이상, 및 더욱더 바람직하게는 5.0 mg 이상이다. 마찬가지로, 본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 가 ARA 를 성분으로서 함유하는 포스파티딜에탄올라민(ARA-PE)을 포함하는 경우, 모든 포스파티딜에탄올라민의 성분으로서 함유된 아라키돈산의 양은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 건조 세포의 g 당 0.5 mg 이상, 바람직하게는 1.35 mg 이상, 더욱 바람직하게는 2.0 mg 이상, 더욱더 바람직하게는 3.0 mg 이상, 및 특히 바람직하게는 5.0 mg 이상이다. 또한, 본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 가 ARA 를 성분으로서 함유하는 포스파티딜세린(ARA-PS)을 포함하는 경우, 모든 포스파티딜세린의 성분으로서 함유된 아라키돈산의 양은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 건조 세포의 g 당 0.05 mg 이상, 바람직하게는 0.06 mg 이상, 더욱 바람직하게는 0.15 mg 이상, 더욱더 바람직하게는 0.3 mg 이상, 및 특히 바람직하게는 0.4 mg 이상이다.

본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 가 디호모-γ-리놀렌산(DGLA)을 성분으로서 함유하는 포스파티딜콜린(DGLA-PC)을 포함하는 경우, 모든 포스파티딜콜린의 성분으로서 함유된 DGLA 의 양은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 건조 세포의 g 당 0.11 mg 이상, 바람직하게는 0.3 mg 이상, 및 더욱 바람직하게는 0.6 mg 이상이다. 본 방법 발명에 의해 수득된 LCPUFA-PL 가 DGLA 를 성분으로서 함유하는 포스파티딜에탄올라민(DGLA-PE)을 포함하는 경우, 모든 포스파티딜에탄올라민의 성분으로서 함유된 DGLA 의 양은 어떤 식으로도 제한되지 않으나, 건조 세포의 g 당 0.1 mg 이상, 바람직하게는 0.3 mg 이상, 및 더욱 바람직하게는 0.5 mg 이상이다.

본 방법 발명에 의해 수득된 배양 생성물은, LCPUFA-PL 에 더하여, LCPUFA 를 성분으로서 함유하는 트리글리세리드를 함유하고, 그의 백분율은 어떤 식으로도 제한되지 않는다. 그러나, 본 방법 발명에 의해 제조된 배양 생성물은 다른 배양 기술에 의해 제조된 배양 생성물에 비해 증가된 함량의 LCPUFA-PL 를 갖는다. 배양 생성물 내 LCPUFA-PL 의 함량이 증가되는지 여부는, 예를 들어, 포스포리피드의 성분으로서 함유된 아라키돈산(ARA-PL) 및 트리글리세리드의 성분으로서 함유된 아라키돈산(ARA-TG) 사이의 비율을 평가함으로써 확인될 수 있다. 본 방법 발명에 의해 수득된 배양 생성물에 있어서, 예를 들어, ARA-PL 및 ARA-TG 사이의 비율(ARA-PL/ARA-TG)은 0.2 이상, 바람직하게는 0.84 이상, 더욱 바람직하게는 1.05 이상, 및 더욱더 바람직하게는 1.70 이상이다.

본 발명의 장점

본 발명의 방법이 LCPUFA 를 성분으로서 함유하는 포스포리피드(LCPUFA-PL)를 생산하는 능력이 있는 모르티에렐라 에스피.를 배양하는 데 이용되는 경우, 단시간 동안 다량의 LCPUFA-PL 가 상기 세포 내에 축적될 수 있다. 더욱이, 본 방법 발명에 의해 제조된 세포 내의 포스포리피드는 낮은 함량의 분지 지방산을 갖는다. 이런 이유로, 이들 세포는, LCPUFA-PL 추출을 위한 공급 원천으로서 이용되는 경우, LCPUFA-PL 가 한정된 원천으로부터 소량으로 수득되어, 그의 공급이 불안정하고 그의 품질이 항상 일정하지 않음에도 불구하고, 더 높은 안정성으로 식품 및 동물 사료에의 용도로 이용될 수 있는 고품질 산업적 산물로서 LCPUFA-PL 의 효율적이고 안정된 공급을 가능케 한다.

도 1a 는 개시 pH 와 추출된 포스포리피드의 양 사이의 상호관계를 나타내는 도면이다. 도 1b 는 개시 pH 와 추출된 포스포리피드 내 아라키돈산의 양 사이의 상호관계를 나타내는 도면이다.

도 2a 는 배양되는 동안 배지 I 및 배지 II 내 pH 변화를 나타내는 도면이다. 색칠된 원은 배지 I (pH 를 제어하지 않음)을 나타내고 색칠된 사각형은 배지 II (pH 를 제어함)를 나타낸다. 도 2b 는 배양 일수 및 추출된 포스포리피드의 양 사이의 상호관계를 나타내는 도면이다. 속이 빈 원은 배지 I (pH 를 제어하지 않음)을 나타내고 속이 빈 사각형은 배지 II (pH 를 제어함)를 나타낸다.

도 3a 는 배양 4 일째 온도가 변화된 후 포스포리피드 분획 내 모든 지방산에 대한 아라키돈산(ARA)의 백분율을 나타내는 도면이다. 도 3b 는 배양 4 일째 온도가 변화된 후 트리글리세리드 분획 내에 존재하는 아라키돈산에 대한 포스포리피드 분획 내에 존재하는 아라키돈산의 비율을 나타내는 도면이다.

도 4 는 배양 4 일째 온도가 20 ℃ 로 변화된 후, 포스포리피드 분획 내 모든 지방산에 대한 아라키돈산(ARA)의 백분율을 배양 시간에 대해 표현하여 나타내는 도면이다.

본 발명은 이제 발명의 범위를 제한하려는 의도가 없는 하기 실시예 및 비교예에 의해 더욱 상세히 기술될 것이다. 또한, 하기 실시예 및 비교예에 나타난 용어 "포스포리피드" 는 실리카 겔 칼럼 상에서 클로로포름 세정에 의해 용리되지는 않으나, 이어지는 메탄올 용리에 의해 수집되는 분획으로 정의되거나, 헥산 : 디에틸에테르 = 7:3 을 전개 용매로서 이용하는 실리카 겔 박층 크로마토그래피(TLC)에서 점찍어진 위치에서 전혀 이동하지 않는 분획으로서 정의된다.

실시예 1: 분지 지방산( 이소팔미트산 ( iso16 :0))의 생산성

1 % 효모 추출물 및 4 % 글루코오스를 함유하는 배지(pH 6.3, 20 mL)를 100 mL 마이어(Meyer's) 플라스크 내에 준비하고, 120 ℃ 에서 20 분 동안 멸균했다. 코니디오볼루스 에스피.에 속하는 두개의 균주, 즉, 코니디오볼루스 트로모보이데스(Conidiobolus thromoboides) CBS183.60 및 코니디오볼루스 나노데스(Conidiobolus nanodes) CBS154.56 뿐만 아니라, 표 1 에서 나타낸 모르티에렐라 에스피.에 속하는 균주 A 내지 E 를 각각 하나의 백금 고리의 양으로 배지 내로 접종한 후, 7 일 동안 28 ℃ 의 온도에서 120 rpm 상호 진탕의 조건 하에 배양했다. 배양 완료 후, 세포를 여과로 수집하고, 물로 충분히 세정한 후, 밤새 동결건조하여 각 경우에 대한 건조 세포를 수득했다.

클로로포름/메탄올 = 2:1 (4 mL)의 혼합 용매를 수득된 건조 세포에 첨가하고 각 혼합물을 70 ℃ 에서 1 시간 동안 온화하게 교반하여 유기 용매 층을 수집한 후, 상기 혼합 용매(4 mL)를 재첨가하여 모든 유기 용매 층을 수집했다. 이 유기 용매를 원심 농축기로 증류 제거하여 총 지질 분획을 수득했다. 수득된 총 지질 분획을 실리카 겔 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 트리세리드(TG) 및 포스포리피드(PL) 분획으로 분별했다. 이용된 전개 용매는 헥산: 에틸에테르 = 7:3 (v/v)의 혼합 용매였다. 양 분획을 각각 스크랩핑(scraping)에 의해 수집하고 HCl-메탄올 방법에 의해 메틸 에스테르 형태로 유도한 후, 기체 크로마토그래피에 의해 지방산을 정성적 및 정량적 분석했다. 펜타데카노산을 내부 기준으로서 이용했다.

수득된 결과를 표 2 에 나타냈다. 표 2 의 모든 중량이 건조 세포의 g 당 중량임에 유의해야 한다.

	모르티에렐라 에스피.의 배양된 균주
건조 세포 A	A: 모르티에렐라 알피나 1S-4 AKU3998
건조 세포 B	B: 모르티에렐라 슈무케리 NRRL2761
건조 세포 C	C: 모르티에렐라 알피나 CBS224.37
건조 세포 D	D: 모르티에렐라 벨자코바에 CBS601.68
건조 세포 E	E: 모르티에렐라 엘롱가타 CBS125.71

모르티에렐라 에스피.가 코니디오볼루스 에스피.에 비해 높은 백분율의 아라키돈산을 함유하고 낮은 함량의 분지 지방산을 갖는 포스포리피드를 축적함을 확인했다.

실시예 2: 모르티에렐라 에스피 . 내 LCPUFA -함유 포스포리피드의 조성

1 % 효모 추출물 및 4 % 글루코오스를 함유하는 배지(pH 6.3, 4 mL)를 20 mL 마이어 플라스크 내에 준비하고, 120 ℃ 에서 20 분 동안 멸균했다. 표 1 에서 나타낸 균주 A, B, D 및 E 를 각각 하나의 백금 고리의 양으로 배지 내로 접종한 후, 7 일 동안 120 rpm 상호 진탕의 조건 하에 28 ℃ 의 온도에서 배양하여 건조 세포 A', B', D' 및 E'를 수득했다. 마찬가지로, 1 % 소맥분, 1.5 % 글루코오스 및 0.3 % KH₂PO₄ 를 함유하는 배지(pH 5.0, 4 ml)를 20 mL 마이어 플라스크 내에 준비한 후, 표 1 에서 나타낸 균주 C 로 접종한 후, 상기와 동일한 방법으로 배양하여 건조 세포 C' 를 수득했다.

실시예 1 에서 나타낸 것과 동일한 방법으로 수득한 각각의 총 지질 분획을 TLC(이용된 전개 용매는 클로로포름:메탄올:아세트산:물 = 50:37.5:3.5:2 (v/v/v/v)였다) 처리하고 각각의 포스포리피드 분획, 즉, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜에탄올라민(PE), 포스파티딜이노시톨 (PI) 및 카르디올리핀 (CL) 분획으로 분별한 후, 실시예 1 에서 나타낸 것과 동일한 방법으로 지방산을 정성적 및 정량적 분석했다.

수득된 결과를 표 3 에 나타냈다. 표 3 의 모든 중량이 건조 세포의 g 당 중량임에 유의해야 한다.

실시예 3: 포스페이트 염의 존재하의 배양

표 4 에서 나타낸 6 가지의 상이한 농도로 1 % 소맥분, 3 % 글루코오스 및 KH₂PO₄ 를 함유하는 배지(pH 6.3, 4 mL)를 20 mL 마이어 플라스크 내에 준비하고, 120 ℃ 에서 20 분 동안 멸균했다. 모르티에렐라 슈무케리 NRRL2761 또는 모르티에렐라 알피나 CBS224.37 의 포자 현탁액을 상기 배지 내로 접종한 후, 5 일 동안 120 rpm 상호 진탕의 조건 하에 28 ℃ 의 온도에서 배양했다. 배양 완료 후, 실시예 1 에서 나타낸 것과 동일한 방법으로 모든 지질을 동결건조된 세포로부터 추출하고, Sep-Pak Plus 칼럼 크로마토그래피에 의해 트리글리세리드(TG) 및 포스포리피드(PL) 분획으로 분별했다. 이용한 용리 용매는 트리글리세리드 용리에 대해서는 클로로포름이고 포스포리피드 용리에 대해서는 메탄올이었고, 이들 유기 용매를 원심 농축기에 의해 증류 제거하여 각 분획을 수득했다. 분별 후, HCl-메탄올 방법에 의해 각 분획을 메틸 에스테르 형태로 유도한 후, 기체 크로마토그래피에 의해 지방산을 정성적 및 정량적 분석했다. 펜타데카노산을 내부 기준으로서 이용했다.

수득된 결과를 표 4 에 나타냈다. 표 4 의 모든 중량이 건조 세포의 g 당 중량임에 유의해야 한다.

상기 결과는 포스페이트 염이, 배지에 첨가했을 때, 세포 당 포스포리피드의 양 및 포스포리피드 내 LCPUFA 의 양을 증가시키고, 포스페이트 염 첨가의 효과가 트리글리세리드 내에서 보다 포스포리피드 내에서 더욱 효과적임을 확인했다.

실시예 4: 낮은 개시 pH 에 의한 배양

1 % 소맥분, 1.5 % 글루코오스 및 0.3 % KH₂PO₄ 를 함유하는 배지의 개시 pH 를 7 가지 수준(즉, pH 4.0, pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.3, pH 7.0 및 pH 8.0)으로 조정하고, 4 mL 의 배지를 20 mL 마이어 플라스크 내에 도입하고, 120 ℃ 에서 20 분 동안 멸균했다. 모르티에렐라 알피나 CBS224.37 의 포자 현탁액을 상기 배지 내로 접종한 후, 5 일 동안 120 rpm 상호 진탕의 조건 하에 28 ℃ 의 온도에서 배양했다. 배양 완료 후, 실시예 3 에서 나타낸 것과 동일한 방법으로 모든 지질을 동결건조된 세포로부터 추출하고, Sep-Pak Plus 칼럼 크로마토그래피에 의해 트리글리세리드(TG) 및 포스포리피드(PL) 분획으로 분별한 후, 지방산을 정성적 및 정량적 분석했다.

수득된 결과를 표 5 및 도 1 에 나타냈다. 표 5 의 모든 중량이 건조 세포의 g 당 중량임에 유의해야 한다.

개시 pH 를 낮췄을 때, 포스포리피드 내 LCPUFA 의 백분율의 증가를 관찰했고, 특히 세포 당 포스포리피드의 양 및 포스포리피드 내 LCPUFA 의 양의 현저한 증가를 관찰했다.

실시예 5: 배양의 후기 단계에서 낮은 pH 제어

1.5 % 소맥분, 2 % 글루코오스 및 0.3 % KH₂PO₄ 를 함유하는 배지(pH 5.0, 5 L)를 10 L 발효조 내로 도입하고, 12O ℃ 에서 20 분 동안 멸균했다(배지 I). 마찬가지로, 1.5 % 소맥분 및 2 % 글루코오스를 함유하는 배지(pH 4.5, 5 L)를 10 L 발효조 내로 도입하고 12O ℃ 에서 20 분 동안 동일한 방법으로 멸균했다(배지 II). 모르티에렐라 알피나 CBS224.37 을 접종한 후, 1 vvm 의 통기 부피에서 6 일 동안 통기-교반 배양했다. 교반을 배양 시작시 300 rpm 으로 설정하고, 배양 2 일째부터 500 rpm 으로 증가시키는 한편, 배양 온도를 배양 시작시 28 ℃ 로 설정하고, 배양 3 일째부터 20 ℃ 로 낮췄다. 글루코오스를 배양 첫날 1.0 %, 및 배양 2 일째 0.75 % 의 양으로 첨가했다. 더욱이, 오직 배지 II 를 0.5 N H₂SO₄ 로 제어하여 배지 pH 가 배양 6 일째 동안 5.0 이하에서 유지되도록 했다. 배양 완료 후, 실시예 3 에서 나타낸 것과 동일한 절차를 반복하여 모든 지질의 추출, 트리글리세리드(TG) 및 포스포리피드(PL) 분획으로의 분별, 및 지방산의 정성적 및 정량적 분석을 수행했다.

배양 5 일째 수득된 결과를 표 6 에 나타냈다. 표 6 의 모든 중량이 건조 세포의 g 당 중량임에 유의해야 한다. 또한, 도 2a 는 배양되는 동안의 pH 변화를 나타내고, 도 2b 는 추출된 포스포리피드의 양의 변화에 대한 pH 제어의 효과를 나타낸다.

배양 후기 단계에서 pH 상승이 방지된 (배지 II) 배양 절차는 건조 세포 당 LCPUFA 의 양, 특히 배지 당 생산성에 대한 더 나은 결과를 제공했고, 이는 배양 후기 단계에사 pH 상승의 방지에 대한 pH 제어가 10 L 발효조 내에서 효과적이었음을 지시한다.

실시예 6: 교반 제어

1.0 % 소맥분, 2 % 글루코오스 및 0.3 % KH₂PO₄ 를 함유하는 배지(pH 5.0, 5 L)를 10 L 발효조 내로 도입하고, 12O ℃ 에서 20 분 동안 멸균했다. 모르티에렐라 알피나 CBS224.37 을 접종한 후, 28 ℃ 의 배양 온도 및 1 vvm 의 통기 부피로 7 일 동안 통기-교반 배양했다. 배양 2 일째에 표 7 에서 지시한 바와 같이 교반을 4 가지 수준으로 다르게 하고, 배양을 추가로 계속했다. 2 일째, 0.5 % 의 글루코오스를 첨가했다. 배양 완료 후, 실시예 3 에서 나타낸 것과 동일한 절차를 반복하여 모든 지질의 추출, 트리글리세리드(TG) 및 포스포리피드(PL) 분획으로의 분별, 및 지방산의 정성적 및 정량적 분석을 수행했다.

배양 4 일째 수득된 결과를 표 7 에 나타냈다. 표 7 의 모든 중량이 건조 세포의 g 당 중량임에 유의해야 한다. 표 7 에 나타난 "교반 변수 KLA" 가 단위 부피 P/V (W/m³) 및 통기 선형 속도 변수 Vs (m/sec)로부터 정의되는 유구 최대 교반력 KLA (= (P/V)^0.95 Vs⁰ ^.67)[(W/m³)^0.95(m/sec)^0.67]를 의미함에 유의해야 한다.

배양 용액의 유동성을 개선하기 위해 KLA 를 증가시켰을 때, 포스포리피드 분획 내 아라키돈산의 백분율 및 건조 세포 당 아라키돈산의 양을 증가시키는 것이 가능했다.

실시예 7: 저온에서의 배양

1 % 소맥분, 1.5 % 글루코오스 및 0.3 % KH₂PO₄ 를 함유하는 배지(pH 5.0, 20 mL)를 100 mL 마이어 플라스크 내로 도입하고, 120 ℃ 에서 20 분 동안 멸균했다. 모르티에렐라 알피나 CBS224.37 의 포자 현탁액을 상기 배지 내로 접종하고, 120 rpm 상호 진탕하면서 28 ℃ 의 온도에서 4 일 동안 배양했다. 배양 온도를 그후 6 가지 수준(즉, 10 ℃, 16 ℃, 20 ℃, 24 ℃, 28 ℃ 및 32 ℃)으로 다르게 하고, 120 rpm 상호 진탕하면서 18 시간 동안 배양을 추가로 계속했다. 배양 완료 후, 실시예 3 에서 나타낸 것과 동일한 절차를 반복하여 모든 지질의 추출, 트리글리세리드(TG) 및 포스포리피드(PL) 분획으로의 분별, 및 지방산의 정성적 및 정량적 분석을 수행했다. 수득된 결과를 표 8 및 도 3 에 나타냈다.

마찬가지로, 상기 동일한 배지를 모르티에렐라 알피나 CBS224.37 의 포자 현탁액으로 접종하고, 120 rpm 상호 진탕하면서 28 ℃ 의 온도에서 4 일 동안 배양했다. 배양 온도를 그후 20 ℃ 로 낮추고, 2, 4, 8, 12, 14 또는 18 시간 동안 배양을 추가로 계속했다. 배양 완료 후, 실시예 3 에서 나타낸 것과 동일한 절차를 반복하여 모든 지질의 추출, 트리글리세리드(TG) 및 포스포리피드(PL) 분획으로의 분별, 및 지방산의 정성적 및 정량적 분석을 수행했다. 수득된 결과를 표 9 및 도 4 에 나타냈다.

표 8 및 9 의 모든 중량이 건조 세포의 g 당 중량임에 유의해야 한다.

배양하는 동안 저온로 변화시키는 경우, 포스포리피드 분획 내 아라키돈산의 백분율 및 건조 세포 당 아라키돈산의 양 둘다의 현저한 증가를 관찰했다(표 8, 도 3a). 저온에서의 4 시간 배양에서조차 이들 효과가 균일하게 나타났고, 따라서 매우 짧은 시간 내에 효과적으로 변함을 확인했다(표 9, 도 4). 더욱이, 아라키돈산 증가의 효과가 트리글리세리드 분획 내보다 포스포리피드 분획 내에서 더 높고, 따라서 높은 "ARA-PL/ARA-TG" 비율을 갖는 지방의 세포내 축적을 가능케 한다(표 8, 도 3b).

Claims

하기 단계를 포함하는 긴 사슬 다불포화 지방산을 성분으로서 함유하는 포스포리피드(LCPUFA-PL)의 제조 방법:

(i) 모르티에렐라 에스피.에 속하는 미생물을 미생물 내에서 LCPUFA-PL 의 세포내 축적을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계;

(ii) 미생물의 배양 생성물로부터 LCPUFA-PL 를 수득하는 단계로서, 여기서분지 지방산인 이소팔미트산의 조성 비율은 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스포리피드(PL)의 성분으로서 함유된 지방산의 총량에 대해 5 % 이하임.
제 1 항에 있어서, 모르티에렐라 에스피.에 속하는 미생물이 모르티에렐라 아속의 미생물인 방법.
제 2 항에 있어서, 모르티에렐라 에스피.에 속하는 미생물이 모르티에렐라 알피나.인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 의 세포내 축적을 허용하는 조건 하의 배양이 개시 pH 4 내지 10 을 포함하는 조건 하에 배양함을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 의 세포내 축적을 허용하는 조건 하의 배양이 pH 4 내지 6 을 유지하도록 제어하면서 배양함을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 의 세포내 축적을 허용하는 조건 하의 배양이 3.7 mM 내지 147 mM 의 포스페이트 염을 함유하는 배지 내에서 배양함을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 의 세포내 축적을 허용하는 조건 하의 배양이 8.3 이상의 요구 최대 교반력 KLA (= (P/V)^0.95·Vs^0.67)로 교반하면서 배양함을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 의 세포내 축적을 허용하는 조건 하의 배양이 세포를 성장시킨 후 4 내지 18 시간 동안 10 ℃ 내지 25 ℃ 에서 배양함을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 의 세포내 축적을 허용하는 조건 하의 배양이 28 ℃ 에서 2 내지 20 일 동안 배양한 후 10 ℃ 내지 25 ℃ 에서 4 내지 18 시간 동안 배양함을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 의 세포내 축적을 허용하는 조건 하의 배양이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 2 이상의 배양 조건을 포함함을 포함하는 방법:

(a) 개시 pH 4 내지 10 을 포함하는 조건 하에 배양함;

(b) pH 4 내지 6 을 유지하도록 제어하면서 배양함;

(c) 3.7 mM 내지 147 mM 의 포스페이트 염을 함유하는 배지 내에서 배양함;

(d) 8.3 이상의 요구 최대 교반력 KLA (= (P/V)^0.95·Vs⁰ ^.67)로 교반하면서 배양함; 및

(e) 세포를 성장시킨 후 또는 28 ℃ 에서 2 내지 20 일 동안 배양한 후 10 ℃ 내지 25 ℃ 에서 4 내지 18 시간 동안 배양함.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 생성물이 배양 용액 또는 멸균된 배양 용액이거나, 그로부터 수집된 배양된 세포 또는 그의 건조 세포를 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 가 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올라민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산 및 카르디올리핀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 글리세로포스포리피드를 포 함하는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 오메가-6 다불포화 지방산, 오메가-3 다불포화 지방산 및 오메가-9 다불포화 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 긴 사슬 다불포화 지방산(LCPUFA)을 성분으로서 함유하는 LCPUEA-PL 의 제조에 이용되는 방법.
제 13 항에 있어서, 오메가-6 다불포화 지방산이 11,14-에이코사디에노산 (20:2, ω6), 8,11,14-에이코사트리에노산(디호모-γ-리놀렌산; 20:3, ω6), 5,8,11,14-에이코사테트라에노산(아라키돈산; 20:4, ω6), 13,16-도코사디에노산(22:2, ω6), 7,10,13,16-도코사테트라에노산(22:4, ω6) 및 4,7,10,13,16-도코 사펜타에노산(22:5, ω6)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 지방산인 방법.
제 13 항에 있어서, 오메가-3 다불포화 지방산이 11,14,17-에이코사트리에노산(α-리놀렌산; 20:3, ω3), 8,11,14,17-에이코사테트라에노산(20:4, ω3), 5,8,11,14,17-에이코사펜타에노산(20:5, ω3), 7,10,13,16,19-도코사펜타에노산(22:5, ω3) 및 4,7,10,13,16,19-도코사헥사에노산(22:6, ω3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 지방산인 방법.
제 13 항에 있어서, 오메가-9 다불포화 지방산이 5,8,11-에이코사트리에노 산(미드산; 20:3, ω9), 7,10,13-도코사트리에노산(22:3, ω9) 및 4,7,10,13-도코사테트라에노산(22:4, ω9)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 지방산인 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 아라키돈산(5,8,11,14-에이코사테트라에노산) 및 도코사헥사에노산(4,7,10,13,16,19-도코사헥사에노산)으로 이루어진 군에서 선택된 LCPUFA 를 성분으로서 함유하는 LCPUFA-PL 의 제조에 이용되는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 그의 분자 내에 하나 이상의 공액 이중 결합을 갖는 LCPUFA 를 성분으로서 함유하는 LCPUFA-PL 의 제조에 이용되는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 분지 지방산인 이소팔미트산의 조성 비율이 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스포리피드(PL)의 성분으로서 함유된 지방산의 총량에 대해 5 % 이하이고, 아라키돈산의 조성 비율이 지방산의 총량에 대해 13 % 이상인 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 분지 지방산인 이소팔미트산의 조성 비율이 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스포리피드(PL)의 성분으로서 함유된 지방산의 총량에 대해 5 % 이하이고, 이소팔미트산의 조성 비율이 또한 지방산의 총량에 대해 아라키돈산의 조성 비율의 1/6 이하인 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 가 아라키돈산을 함유하는 포스포리피드를 포함하고, 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스포리피드 내 아라키돈산의 양이 건조 세포의 g 당 11.8 mg 이상인 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 가 디호모-γ-리놀렌산(DGLA)을 함유하는 포스포리피드를 포함하고, 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스포리피드 내 DGLA 의 양이 건조 세포의 g 당 1.5 mg 이상인 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 가 아라키돈산을 함유하는 포스파티딜콜린을 포함하고, 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스파티딜콜린의 성분으로서 함유된 아라키돈산의 양이 건조 세포의 g 당 1.0 mg 이상인 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 가 아라키돈산을 함유하는 포스파티딜에탄올라민을 포함하고, 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스파티딜에탄올라민의 성분으로서 함유된 아라키돈산의 양이 건조 세포의 g 당 0.5 mg 이상인 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, LCPUFA-PL 가 아라키돈산을 함유하는 포스파티딜세린을 포함하고, 배양 생성물 내에 함유된 모든 포스파티딜세린의 성분으로서 함유된 아라키돈산의 양이 건조 세포의 g 당 0.05 mg 이상인 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 생성물이 아라키돈산을 성분으로서 함유하는 포스포리피드 및 아라키돈산을 성분으로서 함유하는 트리글리세리드를 함유하고, 포스포리피드의 성분으로서 존재하는 아라키돈산의 양이 트리글리세리드의 성분으로서 존재하는 아라키돈산의 양에 대해 0.2 이상의 비율인 방법.