CN101870915B - 水酶法提取花生四烯酸油脂的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水酶法提取花生四烯酸油脂的工艺，以高山被孢霉为出发菌株，经发酵培养后，加入蒸馏水稀释制成菌体悬浮液，调节悬浮液pH值，加入生物酶恒温振荡6～10小时后，加入乙醇和正己烷进行油脂萃取，离心分层后取有机溶剂相，然后在剩下的水相和固体相中加入正己烷进行二次萃取，离心分层后合并有机溶剂相，有机溶剂相经旋转蒸发即可得到油脂和有机溶剂。本发明具有能耗低、成本低、花生四烯酸油脂收率高、品质高、反应设备简易，易于批量大规模应用等优点。
Description
技术领域
本发明涉及利用高山被孢霉(Mortierella alpina)生产花生四烯(Arachidonic acid，简称ARA)油脂的工艺，属于生物工程领域。具体地说，利用生物酶破碎高山被孢霉的细胞壁，从而提取花生四烯酸油脂的方法，是生物工程下游过程中分离提取的技术领域。
背景技术
花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA，即5，8，11，14-二十碳四烯酸)属于ω-6系列长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)，是一种人体最活跃和必需的多不饱和脂肪酸，具有促进智力发育、提高人体视力、降低血脂、增强免疫力和抗癌等功效，被广泛应用于功能保健、生物医药、化妆品及饲料添加剂等方面。由于花生四烯酸油脂在成年人体内合成量极少，婴幼儿体内则无法合成，因此从食物中摄取额外的花生四烯酸油脂对人体许多组织特别是脑组织的生长发育至关重要。
花生四烯酸油脂的传统来源是从动物肝脏、猪肾上腺、血液、鱼油中提取，但动物组织中的花生四烯酸油脂含量很低(约为0.2％)，来源少，且受季节限制，价格昂贵，无法满足日益增长的市场需求。微生物合成花生四烯酸油脂以生产周期短、环境污染小、原料来源广泛、可持续发展性强和产品质量好等优点逐渐替代了传统花生四烯酸油脂的制备方法，其中以高山被孢霉(M.alpina)的花生四烯酸油脂含量最高(Higashiyama K，Biotechnology and Bioprocess Engineering，2002，7：252-262)，且利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂已经实现工业化。因此，花生四烯酸油脂的提取工艺成为微生物合成法工业化生产的一个必要环节。
从高山被孢霉中提取花生四烯酸油脂的方法主要有：(1)索式提取法，发酵液抽滤集菌，烘干研碎，装入索式提取器，正己烷加热回流提取十二小时，旋转蒸发去除正己烷即得油脂。(2)有机溶剂萃取法，发酵液抽滤集菌，按一定比例加入有机溶剂(常用的有石油醚，乙醇～正己烷，氯仿～甲醇，乙醚)，振荡混匀，离心取有机相，蒸发去除有机溶剂即得油脂。(3)超声波提取法，发酵液超声波破解细胞壁，加入机溶剂萃取，离心取有机相，蒸发去除有机溶剂即得油脂。(4)超临界CO2萃取法，发酵液抽滤集菌，烘干研碎，装入萃取管，超临界状态下分离出油脂。
但是，这些油脂提取方法存在着种种缺点与不足：(1)索式提取法，耗时长，冷却水用量大，难以批量提取，仅局限在实验室规模的油脂提取。(2)有机溶剂法油脂收率低，油脂品质差，对花生四烯酸而言，有机溶剂的残留存在食用安全性的潜在问题。(3)超声波提取所需功率大，处理规模小，难以实现工业化。(4)超临界CO2萃取，设备复杂，生产成本高，仅局限在实验室规模的油脂提取。因此，需要寻求一种油脂收率高、油脂品质高、功效高、能耗低且易于工业化的油脂提取方法，利用水酶法对高山被孢霉菌体进行花生四烯酸油脂的提取工艺未见文献报道。
水酶法以功效高、油脂品质高、能耗低、易于批量化处理等特点，日益得到科研界和工业界的重视。公开号CN101307341A利用生物酶对寇式隐甲藻进行油脂提取，论证了酶解法对海藻细胞的可行性；公开号CN101531689A和CN101235399A论证了酶解法对植物细胞的可行性。本发明以三种蛋白酶(碱性蛋白酶，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶)以及六种多糖水解酶(纤维素酶，木聚糖酶，果胶酶，糖化酶，淀粉酶和蜗牛酶)为研究重点，提供一种花生四烯酸水酶法提取工艺。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种水酶法提取花生四烯酸油脂的工艺，以高效、批量化萃取花生四烯酸油脂，并通过优化工艺条件，获得较高的油脂收率。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种水酶法提取花生四烯酸油脂的工艺，包含如下步骤：
(1)培养高山被孢霉发酵生产花生四烯酸；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中，加蒸馏水稀释1～3体积倍数制成菌体悬浮液，加入0.25～2.5g/L的生物酶，调节体系pH值至生物酶的酶解反应最适pH，调节体系温度至生物酶的酶解反应最适温度，进行酶解6～10h；
(3)向步骤(2)得到的酶解后的体系中，加入体系体积的10～15％(v/v)的乙醇和20～40％(v/v)的正己烷进行油脂萃取，离心分层，取有机相；向剩下的水相和固体相中，加入步骤(2)得到的酶解后体系体积的20～40％(v/v)的正己烷进行二次萃取，离心分层，取有机相，合并两次有机相；
(4)旋转蒸发收集的有机相，得到花生四烯酸油脂。
其中，所述的生物酶为纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、糖化酶、淀粉酶、蜗牛酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶中的任意一种或几种。
当所加入的生物酶为单一酶时，各种酶的酶解条件如下：
纤维素酶，最适pH为4.5～5.5，最适温度为40～50℃；
木聚糖酶，最适pH为3.5～5.5，最适温度为50～60℃；
果胶酶，最适pH为3.5～4.5，最适温度为50～60℃；
糖化酶，最适pH为4.0～4.5，最适温度为60～62℃；
淀粉酶，最适pH为5.5～6.5，最适温度为50～55℃；
蜗牛酶，最适pH为5.8～7.2，最适温度为37～45℃；
木瓜蛋白酶，最适pH为5.5～6.0，最适温度为45～65℃；
碱性蛋白酶，最适pH为7.5～9.0，最适温度为45～60℃；
中性蛋白酶，最适pH为6.5～7.5，最适温度为45～60℃。
当所加入的生物酶为多种酶时，采用依次向菌体悬浮液中加入单一酶进行酶解的方式，每一种酶都在其最适pH条件和最适反应温度下进行酶解，一种酶的反应结束之后，再加入另外一种酶。本发明对每一种酶的比例没有任何限制，只要求所有酶的总加入量为0.25～2.5g/L。本发明对每一种酶的酶解时间没有任何限制，只要求所有酶的酶解总时间为6～10h。
有益效果：本发明与现有技术相比有如下优点：
(1)水酶法效率高，能耗低，易于批量化大规模应用。
相对于常规花生四烯酸油脂的提取方法，水酶法易于实现工业化生产，和超声波提取相比，水酶法反应条件温和，效率高，能耗低。和索式提取法相比，可以节约大量冷却水的使用。
(2)水酶法反应设备简易，成本低，适用性强。
水酶法反应设备简单，实验室规模可以直接使用试管或摇瓶进行油脂提取；工业化规模可以直接使用花生四烯酸发酵生产的发酵罐进行原位酶解提取，不需要对其进行任何改造，从而使操作成本大大降低，适用性强。
(3)水酶法提取花生四烯酸油脂收率高，品质高。
在水酶法提取工艺的基础上，通过优化工艺条件，相比索式提取法(文献报道此法提油，收率最高)最终获得90～100％的油脂收率，水酶法提取的油脂，呈金黄色，清澈明亮，并且油脂中花生四烯酸相对含量相比索式提取法偏高10～15％。
附图说明
图1为本发明水酶法提取花生四烯酸油脂工艺流程图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所用的菌种为高山被孢酶(Mortierella alpine)，保藏编号为：CCTCC NO：M 207067。
实施例1：菌种发酵培养
培养基配方如下：
种子培养基：100g/L葡萄糖，11g/L酵母粉，8g/L玉米浆，3.8g/L KH2PO4，初始pH为5.0-6.0。
发酵培养基：100g/L葡萄糖，11g/L酵母粉，3.8g/L KH2PO4，3.4g/L NaNO3，0.5g/LMgSO4.7H2O。初始pH为5.5-6.5。
1)菌种活化
在制备种子之前，采用PDA斜面进行菌种活化，并将活化的菌种转入PDA固体培养基中培养3～5天，以积累大量孢子备用。
2)种子一次放大
将生长在PDA固体培养基上的高山被孢霉的孢子用无菌水洗脱后，通过无菌操作接入装有种子培养基的凹槽摇瓶中。摇瓶装液量为50ml/250ml。种子培养条件：摇床转速为150rpm，培养温度为25℃，培养时间为2～3天。
3)种子二次放大
将2)中培养的菌种通过无菌操作接入装有种子培养基凹槽摇瓶中。凹槽摇瓶装液量为100mL/500mL。接种量为5％(v/v)，即5mL。种子培养条件：摇床转速为150rpm，培养温度为25℃，培养时间为3天。
4)菌种发酵培养
将3)中培养的菌种通过无菌操作接入装有发酵培养基的凹槽摇瓶中。凹槽摇装液量为100mL/500mL。接种量为10％(v/v)，即10mL。培养条件：摇床转速为150rpm，培养温度为25℃，培养时间为7～8天。
实施例2：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释2体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为6.0，按30mL等量分装在50mL试管中，加入蜗牛酶20mg，40℃恒温振荡8小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4854g，对照组索式提取法得到油脂0.4994g，油脂收率为97.2％。
实施例3：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释2体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为6.0，按30mL等量分装在50mL试管中，加入蜗牛酶20mg，37℃恒温振荡8小时；加乙醇4.5mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4752g，对照组索式提取法得到油脂0.4994g，油脂收率为95.1％。
实施例4：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释2体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为6.0，按30mL等量分装在50mL试管中，加入蜗牛酶20mg，45℃恒温振荡8小时；加乙醇3mL和12mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加12mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4823g，对照组索式提取法得到油脂0.4994g，油脂收率为96.6％。
实施例5：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释2体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为7.2，按30mL等量分装在50mi试管中，加入蜗牛酶20mg，40℃恒温振荡8小时；加乙醇3mL和6mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4741g，对照组索式提取法得到油脂0.4994g，油脂收率为94.9％。
实施例6：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释3体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为8.0，按30mL等量分装在50mL试管中，加入碱性蛋白酶40mg，50℃恒温振荡8小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4472g，对照组索式提取法得到油脂0.4883g，油脂收率为91.6％。
实施例7：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释3体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为4.0，按30mL等量分装在50mL试管中，加入果胶酶40mg，55℃恒温振荡8小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4783g，对照组索式提取法得到油脂0.4994g，油脂收率为95.8％。表1是实施例2～7所提油脂成分分布情况。
表1
实施例8：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释1体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为4.8，按30mL等量分装在50mL试管中，加入纤维素酶40mg，45℃恒温振荡8小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4703g，对照组索式提取法得到油脂0.5186g，油脂收率为90.7％。
实施例9：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释1体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为5.5，按30mL等量分装在50mL试管中，加入木瓜蛋白酶40mg，55℃恒温振荡8小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4943g，对照组索式提取法得到油脂0.5186g，油脂收率为95.3％。
实施例10：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释2体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为7.0，按30mL等量分装在50mL试管中，加入中性蛋白酶40mg，50℃恒温振荡8小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4685g，对照组索式提取法得到油脂0.4883g，油脂收率为95.9％。表2是实施例8～10所提油脂成分分布情况。
表2
实施例11：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释2体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为4.0，按30mL等量分装在50mL试管中，加入木聚糖酶20mg，55℃恒温振荡8小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4808g，对照组索式提取法得到油脂0.4994g，油脂收率为96.3％。
实施例12：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释2体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为4.5，按30mL等量分装在50mL试管中，加入糖化酶40mg，60℃恒温振荡8小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4682g，对照组索式提取法得到油脂0.5186g，油脂收率为90.3％。
实施例13：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释2体积倍数制成菌体悬浮液，调节pH值为6.0，按30mL等量分装在50mL试管中，加入淀粉酶60mg，55℃恒温振荡8小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4465g，对照组索式提取法得到油脂0.4994g，油脂收率为89.4％。表3是实施例11～13所提油脂成分分布情况。
表3
实施例14：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释2体积倍数制成菌体悬浮液，按30mL等量分装在50mL试管中，调节pH值为8.0，加入碱性蛋白酶40mg，50℃恒温振荡4小时后，将pH值调为4.0，再加入果胶酶40mg，55℃恒温振荡4小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.5238g，对照组索式提取法得到油脂0.5422g，油脂收率为96.6％。
实施例15：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释2体积倍数制成菌体悬浮液，按30mL等量分装在50mL试管中，调节pH值为6.0，加入蜗牛酶20mg，40℃恒温振荡4小时后，将pH值调为7.0，再加入中性蛋白酶40mg，50℃恒温振荡4小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10ml正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4986g，对照组索式提取法得到油脂0.5075g，油脂收率为98.2％。
实施例16：
按照实施例1发酵培养菌体，在发酵液中加蒸馏水稀释2体积倍数制成菌体悬浮液，按30mL等量分装在50mL试管中，调节pH值为6.0，加入蜗牛酶20mg，40℃恒温振荡4小时后，将pH值调为5.5，再加入木瓜蛋白酶60mg，55℃恒温振荡4小时；加乙醇4mL和10mL正己烷进行第一次萃取，5000rpm离心5min取有机相，向剩下的水相和固体相中，加10ml正己烷二次萃取，5000rpm离心5min取有机相，合并有机相旋转蒸发得到有机溶剂和花生四烯酸油脂0.4225g，对照组索式提取法得到油脂0.4209g，油脂收率为100.3％。表4是实施例14～16所提油脂成分分布情况。
表4
Claims (1)
1.一种水酶法提取花生四烯酸油脂的工艺，其特征在于，该工艺包含如下步骤：
(1)培养高山被孢霉发酵生产花生四烯酸；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中，加蒸馏水稀释1～3体积倍数制成菌体悬浮液，加入0.25～2.5g/L的生物酶，调节体系pH值至生物酶的酶解反应最适pH，调节体系温度至生物酶的酶解反应最适温度，进行酶解6～10h；
(3)向步骤(2)得到的酶解后的体系中，加入体系体积的体积百分比为10～15％的乙醇和体积百分比为20～40％的正己烷进行油脂萃取，离心分层，取有机相；向剩下的水相和固体相中，加入步骤(2)得到的酶解后体系体积的体积百分比为20～40％的正己烷进行二次萃取，离心分层，取有机相，合并两次有机相；
(4)旋转蒸发收集的有机相，得到花生四烯酸油脂；
其中，所述的生物酶为纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、糖化酶、淀粉酶、蜗牛酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶中的任意一种或几种；
当所加入的生物酶为单一酶时，各种酶的酶解条件如下：
纤维素酶，最适pH为4.5～5.5，最适温度为40～50℃；
木聚糖酶，最适pH为3.5～5.5，最适温度为50～60℃；
果胶酶，最适pH为3.5～4.5，最适温度为50～60℃；
糖化酶，最适pH为4.0～4.5，最适温度为60～62℃；
淀粉酶，最适pH为5.5～6.5，最适温度为50～55℃；
蜗牛酶，最适pH为5.8～7.2，最适温度为37～45℃；
木瓜蛋白酶，最适pH为5.5～6.0，最适温度为45～65℃；
碱性蛋白酶，最适pH为7.5～9.0，最适温度为45～60℃；
中性蛋白酶，最适pH为6.5～7.5，最适温度为45～60℃；
当所加入的生物酶为多种酶时，采用依次向菌体悬浮液中加入单一酶进行酶解的方式，每一种酶都在其最适pH条件和最适反应温度下进行酶解，一种酶的反应结束之后，再加入另外一种酶。
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Citations (4)
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| CN1539982A (zh) * | 2003-10-28 | 2004-10-27 | 华中科技大学 | 花生四烯酸油脂及其微生物发酵生产方法 |
| WO2007091731A1 (en) * | 2006-02-10 | 2007-08-16 | Suntory Limited | Microbial fermentation-based production of phospholipids containing long-chain polyunsaturated fatty acids as their constituents |
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