CN107446963B - 一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法 - Google Patents
一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107446963B CN107446963B CN201610377220.5A CN201610377220A CN107446963B CN 107446963 B CN107446963 B CN 107446963B CN 201610377220 A CN201610377220 A CN 201610377220A CN 107446963 B CN107446963 B CN 107446963B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mortierella alpina
- fermentation
- yield
- growth
- arachidonic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 title claims abstract description 126
- 241000907999 Mortierella alpina Species 0.000 title claims abstract description 81
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 63
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 81
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 81
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000004519 grease Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 13
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 26
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 19
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 12
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 abstract 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 12
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 6
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 4
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020978 long-chain polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，收集高山被孢霉发酵清液，通过亲水性有机溶剂萃取浓缩，筛选获得可调控高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的促进剂，在发酵初期0～48h，将上述促进剂按照0.1‑0.5％比例添加至正常的培养基，制备成条件培养液，接种，28℃培养，发酵结束后，在一些实施例的发酵结果中，生物量43.2g/L、油脂含量61.3％、ARA含量60.7％，ARA产量16.1g/L，发酵周期由192h缩短至168h。该方法简单，有效，促进了高山被孢霉生长，提高了花生四烯酸油脂产率，对于工业化应用具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，更具体的说，涉及一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法。
背景技术
花生四烯酸(ARA)是一种长链多不饱和脂肪酸，具有十分重要的生理功能，是人体自身不能大量合成但又不可缺少的重要营养物质，ARA大量存在于人体视网膜及大脑皮层的神经组织中，是胎儿和婴儿大脑发育的基础，对其智力和认知能力具有促进作用。
通过优化发酵条件提高ARA产量是目前研究的重点，中国专利201310475443.1公开了一种通过诱变及培养基优化提高ARA产量的方法，ARA产量虽有较大提升，但诱变具有随机性，且诱变后的菌株具有遗传不稳定性，易导致回复突变，不易进行工业化应用。中国专利CN201410556081.3公开了一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵生产花生四烯酸油脂的方法，该方法主要通过调控高的溶氧浓度，提高ARA产量，但ARA产量提高的同时也增加了能耗，增加了生产成本。
目前，虽然利用微生物高山被孢霉发酵生产ARA油脂已经实现工业化生产，但其工业化生产过程中仍然存在生产周期长、生产效率低等问题。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供了一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，不增加生产成本的前提下，可显著促进高山被孢霉生长及ARA油脂产率的方法，操作简单，可用于指导工业化生产。
本发明为了解决上述问题，提供的技术方案为：提供了一种促进高山被孢霉生长及ARA油脂产率的方法，包括如下步骤：
S100.进行第一批次的高山被孢霉发酵培养，收集发酵72h之后的发酵清液；
S200.利用亲水性有机溶剂萃取浓缩所述发酵清液，获得促进剂；
S300.在第二批次的高山被孢霉发酵培养过程中，添加所述促进剂至发酵培养基。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，步骤S200中，所述亲水性有机溶剂为正丁醇、二氯甲烷、丙醇中的一种，亲水性有机溶剂与发酵清液体积比为1:1～1:5，萃取时间1～3h，萃取2～3次，合并萃取液，将萃取液旋转蒸发，萃取液浓缩比为1/100～1/200，得所述促进剂。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，所述促进剂用无菌有机滤膜过滤除菌后，4℃密封保存。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，步骤S300中，添加所述促进剂的时间为所述第二批次的高山被孢霉发酵培养进行0～48h时，按照体积比0.1～0.5％添加。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，所述第一批次的高山被孢霉发酵培养和所述第二批次的高山被孢霉发酵培养，均使用高山被孢霉种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，高山被孢霉种子液的制备过程包括：将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉活化制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液。将种子液按照5％～10％的接种量接入无菌发酵培养基，28℃下进行不同批次的高山被孢霉发酵培养。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，步骤S300之后还包括：
S400.所述第二批次的高山被孢霉发酵培养结束后，收集湿菌体，干燥至恒重，破壁，利用亲油性有机溶剂萃取得到富含ARA的油脂。
实施本发明，具有如下有益效果：本发明利用高山被孢霉自身发酵清液制备可调控高山被孢霉生长和ARA油脂产率的促进剂，并重新添加至发酵培养基，制备条件培养液，该条件培养液可显著促进高山被孢霉生长及ARA油脂产率，且该油脂合成促进剂来源于高山被孢霉自身发酵清液，使其附加值大大增加，从而降低了生产成本。该方法操作简单易行，切实有效，为高山被孢霉菌体生长及ARA油脂产率的提高提供了一条全新的思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在无需付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法较佳实施例的流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
图1示出了本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法较佳实施例的流程，如图1所示，包括如下步骤：
S100.进行第一批次的高山被孢霉发酵培养，收集发酵72h之后的发酵清液；
S200.利用亲水性有机溶剂萃取浓缩所述发酵清液，获得促进剂；
S300.在第二批次的高山被孢霉发酵培养过程中，添加所述促进剂至发酵培养基。
其中，第一批次的高山被孢霉发酵培养在第二批次的高山被孢霉发酵培养之前进行。
本发明实例提供促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，具体实现步骤包括：
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉活化制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照5％～10％的接种量接入发酵培养基28℃进行培养，在发酵初期0～48h，添加0.1％～0.5％的体积比添加调控高山被孢霉生长及ARA油脂产率的促进剂，可以一次添加，也可分多次添加，28℃培养；
种子培养基组成成分(g/L)：葡萄糖50.0，酵母粉10.0，硝酸钠3.0，磷酸二氢钾3.0，七水合硫酸镁0.5。
发酵培养基组成成分及浓度(g/L)：葡萄糖100.0，酵母粉5.0，玉米浆3.0，黄豆饼粉2.0，硝酸钠2.0，磷酸二氢钾2.0，七水合硫酸镁0.5。
促进剂制备：利用亲水性有机溶剂，如正丁醇、二氯甲烷、丙醇中的一种，萃取浓缩高山被孢霉的发酵清液，亲水性有机溶剂与发酵清液的萃取比例1:1～1:5，萃取时间1～3h，萃取次数为2～3次，所述的萃取浓缩，旋转蒸发浓缩后的萃取液，浓缩比为1/100～1/200；用0.22μm的无菌有机滤膜过滤除菌后4℃密封保存。
(3)发酵结束后，真空泵抽滤收集湿菌体，60℃烘箱干燥6～8h至恒重，破壁，利用亲油性有机溶剂(30～60沸程石油醚、正己烷等)萃取得到富含ARA的油脂，甲酯化后，气相检测，得到ARA含量。
步骤(3)可采用现有技术，在此不再赘述。
实施例1调控高山被孢霉生长及ARA油脂产率的促进剂制备
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照10％的接种量(v/v)接入发酵培养基，28℃进行培养，发酵周期为192h；
(3)发酵结束后，利用抽滤瓶进行抽滤，获得的湿菌体置于60℃烘箱进行干燥，约需6～8h，至菌体恒重，并称重。
(4)对干燥的菌体进行破壁，称取0.5g破壁菌体，加入3mL的30～60沸程的石油醚进行萃取，离心，去上清，重复该操作两次，合并上清液，旋转蒸发，获得富含ARA的油脂，甲酯化后进行气相检测分析。
发酵结果：生物量38.1g/L，油脂含量56.5％，ARA含量59.4％，ARA产量12.8g/L。
(5)收集步骤(3)的发酵清液，减压蒸馏浓缩后，分别用不同的溶剂(乙酸乙酯、正丁醇、乙醚、石油醚、二氯甲烷、丙醇、二甲苯)萃取，将溶剂旋蒸后浓缩，分别添加至刚配置好发酵培养基，研究结果发现正丁醇、二氯甲烷、丙醇三种溶剂萃取获得的提取物，对于调控高山被孢霉生长及ARA油脂产率效果最佳。促进剂的制备方法如前。通过调整浓缩比、萃取时间、萃取、浓缩比(萃取液体积大，浓缩比越小)，得到的促进剂效果相当。仅以下面方法做示例性说明：分别取60mL发酵清液三份，分别加入30mL正丁醇、二氯甲烷、丙醇萃取2h，分别收集萃取液，相同操作重复3次，合并萃取液，按照常规操作，分别将溶剂进行旋转蒸发，旋转蒸发浓缩后的萃取液浓缩比为1/100，收集浓缩液，用0.22μm的无菌有机滤膜过滤除菌，4℃密封保存，备用。
实施例2调控高山被孢霉生长及ARA油脂产率的促进剂制备
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量(v/v)接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照6％的接种量(v/v)接入装有4L发酵培养基的7L发酵罐，150rpm，通气量1.5vvm，28℃培养；
(3)从高山被孢霉发酵72h开始连续取样，取样时间点72h，96h，120h，144h，168h，至192h发酵结束，分别按照实施例1中步骤(5)的萃取方式，萃取液选用正丁醇，旋转蒸发浓缩后的萃取液，浓缩比为1/200，收集浓缩液，用0.22μm的无菌有机滤膜过滤除菌，4℃密封保存，备用。
实施例3添加促进剂对高山被孢霉生长及ARA油脂产率的调控(摇瓶水平)
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量(v/v)接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照10％的接种量(v/v)接入发酵培养基，在发酵开始0h，24h，48h，分别添加0.1％体积比的实施例1中制备的促进剂，28℃培养，发酵周期为180h；每组实验为5个平行样。
(3)发酵结束后，利用抽滤瓶进行抽滤，获得湿菌体，并将其置于60℃烘箱进行干燥，约需6～8h，至菌体恒重，并称重。
(4)对干燥的菌体进行破壁，称取0.5g破壁菌体，加入3mL的30～60沸程的石油醚进行萃取，离心，去上清，重复该操作两次，合并上清液，旋转蒸发，获得富含ARA的油脂，甲酯化后进行气相检测分析。
发酵结果如表1所示，结果表明，正丁醇、二氯甲烷、丙醇提取物对于高山被孢霉菌体量和油脂量都有明显提高，对ARA合成的调控不显著，结果差异不显著，同时发现促进剂添加时间越早更有利于生物量的积累。
表1不同溶剂提取物添加ARA合成的影响
实施例4添加促进剂对高山被孢霉生长及ARA油脂产率的调控(摇瓶水平)
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量(v/v)接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照10％的接种量(v/v)接入发酵培养基，在发酵开始分别添加0.2％体积比的实施例2中制备的不同发酵时期的油脂合成促进剂，28℃培养，发酵周期为180h；每组实验为5个平行样。
(3)发酵结束后，利用抽滤瓶进行抽滤，获得湿菌体，并将其置于60℃烘箱进行干燥，约需6～8h，至菌体恒重，并称重。
(4)对干燥的菌体进行破壁，称取0.5g破壁菌体，加入3mL的30～60沸程的石油醚进行萃取，离心，去上清，重复该操作两次，合并上清液，旋转蒸发，获得富含ARA的油脂，甲酯化后进行气相检测分析。
发酵结果如表2所示，结果表明，随着培养时间的延长，高山被孢霉发酵液中可调控高山被孢霉生长及ARA油脂产率的促进剂越多，对于高山被孢霉菌体量和油脂量积累都有明显促进作用，综合考虑生产成本和操作难易度，选择高山被孢霉发酵结束时的发酵液进行萃取，制备条件培养液。
表2不同发酵时期的促进剂添加对ARA合成的影响
实施例5添加促进剂对高山被孢霉生长及ARA油脂产率的调控(7L发酵罐)
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量(v/v)接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照6％的接种量(v/v)接入装有4L发酵培养基的7L发酵罐，在发酵开始时即发酵0h，添加0.5％体积比的实施例1中制备的油脂合成促进剂(丙醇提取物)，150rpm，通气量1.5vvm，28℃培养，发酵周期为168h；
(3)发酵结束后，取部分样品利用抽滤瓶进行抽滤，获得湿菌体，并将其置于60℃烘箱进行干燥，约需6～8h，至菌体恒重，并称重。
(4)对干燥的菌体进行破壁，称取0.5g破壁菌体，加入3mL的30～60沸程的石油醚进行萃取，离心，去上清，重复该操作两次，合并上清液，旋转蒸发，获得富含ARA的油脂，甲酯化后进行气相检测分析。
连续发酵三批次，ARA产量较不添加丙醇提取物都有所提高，最优的发酵结果：生物量41.9g/L、油脂含量59.5％、ARA含量61.8％，ARA产量15.4g/L。
实施例6添加促进剂对高山被孢霉生长及ARA油脂产率的调控(100L发酵罐)
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量(v/v)接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)种子液扩大培养
将步骤(1)制备的种子液按照10％的接种量(v/v)接入装有5L种子培养基的10L发酵罐中，搅拌转速150rpm，通气量1.0vvm，28℃培养48h，制备种子扩大培养液。
(3)将种子扩大培养液按照8％的接种量(v/v)接入装有60L发酵培养基的100L发酵罐，在发酵开始时即发酵0h，添加0.5％体积比的依据实施例1中制备的油脂合成促进剂(丙醇提取物)，100rpm，通气量0.8vvm，28℃培养，发酵周期为168h；
(3)发酵结束后，取部分样品利用抽滤瓶进行抽滤，获得湿菌体，并将其置于60℃烘箱进行干燥，约需6～8h，至菌体恒重，并称重。
(4)对干燥的菌体进行破壁，称取0.5g破壁菌体，加入3mL的30～60沸程的石油醚进行萃取，离心，去上清，重复该操作两次，合并上清液，旋转蒸发，获得富含ARA的油脂，甲酯化后进行气相检测分析。
连续发酵三批次，ARA产量较不添加丙醇提取物都有所提高，最优的发酵结果：生物量43.2g/L、油脂含量61.3％、ARA含量60.7％，ARA产量16.1g/L。
需要特殊说明的是，以上技术方案仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做出改动或修改，这些等价形式同样在本申请所附权利要求书所限定的范围之内。
Claims (6)
1.一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S100.进行第一批次的高山被孢霉发酵培养，收集发酵72h之后的发酵清液；
S200.利用亲水性有机溶剂萃取浓缩所述发酵清液，获得促进剂；所述亲水性有机溶剂为正丁醇、二氯甲烷、丙醇中的一种，亲水性有机溶剂与发酵清液体积比为1:1～1:5，萃取液浓缩比为1/100～1/200；
S300.在第二批次的高山被孢霉发酵培养过程中，添加所述促进剂至发酵培养基。
2.根据权利要求1所述的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，步骤S200中，萃取时间1～3h，萃取2～3次，合并萃取液，将萃取液旋转蒸发，得所述促进剂。
3.根据权利要求2所述的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，所述促进剂用无菌有机滤膜过滤除菌后，4℃密封保存。
4.根据权利要求1所述的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，步骤S300中，添加所述促进剂的时间为所述第二批次的高山被孢霉发酵培养进行0～48h时，按照体积比0.1～0.5％添加。
5.根据权利要求1所述的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，所述第一批次的高山被孢霉发酵培养和所述第二批次的高山被孢霉发酵培养，均使用高山被孢霉种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
6.根据权利要求1所述的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，步骤S300之后还包括：
S400.所述第二批次的高山被孢霉发酵培养结束后，收集湿菌体，干燥至恒重，破壁，利用亲油性有机溶剂萃取得到富含ARA的油脂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610377220.5A CN107446963B (zh) | 2016-05-31 | 2016-05-31 | 一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610377220.5A CN107446963B (zh) | 2016-05-31 | 2016-05-31 | 一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107446963A CN107446963A (zh) | 2017-12-08 |
| CN107446963B true CN107446963B (zh) | 2020-06-02 |
Family
ID=60485890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610377220.5A Expired - Fee Related CN107446963B (zh) | 2016-05-31 | 2016-05-31 | 一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107446963B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108315291B (zh) * | 2017-01-17 | 2020-11-03 | 华中科技大学 | 一种高山被孢霉的生长调节剂及发酵方法 |
| CN108034687B (zh) * | 2018-01-11 | 2021-07-09 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种含类胡萝卜素的组合物及含类胡萝卜素的组合物的制备方法 |
| RU2716106C1 (ru) * | 2019-05-13 | 2020-03-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уфимский государственный нефтяной технический университет" | Способ получения полиненасыщенных жирных кислот с высоким содержанием арахидоновой кислоты в липидах воздушного мицелия гриба Mortierella alpina (варианты) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006046943A8 (en) * | 2004-10-22 | 2008-01-10 | Martek Biosciences Corp | Methods for producing lipids by liberation from biomass |
| MY135350A (en) * | 2003-02-06 | 2008-03-31 | Dsm Ip Assets Bv | Isolation of microbial oils |
| CN101870915A (zh) * | 2010-06-30 | 2010-10-27 | 南京工业大学 | 水酶法提取花生四烯酸油脂的工艺 |
| CN102586351A (zh) * | 2012-03-06 | 2012-07-18 | 南京工业大学 | 一种促进花生四烯酸油脂高效积累的方法 |
| CN105112466A (zh) * | 2015-09-23 | 2015-12-02 | 润科生物工程（福建）有限公司 | 添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法 |
-
2016
- 2016-05-31 CN CN201610377220.5A patent/CN107446963B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MY135350A (en) * | 2003-02-06 | 2008-03-31 | Dsm Ip Assets Bv | Isolation of microbial oils |
| WO2006046943A8 (en) * | 2004-10-22 | 2008-01-10 | Martek Biosciences Corp | Methods for producing lipids by liberation from biomass |
| CN101870915A (zh) * | 2010-06-30 | 2010-10-27 | 南京工业大学 | 水酶法提取花生四烯酸油脂的工艺 |
| CN102586351A (zh) * | 2012-03-06 | 2012-07-18 | 南京工业大学 | 一种促进花生四烯酸油脂高效积累的方法 |
| CN105112466A (zh) * | 2015-09-23 | 2015-12-02 | 润科生物工程（福建）有限公司 | 添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 丝状真菌被孢霉生长;金航;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20180115;全文 * |
| 植物油对被孢霉菌发酵生产花生四烯酸的影响;林炜铁等;《现代食品科技》;20071115;第23卷(第11期);全文 * |
| 高山被孢霉产花生四烯酸的代谢研究;毛晓妍等;《油脂化学》;20111020;第36卷(第10期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107446963A (zh) | 2017-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106636235B (zh) | 一种利用微生物发酵生产dha的方法 | |
| WO2017166831A1 (zh) | 一种ω-7脂肪酸合成物及培养黄丝藻生产该合成物的方法与应用 | |
| JP6605179B2 (ja) | ラカンカ懸濁細胞中のモグロシドｖ含有量を高める方法 | |
| CN107446963B (zh) | 一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法 | |
| CN107190026B (zh) | 一种提高红曲菌次级代谢产物的方法 | |
| CN1986822A (zh) | 用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法 | |
| CN102925503B (zh) | 利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法 | |
| CN112481318B (zh) | 儿茶素在提高裂殖壶菌dha油脂产量中的应用 | |
| CN104099385B (zh) | 一种深层液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖的方法 | |
| JP2015012842A (ja) | 焼酎廃水を培地として使用するスクワレン産生藻類の培養方法 | |
| CN107418902A (zh) | 一种香菇发酵用补料培养基及香菇液体深层连续培养方法 | |
| CN103451247B (zh) | 一种花生四烯酸的制备方法 | |
| CN104450809B (zh) | 一种促进裂殖壶菌油脂中dha合成的方法 | |
| CN104860756A (zh) | 一种蛹虫草发酵液体培养基及其制备方法与应用 | |
| CN104894183A (zh) | 一种用珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素p-3的方法 | |
| CN104278107A (zh) | 一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法 | |
| CN101492705A (zh) | 一种平菇多糖的制备方法 | |
| CN113773963A (zh) | 一种高密度高产率的紫球藻培养方法 | |
| WO2021227453A1 (zh) | 一种利用小麦b淀粉生产3-羟基丁酮的工艺方法 | |
| CN104480152B (zh) | 一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法 | |
| CN103981106A (zh) | Dha高产菌株及其应用 | |
| CN109266698B (zh) | 被孢霉属微生物油脂中脂肪酸组合物成分调整的方法 | |
| CN104004082B (zh) | 一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法 | |
| CN101205523A (zh) | 一种酿酒酵母及其在制备β-羟基苯丙酸乙酯中的应用 | |
| CN104450810A (zh) | 一种制备花生四烯酸的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200602 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |