CN104004082B - 一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，包括以下步骤：(1)对大肠杆菌表达重组人白介素-2的工程菌株进行培养；(2)对发酵培养所得菌体进行破菌收集包涵体；(3)对包涵体进行提取和洗涤，得到精制包涵体，所述工程菌株为E.Coli K802(ply-4)，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，均采用含酵母和蛋白胨的无抗生素培养基，采用高压均质机破菌，经过变性，得到高纯度ril-2原液。本发明的生产方法生产周期短，生产效率高，生产规模大，特别适于工业化生产，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法。
背景技术
白细胞介素2(InterLeukin-2，IL-2)是一种T细胞分泌的免疫调节因子，不仅能促进T细胞的增殖，还可增强NK等多种免疫活性细胞的活性，在免疫反应的产生、调节及免疫监视中起重要作用。近年来因其在肿瘤治疗中所起的重要作用而越来越受到人们的关注。自从1983年Taniguchi等首次克隆IL-2cDNA并成功地在猴细胞系COS-7中表达出IL-2以来，许多学者相继在E.coli中表达成功。由于重组白细胞介素2(rIL-2)具有天然IL-2的全部功能，用基因工程方法大量生产IL-2将满足实验室及临床应有的要求。
采用基因工程技术重组ril-2的生物学活性与天然的相似，可以大规模生产，以满足临床需要。但目前可参考的大多以超声破碎技术对所得大肠杆菌进行破碎，得到包涵体，这种做法不适宜大规模生产，而且很难进行工艺的放大，此外在工程菌发酵阶段也多采用50L以下发酵罐，扩大发酵规模会引入多种不稳定及难以控制的因素，导致生产效率不高。
本申请人曾发明过一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法(公开号为CN103233053A)，该方法中公开了一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，包括对大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株进行培养获得包涵体，所述大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株为pKG931/HB101，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，均采用含酵母和蛋白胨的无抗生素培养基，采用高压均质机破菌。此生产方法生产周期短，生产效率高，生产规模大(500L)，特别适于工业化生产，降低了生产成本。特别是对于其中包涵体的提取方法，可收集到纯度较高的包涵体，从而减小了后续纯化的难度。
但是，当申请人采用上述方法，将工程菌种替换为E.Coli K802(ply-4)用以生产白细胞介素-2发酵包涵体时，发现ril-2的表达量很低，不足25％，从而导致所得包涵体的纯度很低，无法满足规模化生产要求。而后申请人根据E.Coli K802(ply-4)的菌种特性，通过正交试验的方法调整了工艺参数，但收效甚微，ril-2的表达量仍然较低，不足30％。产生上述现象的原因尚不明确，可能是由于当生产规模扩大到500L时，发酵过程中不稳定性因素增多，常规技术参数选择对E.Coli K802(ply-4)的适用性不佳。最后，申请人通过大量试验，对上述生产方法的工艺条件、培养基的组分等多方面进行了改进，通过严格控制每步中的生产流程，研发出了一种适用于E.Coli K802(ply-4)的重组人白细胞介素-2发酵包涵体的大规模(500L)提取方法，从而得到了本发明。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，该方法能够生产效率高，尤其是能够适应大规模的发酵包涵体提取。
本发明提供的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，依次包括以下步骤：(1)对大肠杆菌表达重组人白介素-2的工程菌株进行培养；(2)对发酵培养所得菌体进行破菌收集包涵体；(3)对包涵体进行提取和洗涤，得到精制包涵体，所述大肠杆菌表达重组人白介素-2的工程菌株为E.ColiK802(ply-4)，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，其中扩增培养包括以下子步骤：
a.菌种复苏：将工程菌株进行菌种复苏，将种子液接种到液体LB培养基中培养，设定摇床温度为28℃，150r/min，培养10-11小时；
b.一级种子液培养：将复苏后的种子液接种到含液体LB培养基的摇瓶中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养8-9小时；
c.二级种子液培养：将一级种子液按增加1％的体积比方式接种到含30L液体LB的贝朗50L发酵罐中，罐培养控制条件为：转速100-300rpm/min，通气50L/min，罐压0.1-0.2bar，温度32℃，溶氧不低于50％，培养3-5小时，至OD600值至为1.0-2.0时结束培养，取样镜检观察无杂菌，菌种形态正常，即为发酵罐培养用种子；
所述发酵罐培养包括如下子步骤：
a.发酵前的准备：采用贝朗公司500L发酵罐，将发酵培养基浓缩液接入发酵罐并定容至500L，设定灭菌温度120℃，25min，发酵罐自动在线灭菌；
b.发酵罐培养：灭菌后，待培养基温度降到25℃时，将种子罐中二级种子液通过管道接种到500L发酵罐中，发酵罐培养控制条件为：培养温度从25℃逐渐升温至30℃，升温速率为5℃/h，在30℃下培养1.5小时后，于1小时内匀速逐渐升温至33℃，并在33℃下培养1小时后开始诱导表达；发酵培养过程通过调节转速、通气量及罐压等将溶氧控制在30％以上，各参数调节范围为：转速200—450r/min、通气量100-400L/min、罐压0.1-0.3bar；
c.诱导发酵：诱导温度为42℃，诱导3.5小时，结束发酵，经离心收集发酵产物。
所述LB培养基的组份及其配比为：10g/L酵母粉+10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠。
所述发酵培养基浓缩液的组份及其配比为：3000g酵母粉+3000g蛋白胨+1500g葡萄糖+1520g NaH2PO4+565g Na2HPO4。该培养基不含有抗生素且对培养基组分进行了最大幅度的优化，节约了生产成本。
上述发酵罐培养子步骤b和c中，通过补加氨水控制PH为6.0-7.0，诱导后即开始补料，补料速度为每小时补加补料培养基2L。
所述发酵补料培养基的组份及其配比为：100g/L酵母粉+100g/L蛋白胨。
所述步骤(3)中包涵体提取和包涵体洗涤子步骤为：
a.包涵体提取：用10mmol/LPB-0.15mol/LNaCl-1mmol/LEDTA(pH＝7.5)溶液构成的重组人白介素-2发酵菌裂解液将菌体悬浮，利用APV高压均质机加压到500-600bar进行匀浆破碎，高压匀浆破菌两遍，释放包涵体，破菌率大于98％，然后用管式离心机连续流离心的方法收集ril-2包涵体；
b.包涵体洗涤：先用25mmol/L Tris-HCl+2M尿素溶液+0.5％曲拉通X-100重组人白介素-2包涵体洗涤液将沉淀离心洗涤2次，再用纯化水将沉淀离心洗涤2次，洗涤过程离心收集沉淀，得精制ril-2包涵体。
上述方法还包括步骤(4)对精制包涵体进行变性处理：用20mmol/LTris-HCl－10mmol/L DTT－8mol/L尿素将ril-2包涵体进行溶解，然后离心收集上清液。
本发明提供的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，具有如下有益效果：
(1)本发明采用了逐步升温与恒温发酵相结合的方式，对发酵过程中的温度及时间进行严格控制，并选取了合理的其他工艺参数及培养基组分，从而使E.Coli K802(ply-4)在大规模发酵下ril-2的表达量达到了55％以上，保证了ril-2包涵体能够进行大批量生产；
(2)通过合理的配比对培养基的组分进行了大幅简化，并仍保证了培养基的培养效果，节约了生产成本。
(3)利用APV高压匀质机对细菌进行破碎，既能提高单位时间的处理量，又能使破菌率达到99％以上；采用高速管式离心机进行离心，既提高了效率，又提高了蛋白的回收率，得到纯度达到80％以上的包涵体溶液。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本发明的重组白细胞介素2大规模提取方法，包括步骤:(1)选用工程菌株为E.Coli K802(ply-4)发酵培养；(2)对发酵培养所得菌体进行高压匀浆破碎；(3)采用高速管式离心机进行粗包涵体的收集，然后对所收集的粗包涵体进行洗涤精制，得到高纯度的包涵体；(4)对精制包涵体进行变性溶解，得到包涵体溶解液。
上述各步骤的具体技术方案如下：
(1)选用工程菌E.Coli K802(ply-4)进行发酵培养
本步骤又包括种子扩增培养和发酵罐培养，所述种子扩增培养包括以下子步骤：
a.菌种复苏：从菌种保存库中取出一支重组白细胞介素2表达的E.ColiK802(ply-4)工作种子进行菌种复苏，将种子液按2％的体积比接种到含5ml液体LB培养基的10ml试管中培养，设定摇床温度为28℃，150r/min，培养10-11小时；所述液体LB的配方为：10g/L酵母粉+10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠；
b.一级种子液培养：将复苏后的种子液按2％的体积比接种到含100ml液体LB培养基的500ml摇瓶中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养8-9小时；
c.二级种子液培养：将一级种子液按1％的体积比接种到含30L液体LB的贝朗50L发酵罐中，罐培养控制条件为：转速100-300rpm/min，通气50L/min，罐压0.1-0.2bar，温度32℃，溶氧不低于50％(通过控制发酵罐转速、通气、罐压保持溶氧不低于30％)，培养3-5小时，至OD600值至为1.0-2.0时结束培养，取样镜检观察无杂菌，菌种形态正常，即为发酵罐培养用种子。
所述发酵罐培养包括以下子步骤：
a.发酵前的准备：采用贝朗公司500L发酵罐，将PH电极、溶氧电极校正和安装好；将发酵培养基浓缩液接入发酵罐并定容至500L，设定灭菌温度120℃，25min，发酵罐自动在线灭菌；所述发酵培养基的配方为：3000g酵母粉+3000g蛋白胨+1500g葡萄糖+1520g NaH2PO4+565g Na2HPO4加纯化水定容至300L；
b.发酵罐培养：灭菌后，待培养基温度降到25℃时，将种子罐中二级种子液通过管道接种到500L发酵罐中，发酵罐培养控制条件为：培养温度从25℃匀速逐渐升温至30℃，升温速率为5℃/h，在30℃下培养1.5小时后，于1小时内匀速逐渐升温至33℃，并在33℃下培养1小时后开始诱导表达；发酵培养过程通过调节转速、通气量及罐压等将溶氧控制在30％以上，各参数调节范围为：转速200—450r/min、通气量100-400L/min、罐压0.1-0.3bar.
c.诱导发酵：诱导温度为42℃，诱导3.5小时，结束发酵，经离心收集发酵产物，平均湿菌体收率可达30-50g/L，经SDS-PAGE电泳扫描，其重组人白介素-2蛋白占菌体总蛋白的55％，收集到的发酵湿菌体可以在-20℃的冰箱中保存。
上述发酵罐培养子步骤b和c中，通过补加氨水控制PH为6.0-7.0，诱导后即开始补料，补料速度为每小时补加补料培养基2L。发酵补料培养基的配方为：100g/L酵母粉+100g/L蛋白胨。
(2)对发酵培养所得菌体进行高压匀浆破碎，以及
(3)对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体
上述两个步骤的子步骤为：
a.包涵体提取：用10mmol/LPB-0.15mol/LNaCl-1mmol/LEDTA(pH＝7.5)溶液构成的重组人白介素-2发酵菌裂解液将菌体悬浮，利用APV高压均质机加压到500-600bar进行匀浆破碎，高压匀浆破菌两遍，释放包涵体，破菌率大于98％，采用GQ145型高速管式离心机离心收集rIL-2包涵体，离心转速14000r/min，进行连续流离心，离心结束后收集包涵体沉淀，-20℃保存；
b.包涵体洗涤：先用25mmol/L Tris-HCl+2M尿素溶液+0.5％曲拉通X-100重组人白介素-2包涵体洗涤液将沉淀离心洗涤2次，再用纯化水将沉淀离心洗涤2次，洗涤过程离心收集沉淀，得精制ril-2包涵体。
(4)对精制包涵体进行变性溶解，得到包涵体溶解液：
用20mmol/L Tris-HCl－10mmol/L DTT－8mol/L尿素将ril-2包涵体进行溶解，然后离心收集上清液，收集的上清即为重组人白介素-2包涵体蛋白溶液，经SDS-PAGE电泳扫描，结果显示纯度达到85％以上。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于，发酵罐培养温度为30℃，培养时间为4小时。经SDS-PAGE电泳扫描，其重组人白介素-2蛋白占菌体总蛋白的25％。
对比例2
对比例1与实施例1的区别仅在于，发酵罐培养时间为3.5小时，培养温度为32℃。经SDS-PAGE电泳扫描，其重组人白介素-2蛋白占菌体总蛋白的24％。
对比例3
对比例1与实施例1的区别仅在于，发酵罐培养时间为4小时，培养温度为31℃。经SDS-PAGE电泳扫描，其重组人白介素-2蛋白占菌体总蛋白的26％。
以上对本发明所提供的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰。这些改进和修饰也应当落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (5)
1.一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，依次包括以下步骤：(1)对大肠杆菌表达重组人白介素-2的工程菌株进行培养；(2)对发酵培养所得菌体进行破菌收集包涵体；(3)对包涵体进行提取和洗涤，得到精制包涵体，其特征在于：所述大肠杆菌表达重组人白介素-2的工程菌株为E.ColiK802(ply-4)，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，其中扩增培养包括以下子步骤：
a.菌种复苏：将工程菌株进行菌种复苏，将种子液接种到液体LB培养基中培养，设定摇床温度为28℃，150r/min，培养10-11小时；
b.一级种子液培养：将复苏后的种子液接种到含液体LB培养基的摇瓶中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养8-9小时；
c.二级种子液培养：将一级种子液按1％的体积比接种到含30L液体LB的贝朗50L发酵罐中，罐培养控制条件为：转速100-300r/min，通气50L/min，罐压0.1-0.2bar，温度32℃，溶氧不低于50％，培养3-5小时，至OD600值为1.0-2.0时结束培养，取样镜检观察无杂菌，菌种形态正常，即为发酵罐培养用种子；
所述发酵罐培养包括如下子步骤：
a.发酵前的准备：采用贝朗公司500L发酵罐，将发酵培养基浓缩液接入发酵罐并定容至500L，设定灭菌温度120℃，25min，发酵罐自动在线灭菌；所述发酵培养基浓缩液的组份及其配比为：3000g酵母粉+3000g蛋白胨+1500g葡萄糖+1520g NaH2PO4+565g Na2HPO4；
b.发酵罐培养：灭菌后，待培养基温度降到25℃时，将二级种子液通过管道接种到500L发酵罐中，发酵罐培养控制条件为：培养温度从25℃逐渐升温至30℃，升温速率为5℃/h，在30℃下培养1.5小时后，于1小时内匀速逐渐升温至33℃，并在33℃下培养1小时后开始诱导表达；发酵培养过程通过调节转速、通气量及罐压将溶氧控制在30％以上，各参数调节范围为：转速200—450r/min、通气量100-400L/min、罐压0.1-0.3bar；
c.诱导发酵：诱导温度为42℃，诱导3.5小时，结束发酵，经离心收集发酵产物。
2.根据权利要求1所述的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，其特征在于，所述LB培养基的组份及其配比为：10g/L酵母粉+10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠。
3.根据权利要求1所述的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，其特征在于，上述发酵罐培养子步骤b和c中，通过补加氨水控制PH为6.0-7.0，诱导后即开始补料，补料速度为每小时补加发酵补料培养基2L；所述发酵补料培养基的组份及其配比为：100g/L酵母粉+100g/L蛋白胨。
4.根据权利要求1所述的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中包涵体提取和包涵体洗涤子步骤为：
a.包涵体提取：用10mmol/LPB-0.15mol/LNaCl-1mmol/LEDTA溶液构成的重组人白介素-2发酵菌裂解液将菌体悬浮，利用APV高压均质机加压到500-600bar进行匀浆破碎，高压匀浆破菌两遍，释放包涵体，破菌率大于98％，然后用管式离心机连续流离心的方法收集rIL-2包涵体；所述重组人白介素-2发酵菌裂解液的pH＝7.5；
b.包涵体洗涤：先用重组人白介素-2包涵体洗涤液将沉淀离心洗涤2次，再用纯化水将沉淀离心洗涤2次，洗涤过程离心收集沉淀，得精制rIL-2包涵体；所述重组人白介素-2包涵体洗涤液为25mmol/L Tris-HCl+2M尿素溶液+0.5％曲拉通X-100。
5.根据权利要求1所述的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，其特征在于，还包括步骤(4)对精制包涵体进行变性处理：用20mmol/LTris-HCl－10mmol/L DTT－8mol/L尿素将rIL-2包涵体进行溶解，然后离心收集上清液。
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Citations (1)
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
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| 人白细胞介素-2在大肠杆菌高效表达及其纯化与鉴定;虞建良等;《中国科学B辑》;19951031;第25卷(第10期);第1063-1070页 * |
| 白介素2工程菌的分批培养及高效表达;边疆等;《军事医学科学院院刊》;19930915;第17卷(第03期);第174-179页 * |
| 重组人白细胞介素-2制备工艺的研究;李伟;《生物技术》;19971220;第7卷(第06期);第7-10页 * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Cheng Dusheng Inventor after: Sang Jianbin Inventor after: Lv Jianlong Inventor after: Han Mingdi Inventor after: Long Yingguo Inventor before: Cheng Dusheng Inventor before: Sang Jianbin Inventor before: Lv Jianlong Inventor before: Han Mingdi Inventor before: Long Yingguo |