CN102965419A - 一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺 - Google Patents

Abstract

一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，其特征是，所述的发酵上罐按8％(v/v)接种量，通气量1vvm搅拌转速设为250r/min，发酵培养温度34度，初始pH值控制在7.2；当OD600达到6-7时，pH值控制为7.4，溶氧DO 20％，升温至42度加诱导剂诱导4小时，完成发酵周期。本发明工艺具有高稳定表达特点，同时提高了重组人生长激素工程菌的蛋白表达，提高了发酵设备和原料的利用率。可延长发酵周期。增大放罐体积、提高发酵罐的利用率、降低发酵液残糖浓度、将单罐总产量提高20％左右。

Description

一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺

【技术领域】

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高密度、高表达的重组人生长激素发酵优化工艺。

【背景技术】

人生长激素(hGH)是人内源性激素，由人脑垂体前叶合成分泌的一种非糖基化蛋白质，由191个氨基酸组成，分子量为22Kd.具有调节代谢、刺激蛋白质合成加速脂肪降解等生理功能，能促进骨骼和肌肉的生长发育，目前治疗儿童因内源性重组人生长激素缺乏或不足导致的身体矮小特效药，又因能促进伤口愈合，也用于损伤、严重烧伤的治疗和外科手术中。

最初生长激素是从牛和猪脑垂体中提取出来的，治疗效果不佳，并且有发热、过敏等副作用。化学合成的方法效率低，没有实用价值，因此采用基因工程方法大规模生产人生长激素是满足临床大量需求的主要手段。目前人生长激素已经分别在大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞中获得成功表达。虽然真核表达系统中重组人生长激素(rhGH)的活性高，但产量低、生产成本高，无法满足临床的大量需求。大肠杆菌由于生长周期短、表达量高、成本经济而成为目前重组人生长激素(rhGH)生产的主要表达系统。

现有技术的重组人生长激素发酵工艺，其重组人生长激素工程菌的蛋白表达率较低，发酵设备和原料的利用率不高。

【发明内容】

为解决以上不足，本发明提供一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，该工艺通过发酵温度和PH等的控制工艺优化，提高重组人生长激素工程菌的蛋白表达，提高发酵设备和原料的利用率。

本研究主要运用大肠杆菌Pet30a(⁺)表达载体，菌种为BL21(DE3)，对人生长激素进行胞间质可溶性表达，并通过大量试验优化工程菌的培养条件，以期实现工程菌的稳定培养和高水品表达，为重组人生长激素(rhGH)的大规模生产提供了条件。

高密度发酵在能获得较高生物量的同时，还可以显著的提高目的基因表达产物浓度。影响高密度发酵的因素有很多，首先培养温度是影响菌体生长和调控细胞代谢的主要因素之一。较高的温度有利于细菌高密度发酵，低温培养能提高重组产物的表达量，而且在不同的培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量，并缩短培养周期；其次溶解氧的浓度过低或过高都会影响细菌的生理代谢，适当的溶氧水平有利于菌体的生长和产物的合成，因此有必要考察发酵目标产物的临界溶氧浓度和最佳溶氧浓度，并控制发酵过程中溶氧浓度在最适范围内；另外诱导时间也是必须考虑的问题。此外还有Ph、培养基组分、比生长速率等影响因素。

本发明所采用的技术方案是：一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，所述的发酵优化工艺如下：

1)菌种培养：配制菌种培养基，接入构建基因工程菌E.coliBL21-HGH进行菌种培养，获得液体发酵菌种；

2)配制发酵培养基：以LB培养基为基础，置入发酵罐中，加入糖及无机盐，加入水，调节PH值。得到发酵培养基；

3)发酵：将上述所得发酵培养基灭菌之后，按8％(v/v)接种量接入步骤1)所得液体发酵菌种，通气量1vvm，搅拌转速设为250r/min，发酵培养温度34度，培养基pH值7.4；进入对数生长期后，控制溶氧浓度至少在20％，当pH值降至7.0时候，通过流加26％(v/v)氨水使得pH值维持在7.2-7.4。；当OD600达到6-7时，升温至42度加入诱导剂诱导4小时；

4)收集菌种：将发酵液接入管式离心机，得到菌种，破碎后分离纯化得到目标蛋白。

作为优选，所述的一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，其特征是，所述的发酵上罐按8％(v/v)接种量，通气量1vvm搅拌转速设为250r/min，发酵培养温度34度，初始pH值控制在7.2；当OD600达到6-7时，pH值控制为7.4，溶氧DO 20％，升温至42度加诱导剂诱导4小时，完成发酵周期。

作为优选，所述的一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，其特征是，初始培养温度设为34度，pH值为7.2时，当分批发酵结束后，进入补料发酵阶段，采用近指数流加方式，控制比生产速率在0.25/h。

作为优选，所述的一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，其特征是，所述的溶氧DO通过调整搅拌转速及空气流量，将DO分别控制为20％。

本发明有益效果：本发明生产工艺简便，便于推广，同时利用周质腔分泌表达，具有较高生物活性；周质腔中蛋白水解酶相对较少，提高了重组蛋白的稳定性；消除了被分泌蛋白对细胞本身毒性作用；表达蛋白易于后续的分离纯化，使大规模重组人生长激素表达为可能。本发明工艺具有高稳定表达特点，同时提高了重组人生长激素工程菌的蛋白表达，提高了发酵设备和原料的利用率。可延长发酵周期。增大放罐体积、提高发酵罐的利用率、降低发酵液残糖浓度、将单罐总产量提高20％左右。

为使更进一步了解本发明的特征和技术内容，详见本发明附图和实施方式，然而所示附图和实施方式仅供参考与说明用，并非是对本发明加以限制。

【附图说明】

图1，本发明发酵罐PH值影响图；

图2，本发明30L发酵罐不同PH各时间段诱导OD600测量值；

图3，本发明发酵培养温度影响图；

图4，本发明实施例2温度诱导方案一效果图；

图5，本发明实施例2温度诱导方案二效果图；

【具体实施方式】

下面结合附图和具体实施例对本发明做详细说明：

实施例1，PH值额定优化，三角瓶培养测定PH法：将100mlLB液体培养的pH分别调至6.0、6.5、7.0和8.0加入终浓度为100ug/ml的青霉素，按照5％的接种量接种种子培养液后，34度，200r/min震荡培养12小时，定时取样测OD600.

发酵罐测定PH法：培养温度设定为34度，初始PH值为7.2，当分批发酵结束后，进入补料阶段，采用近指数流加方式，控制生长速率在0.25/h，培养3小时后升温至42度诱导，PH分别控制在7.1、7.2、7.3、7.4、7.5，定时测定OD600.

通过三角瓶培养取样测OD600，实验结果表明PH值为7.5时对菌株发酵最后合适，同时通过对30L罐进行了中试生产，中试检测结果表明PH值7.4，菌株生长最为旺盛，见附图1和2.

实施例2，发酵温度的优化，将100mlLB液体培养基按照5％的接种量接种后分别在33、35、36、37度摇床振荡培养至OD600 0.6-0.8后，升至42度诱导表达。

摇瓶诱导表达前生长温度的确定：在一定的温度范围内，苗体生长速率随温度的增高而增大，发酵周期缩短，因而在实践中，在以不降低外源蛋白表达量的前提下，尽可能提高菌体生长温度。分别在34、35、36、37度，摇床振荡培养至OD600 0.6-0.8后，升至42度诱导表达。，SDS-PAGE分析表达结果如图3所示。

随着温度的提高，菌体密度达到OD600 0.6-0.8所需时间从4小时缩短到2小时，外源蛋白的表达量由下降的趋势。因而在采用温度表达型载体表达外源蛋白时，前期菌体生长阶段温度应控制在较低的温度(34度)，从而提高目标蛋白的表达量。在发酵罐发酵表达时，在控制菌体生长速率的前提下可考虑适当增加前期菌体生长阶段的温度，以缩短发酵周期。

摇瓶表达诱导时间的确定：在34度摇床200r/min振荡培养OD600 0.6-0.8后，采用两种方案进行诱导表达；方案(一)升温至42度诱导1小时，然后降温至39度继续诱导4小时。方案(二)升温至42度诱导5小时；诱导前取样，诱导后每小时取样1瓶，结果如图4、5所示。

采用方案(一)表达时，在1-3小时内，HGH的表达量随着时间的延长呈上升趋势，时间再延长表达量不再增加。采用30-42度表达时，在1-5小时内，HGH的表达量随着时间的延长呈上升趋势，时间继续延长表达量不再增加。

实施例3，一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，使用100升发酵罐，工作体积70升中试发酵表达rhGH.

1.摇菌培养阶段优化结果：改良的LB培养基70L，8％(v/v)接种量，通气量1vvm，搅拌转速设250r/min，培养温度32-34度，培养基pH7.2-7.4，DO＞20％。

2.诱导阶段优化结果：OD600＞6，诱导温度42度，诱导时间4小时，

DO＞20％，Ph7.4.

实施例4，一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，发酵优化工艺下：菌种培养：配制菌种培养基，接入构建基因工程菌E.coli BL21-HGH进行菌种培养，获得液体发酵菌种；配制发酵培养基：以LB培养基为基础，置入发酵罐中，加入糖及无机盐，加入水，调节PH值。得到发酵培养基；发酵：将上述所得发酵培养基灭菌之后，按8％(v/v)接种量接入步骤1)所得液体发酵菌种，通气量1vvm，搅拌转速设为250r/min，发酵培养温度34度，培养基pH值7.4；进入对数生长期后，控制溶氧浓度至少在20％，当pH值降至7.0时候，通过流加26％(v/v)氨水使得pH值维持在7.2-7.4。；当OD600达到6-7时，升温至42度加入诱导剂诱导4小时；收集菌种：将发酵液接入管式离心机，得到菌种，破碎后分离纯化得到目标蛋白。

本发明生产工艺简便，便于推广，同时利用周质腔分泌表达，具有较高生物活性；周质腔中蛋白水解酶相对较少，提高了重组蛋白的稳定性；消除了被分泌蛋白对细胞本身毒性作用；表达蛋白易于后续的分离纯化，使大规模重组人生长激素表达为可能。本发明工艺具有高稳定表达特点，同时提高了重组人生长激素工程菌的蛋白表达，提高了发酵设备和原料的利用率。可延长发酵周期。增大放罐体积、提高发酵罐的利用率、降低发酵液残糖浓度、将单罐总产量提高20％左右。

然而上述仅本发明较佳可行的实施例而已，非因此局限本发明保护范围，依照上述附图和实施例所作各种变形或套用均在此技术方案保护范围之内。

Claims (4)

1.一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，所述的发酵优化工艺如下：

1)菌种培养：配制菌种培养基，接入构建基因工程菌E.coliBL21-HGH进行菌种培养，获得液体发酵菌种；

2)配制发酵培养基：以LB培养基为基础，置入发酵罐中，加入糖及无机盐，加入水，调节PH值。得到发酵培养基；

3)发酵：将上述所得发酵培养基灭菌之后，按8％(v/v)接种量接入步骤1)所得液体发酵菌种，通气量1vvm，搅拌转速设为250r/min，发酵培养温度34度，培养基pH值7.4；进入对数生长期后，控制溶氧浓度至少在20％，当pH值降至7.0时候，通过流加26％(v/v)氨水使得pH值维持在7.2-7.4；当OD600达到6-7时，升温至42度加入诱导剂诱导4小时；

4)收集菌种：将发酵液接入管式离心机，得到菌种，破碎后分离纯化得到目标蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，其特征是，所述的发酵上罐按8％(v/v)接种量，通气量1vvm搅拌转速设为250r/min，发酵培养温度34度，初始pH值控制在7.2；当OD600达到6-7时，pH值控制为7.4，溶氧DO 20％，升温至42度加诱导剂诱导4小时，完成发酵周期。

3.根据权利要求1所述的一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，其特征是，初始培养温度设为34度，pH值为7.2时，当分批发酵结束后，进入补料发酵阶段，采用近指数流加方式，控制比生产速率在0.25/h。

4.根据权利要求1所述的一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺，其特征是，所述的溶氧DO通过调整搅拌转速及空气流量，将DO分别控制为20％。

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