EA015498B1 - Способ получения г-ксф человека - Google Patents
Способ получения г-ксф человека Download PDFInfo
- Publication number
- EA015498B1 EA015498B1 EA200870320A EA200870320A EA015498B1 EA 015498 B1 EA015498 B1 EA 015498B1 EA 200870320 A EA200870320 A EA 200870320A EA 200870320 A EA200870320 A EA 200870320A EA 015498 B1 EA015498 B1 EA 015498B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- csf
- concentration
- ions
- preceding paragraphs
- production
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения Г-КСФ с высоким выходом за счет значительного увеличения стабильности плазмиды, индуцированной солями, во время фазы продуцирования.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения Г-КСФ с высоким выходом, с использованием плазмиды с высокой стабильностью, индуцированной солью, в фазе продуцирования.
Предпосылки изобретения
Лечение цитокином, гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ) значительно улучшает качество жизни пациентов с тяжелой хронической нейтропенией [1оие8 е! а1. 1АМА 270: 11321133 (1993)]. Г-КСФ представляет собой мощный эндогенный элемент запуска высвобождения нейтрофилов из запасов костного мозга и их активации для усиленной антимикробной активности. Г-КСФ широко рассматривался в различных доклинических моделях острых заболеваний, как правило, с многообещающими результатами [Магкйа11 1.С. Моск 24: 120-9 (2005)]. Благодаря его доказанной эффективности в циклах химиотерапии Г-КСФ является важным биофармацевтическим лекарственным средством, используемым в онкологии. Г-КСФ клонирован и экспрессирован в различных типах клеток, например бактериальных клетках |8оиха Б.М. 8с1епсе 232: 61-65 (1986); Ни Ζ.Υ. е! а1. Ζΐιοηββΐιο 8йепдйиа Уао\\и Ζηζΐιί (1999), 20: 55-57], дрожжевых клетках [Бакшк Μ.Α. е! а1. Бю1есЬпо1. Вюепд. 81: 768-774 (2003); Бее 8.М. е! а1. Когеап ра!еп! КН 160934 В1 19981116], клетках риса [Нопд е! а1. Рто!ет Ехрг РипГ. ЕриЬ айеаб оГ ρτίηΐ (2005)], клетках кошачьих [Уашашо!о е! а1. Оепе 274: 263-269 (2001)], клетках яичника китайского хомячка [Мопасо Ь. е! а1. Оепе. 180:145-150 (1996)], клетках насекомых [8Ыпка1 е! а1. Рто!еш Ехрг РипГ. 10: 379-385 (1997)] и даже трансгенных коз [Ко 1.Н. е! а1. Ттапкдешс Кек. 9: 215-22 (2000)]. Для фармацевтического использования Г-КСФ преимущественно получают в ЕксйепсЫа сой [1еукеуат 8. е! а1. Вю!есйпо1. Ргод. 21: 632-639 (2005)], где он продуцируется как тела включений, которые представляют собой нерастворимые агрегаты рекомбинантного белка в ненативной конформации [Вапеух Б. & Мщаск М. №1!иге Вю!ес11по1. 22: 1399-1408 (2004)], которые, как правило, не обладают биологической активностью [Ве^ηа^беζ С.Е. Сигг. Орш. Вю!ес11по1. 9: 157-163 (1998)]. Также опубликован способ его секреторного получения [1еопд К.1. & Бее 8.Υ. Рто!ет Ехрг РипГ. 23: 311-318 (2001); Бее 8.Υ. е! а1. Мебюбк Мо1. Вю1. 308: 31-42 (2005)]. Секреторная экспрессия приводит, как правило, к высвобождению в периплазматическое пространство или внеклеточную среду Г-КСФ в надлежащем образом свернутой форме, но выходы его много меньше выходов, получаемых с телами включения. Поэтому с коммерческой точки зрения выгоднее экспрессировать Г-КСФ как тела включения в Е. соб. Надлежащим образом свернутый биологически активный белок Г-КСФ легко получают из тел включения коммерчески приемлемым способом, с использованием процесса денатурации и ренатурации после отделения и растворения тел включения [Кибо1рй К., 1п Рто!еш Епдтееппд: Рппс1р1ек и Ртасбсе; С1е1апб, 1.Б., Сга1к, 8.С, Ебк.; ХУПеу-Ыкк. 1пс.: Ыете Уогк, 1996; рр 283-298; Ка!1юге Α.8. е! а1. 1. Рйагт. Вютеб. Апа1. 32:1199-1211 (2003)].
Одним из наиболее эффективных способов получения рекомбинантных белков в Е. сой является способ культивирования с подпиткой, который можно выполнять в циклическом или в нециклическом режиме. Нециклический процесс менее сложный и поэтому более пригоден для промышленного производства. Действительно, в уровне техники описан один из наивысших выходов Г-КСФ в способе культивирования с подпиткой, который находится в диапазоне от 4,2 до 4,4 г/л [У1т 8.С. е! а1. Вюртосекк апб Вюкук!етк Епдшееппд (2001), 24, 249-254]. Выполнение ферментации с подпиткой в циклическом режиме, для получения более высокого совокупного выхода, приводит к высокой нестабильности плазмиды [Сйо1 8.-1. е! а1. 1. МютоЬю1. Вю!есйпо1. 10: 321-326 (2000)], при этом ограничивая устойчивость процесса.
Как правило, для того чтобы иметь высокую экспрессию продукта, необходимо поддерживать внехромосомную плазмиду, содержащую ген продукта, внутри клетки в надлежащем состоянии.
Как правило, это достигается селекционным воздействием на рекомбинантный микроорганизм путем добавления подходящего антибиотика к культуральной жидкости. Было описано увеличение уровня экспрессии Г-КСФ за счет добавления каждые 1-2 ч антибиотика (ампициллина) во время ферментации для уменьшения сегрегационной нестабильности рекомбинантного штамма (Кпуора1оуа Ο.Ν. е! а1. Кикк1ап Ра!еп! КН 2158303 С2 20001027). Нормативное требование о подтверждении очистки конечного продукта от антибиотика ограничивает его использование. Широкое использование антибиотиков также может с большей вероятностью привести к нежелательному воздействию на окружающую среду. Но уменьшение создаваемого антибиотиками селекционного воздействия часто приводит к уменьшению стабильности плазмиды и уровней экспрессии, что ставит под угрозу устойчивость процесса. Следовательно, ограничение использования антибиотика с увеличением стабильности плазмиды и уровня экспрессии, особенно в фазе образования продукта, представляет собой техническую проблему. Кроме того, низкая стабильность плазмиды в течение фазы образования продукта также может быть обусловлена метаболическим стрессом [8атак^а! V. е! а1. БЕМ8 М1стоЬю1. Бей. 179: 367-373 (1999)] и может приводить к низким уровням экспрессии [Сйепд С. е! а1. Вю!есйпо1. Вюепд. 56: 23-31 (1997)], обычно в культурах большого объема.
Кроме обусловленного антибиотиком селекционного воздействия стабильность плазмиды может быть улучшена на уровне конструкции вектора [8сйетебет Т. е! а1. Арр1. МютоЬю1. Вю!есйпо1. 38:91-93 (1992); Рап 8.Н. и Ма1сот В.А. Вю!ес11пк|иек. 29:1234-1238 (2000)]. В процессе культивирования она может быть улучшена подбором условий культивирования, такими как избежание недостатка подачи пита
- 1 015498 тельных веществ |8ιηί11ι & ВИосйка Сап. 1. МюгоЬю1. 44: 351-355 (1998)]. При проведении крупномасштабных ограничиваемых субстратом способов культивирования с подпиткой ограничение/недостаток подачи питательных веществ неизбежны, и добавление антибиотика слишком часто или в больших количествах представляет собой нецелесообразное и затратное решение для обеспечения высокого выхода продукта и высокой стабильности плазмиды в процессе с низкой степенью комплексности. Следовательно, существует очевидная необходимость разработки альтернативного способа получения Г-КСФ с высоким объемным выходом за счет поддержания высокой стабильности плазмиды, используя простой и устойчивый процесс.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение описывает нециклический способ культивирования с подпиткой для получения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) с высоким объемным выходом в Е5с11спс1иа сой за счет поддержания высокой стабильности плазмиды в культуре с использованием ионов калия в сочетании с ионами магния или натрия в высоких концентрациях в среде продуцирования и в культуральной жидкости.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показано влияние использования высоких концентраций катионов калия и натрия в фазе образования продукта на стабильность плазмиды, содержащей ген Г-КСФ, в клетках ВЬ21 (ΌΕ3) в момент сбора партии. Партия 2 получена при высокой концентрации солей калия и натрия, тогда как партия 1 получена в отсутствии высокой концентрации солей калия или натрия в фазе образования продукта. Партии получены раздельно в 30-л ферментере.
На фиг. 2 показано влияние использования высоких концентраций катионов калия и натрия в фазе образования продукта на объемный выход Г-КСФ в полученных партиях. Партия 2 получена при высокой концентрации солей калия и натрия, тогда как партия 1 получена в отсутствие высокой концентрации солей калия или натрия в фазе образования продукта. Партии получены раздельно в 30-л ферментере.
На фиг. 3 показано влияние использования высокой концентрации катионов магния и калия в фазе образования продукта на стабильность плазмиды, содержащей ген Г-КСФ, в клетках ВЬ21 (ΌΕ3) во время сбора партии. Партия 4 получена при высокой концентрацией соли магния, тогда как для партии 3 в фазе образования продукта не использовали высокую концентрацию магния. Обе партии получены при высокой концентрация соли калия раздельно в 30-л ферментере.
На фиг. 4 показано влияние использования высокой концентрации катионов магния и натрия на объемный выход Г-КСФ в полученных партиях. Партию 4 получали при высокой концентрации соли магния, тогда для партии 3 не использовали высокую концентрацию соли магния в фазе образования продукта. Обе партии получены при высокой концентрации соли калия раздельно в 30-л ферментере.
На фиг. 5 показано влияние использования высокой удельной скорости роста в фазе образования продукта на объемный выход Г-КСФ в собранных партиях. Во время фазы образования продукта средняя удельная скорость роста для партии 4 составляла приблизительно 0,04 л/ч, тогда как средняя удельная скорость роста для партии 5 составляла приблизительно 0,07 л/ч. Обе партии получены при высокой концентрации солей калия и магния, раздельно в 30-л ферментере.
На фиг. 6 показано влияние использования высокой концентрации тиамина в фазе образования продукта на объемный выход в полученных партиях. Во время фазы образования продукта партия 1 содержала 7 г/л тиамина в продуцирующей среде, тогда как партия 6 получена без использования тиамина в среде продуцирования. Обе партии получены раздельно в 30-л ферментере.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к улучшенному способу ферментации для производства гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) с улучшенным уровнем объемного выхода. Оно также раскрывает условия культивирования для улучшенной стабильности плазмиды, что в дальнейшем приводит к высокому объемному выходу Г-КСФ. Способ по изобретению включает нециклический способ культивирования с подпиткой с использованием многократных индукций, выполняемый в присутствии высокой концентрация калия, в сочетании с другими неорганическими солями, такими как натриевые, магниевые и т.п., в высоких концентрациях в продуцирующей среде. Как ни удивительно, когда такой способ, использующий соли по настоящему изобретению, как детально описано здесь, использовали в сочетании с высокой удельной скоростью роста, он все еще поддерживал высокую стабильность плазмиды, ведущую к дополнительному увеличению объемного выхода.
Настоящее изобретение дополнительно подробно описано ниже.
Можно использовать любой полипептид, относящийся к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (также именуемому здесь Г-КСФ). Термин гранулоцитарный колониестимулирующий фактор или Г-КСФ относится к природному Г-КСФ, белку, появляющемуся в результате мутаций, фрагментам, синтетическим конструкциям, его аналогам и производным или демонстрирующему по меньшей мере 60% биологической или рецепторсвязывающей активности как природного чГ-КСФ или сохраняющему по меньшей мере приблизительно 80% аминокислотной идентичности. Примеры таких последовательностей включают последовательность из СепЬапк ГО 01:27437048 и последовательности, описанные в патенте США № 4810643.
- 2 015498
Клетки Е^еНспеЫа сой трансформированы подходящим экспрессирующим вектором, содержащим кодирующую последовательность Г-КСФ и подходящий промотор, выбранный из 17, 1ас и подобных промоторов наряду с другими компонентами вектора, используя способы трансформации, хорошо известные в данной области техники.
В описанном ниже способе ферментация относится к анаэробному выращиванию микроорганизмов, предпочтительно рекомбинантных Е. сой, для получения Г-КСФ. В таком способе загрузочная фаза выращивания относится к периоду, в котором после засева в культуральную жидкость в ферментере не добавлено никакое питательное вещество кроме гидроксида аммония (если требуется). Культуральная жидкость представляет собой суспензию клеток, сред и производных сред и клеток (если таковые имеются). Фаза роста в способе культивирования с подпиткой, ограничиваемом субстратом, относится к той части фазы роста, в которой основное увеличение биомассы (по меньшей мере 2 удвоения) происходит при добавлении среды для выращивания с подпиткой к культуральной жидкости таким образом, что лимитирующей является концентрация основного источника углерода/энергии (например, глюкозы). Расход указанной среды определяет удельную скорость роста культуры. Преиндукционная среда относится к среде с составом, отличным от среды для выращивания, которая добавлена к культуральной жидкости перед добавлением индуктора (например, 1РТС). Индукция представляет собой процесс существенного увеличения концентрация Г-КСФ в клетках, как определено средствами, известными из уровня техники, при добавлении индуктора (например, 1РТС и лактозы). Среда продуцирования имеет состав, отличный от среды для выращивания, и добавляется к культуральной жидкости в ферментере во время индукции гена Г-КСФ. Среду продуцирования также добавляли таким способом, что концентрация субстрата (например, глюкозы) оставалась ограничивающей. Расход среды продуцирования определяет удельную скорость роста культуры на фазе продуцирования.
Клетки-хозяева Е. сой, предварительно трансформированные подходящим вектором экспрессии, кодирующим Г-КСФ, первоначально культивировали при 37°С в колбе-качалке, чтобы вырастить посевной материал для ферментера. Культуру посевного материала использовали для засева стерильной среды для выращивания в ферментере. Режим фазы роста ферментации с подпиткой, ограничиваемой субстратом, начинают, как только начинает расти культура рекомбинантных Е. сой и концентрация глюкозы в культуральной жидкости падает до 0,5 г/л или менее. Подача среды для выращивания в процессе с подпиткой, добавляемой в режиме подпитки, ограничиваемой субстратом, поддерживается непрерывной (экспоненциальная или постоянная скорость) или прерывистой во время фазы роста. После достижения плотности клеток 1-60 г/л сухой массы клеток и концентрации глюкозы в культуральной жидкости менее чем 0,5 г/л добавление препродуцирующих сред завершают, а затем начинают и продолжают подачу сред продуцирования непрерывным или прерывистым, ограничиваемым субстратом, образом. Многократные индукции гена Г-КСФ выполняют 1РТС. Среднюю удельную скорость роста не уменьшают во время или после добавления индуктора. Значение рН поддерживают приблизительно равным 5-7. Температуру поддерживают приблизительно равной 30-42°С. После от 2 до 48 ч добавления препродуцирующей среды среду для культивирования удаляют и подвергают последующей обработке согласно способам, известным в данной области техники.
Среда фазы роста содержит источники углерода и энергии, выбранные из группы, включающей глюкозу, глицерин и т.п., или их смеси, комплексные компоненты среды выбраны из группы, включающей дрожжевой экстракт, триптон, пептон, продукт ферментативного гидролиза казеина, продукт гидролиза соевого казеина и т.п., или их смеси, подходящие соли/питательные вещества выбраны из группы, включающей лимонную кислоту, хлорид калия, хлорид натрия, сульфат магния, гидрофосфат диаммония, дигидрофосфат калия, бутират натрия, тиамин, глицин и хлорид цинка.
Другие условия ферментации, такие как аэрация, перемешивание, посевная культура, время засева и т.п., все выбраны для удобства как известные из уровня техники.
Среда препродукции включает комплексные компоненты среды, выбранные из экстракта дрожжей, триптона, пептона, продуктов ферментативного гидролиза казеина, продуктов гидролиза соевого казеина, наряду с питательными веществами, такими как тимин, глицин и т.п. или их смесей; антибиотики, такие как канамицин, ампициллин и т. п. Подходящие соли выбирают из группы, включающей лимонную кислоту, хлорид калия, хлорид натрия, сульфат магния, гидрофосфат диаммония, дигидрофосфат калия, бутират натрия и хлорид цинка, таким образом, чтобы среда содержала высокий уровень концентрации ионов К в сочетании с ионами или Ыа, или Мд.
Среда продуцирования содержит источник углерода в дополнение к компонентам среды препродукции. Подходящий источник углерода можно выбрать из группы, состоящей из глицерина, глюкозы, фруктозы и т.п. или их смесей. Предпочтительный источник углерода по настоящему изобретению представляет собой глюкозу. Во время фазы продуцирования культуральную жидкость поддерживают с высоким уровнем ионов К в сочетании с ионами или Ыа, или Мд. Концентрацию в культуральной жидкости ионов К поддерживают от приблизительно 60 до приблизительно 300 мМ, ионов Να от приблизительно 60 до приблизительно 300 мМ и ионов Мд от приблизительно 150 до приблизительно 250 мМ. В предпочтительном варианте осуществления концентрация ионов К составляет от 90 до 150 мМ, концентрация
- 3 015498 ионов Να составляет от 60 до 120 мМ и концентрация ионов Мд в культуральной жидкости находится в диапазоне от 180 до 220 мМ.
В дополнительном варианте осуществления добавление тимина в высокой концентрации (в диапазоне от 5 до 10 г/л) обеспечивает выход Г-КСФ в диапазоне 5-6 г/л.
Способ по настоящему изобретению приводит к получению Г-КСФ с высоким выходом (5-9,5 г/л) с поддержанием высокой стабильности плазмиды на всем протяжении фазы роста и продуцирования (7590%).
Пример 1. Влияние высокой концентрации ионов Να и К на стабильность плазмиды и объемный выход.
Эксперимент выполняли в 30-л ферментере. Посевной материал клеток Е. со11 ВЬ21 (ЭЕ3), трансформированных с геном Г-КСФ человека, засевали в среду для выращивания следующего состава.
Концентрация перед засевом
Компонент
КН2РО4 | 13, 3 | г/л |
(ΝΗΗ 2НРО4 | 4,0 | г/л |
Дрожжевой экстракт | 1,0 | г/л |
Глюкоза | 10, 0 | г/л |
Лимонная кислота | 1,7 | г/л |
МдЗО4 7Н2О | 1,2 | г/л |
Раствор микроэлементов | 20,0 | мл/л |
Канамицин 50 мг/л
Раствор неорганических микроэлементов
Компонент
ГеС13·6Н2О
ΖηΟ12·4Н2О
СоС12· 6Н2О
Ν32Μο04·2Η20
СаС12-2Н20
СцС12
Н3ВО3
Концентра имя
0,162 г/л 0,0144 г/л
0,12 г/л
0,012 г/л
0,006 г/л
1,9 г/л
0,5 г/л
Добавление следующей среды для выращивания способом культивирования с подпиткой в режиме культивирования, лимитируемым субстратом, привело к основному увеличению биомассы Компонент Концентрация
Глюкоза 700 г/л
Мд8О4 7Н2О | 20 г/л |
Раствор микроэлементов | 20 мл/л |
Канамицин | 500 мг/л |
В фазе роста гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН в диапазоне от 6,8 до 7,0. Температуру поддерживали при 37°С. После достижения оптической плотности приблизительно 50 ед.погл. (при 600 нм) в партии 2 в культуральную жидкость добавляли среду преиндукции, состоящую из следующих компонентов:
Компонент
Дрожжевой экстракт
Хлорид калия
Хлорид натрия
Тиамина гидрохлорид
Концентрация
84,38 г/л
75,41 г/л
123,13 г/л
8,44 г/л
Конечная концентрация катионов калия и натрия в культуральной жидкости составляла приблизительно 120 и 250 мМ соответственно.
Затем начинали подачу следующей среды продуцирования:
Компонент Концентрация
Глюкоза 270 г/л
- 4 015498
Мд5О4 · 7Н2О
Дрожжевой экстракт
Тиамина гидрохлорид
Хлорид калия
Хлорид натрия г/л
214 г/л г/л
8,94 г/л (только в Партии 2)
17,5 г/л (только в Партии 2)
Экспрессию гена Г-КСФ индуцировали многократными добавлениями стерилизованного фильтрованием раствора 1РТС к культуральной жидкости. В фазе продуцирования гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН 6,8. Температуру поддерживали при 37°С. Для создания селекционного воздействия к культуре добавляли канамицин. Количество канамицина, использованного во время фазы продуцирования для партии 2 (37,5 мг, добавлен однократно), составляло приблизительно 1% от количества использованного в партии 1 (2925 мг, многократные добавления), для того чтобы тщательно проверить влияние солей на стабильность плазмиды.
Стабильность плазмиды определяли сначала асептическим отбором образца готовой партии в стерильную пробирку и асептическим распределением подходящего объема соответствующего разведенного образца по среде Луриа-Бертани с канамицином (50 мг/л) и без. Чашки Петри инкубировали при 37°С в течение 48 ч и чашки, имевшие статистически значимые колонии, подвергали учету. Величина, полученная делением количества колоний, полученных на канамицинсодержащих чашках, на количество колонией в чашках, не содержащих канамицин, использовали для того, чтобы вычислить стабильность плазмиды. Стабильность плазмиды в партии 2 (96,8%) была более чем вдвое выше по сравнению со стабильностью плазмиды в партии 1 (45,0%), тем самым показывая важность катионов натрия и калия в улучшении стабильности плазмиды (фиг. 1).
Объемный выход Г -КСФ, как определено денситометрическим измерением полосы Г-КСФ по сравнению со стандартной кривой аутентичного стандарта после 8Ό8-ΡΆΟΕ, составлял 5,38 г/л в партии 1 и 5,81 г/л в партии 2. Объемный выход в партии 2 был приблизительно на 8% выше, чем в партии 1 (фиг. 2).
Пример 2. Влияние высокой концентрации магния и калия на стабильность плазмиды и объемный выход.
Эксперимент выполняли в 30-л ферментере. Так как среды фазы продуцирования обеих партий (партии 3 и партии 4) были идентичны, включая концентрации катиона калия, кроме только концентрации катиона магния, результаты отражали влияние сочетания катионов калия и магния. Посевной материал клеток Ε. сой ВЬ21 (ΌΕ3), трансформированных с геном Г-КСФ человека, засевали в среды для выращивания следующего состава.
Компонент
Концентрация перед засевом
КН2РО4 | 13,3 | г/л |
(ΝΗ4) 2НРО4 | 4,0 | г/л |
Дрожжевой экстракт | 1,0 | г/л |
Глюкоза | 10, 0 | г/л |
Лимонная кислота | 1,7 | г/л |
МдЗОг 7Н2О | 1,2 | г/л |
Раствор микроэлементов | 20, 0 | мл/л |
мг/л
Канамицин
Раствор неорганических микроэлементов
Компонент
Концентрация
ЕеС13·6Н2О
0,
162 г/л
ΖηΟ12·4Η2Ο
0144 г/л
СоС12-6Н2О г/л
ИагМо04*2Н20
0,
012 г/л
СаС12-2Н2О
006 г/л
СиС12 г/л
Н3ВО3
0, г/л
Добавление следующей среды для выращивания способом культивирования с подпиткой в режиме культивирования, лимитируемым субстратом, обусловливало основное увеличение биомассы
- 5 015498
Компонент
Глюкоза
Мд5О4 · 7Нг0
Концентрация
700 г/л г/л
Раствор микроэлементов
Канамицин мл/л
500 мг/л
В фазе роста гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН в диапазоне от 6,8 до 7,0. Температура поддерживалась при 37°С. После достижения оптической плотности приблизительно 50 ед.погл. (при 600 нм) среду преиндукции, состоящую из следующей смеси, добавляли в культуральную жидкость
Компонент
Дрожжевой экстракт
Хлорид калия
Тиамина гидрохлорид
Сульфат магния
Концентрация
84.38 г/л
75,44 г/л
8.38 г/л
187,06 г/л (только в Партии 4)
Затем начинали подачу следующей среды продуцирования
Компонент
Глюкоза
Концентрация
270 г/л
Сульфат магния
Сульфат магния
Дрожжевой экстракт г/л (только в Партии 3)
50,3 г/л (только в Партии 4)
214 г/л
Тиамина гидрохлорид г/л
Хлорид калия
8,94 г/л
Экспрессию гена Г-КСФ индуцировали многократными добавлениями к культуральной жидкости стерилизованного фильтрацией 1РТС. В фазе продуцирования гидроксид аммония использовали как регулятор рН, чтобы поддерживать рН 6,8. Температуру поддерживали при 37°С. Для того чтобы создать селекционное воздействие, к культуре добавляли канамицин. Равное количество канамицина (37,5 мг, добавлен однократно) использовали в фазе продуцирования. Концентрация в культуральной жидкости катионов калия и магния во время фазы продуцирования составляла приблизительно 120 и 200 мМ соот ветственно.
Стабильность плазмиды определяли, как описано выше. Стабильность плазмиды в партии 4 (97,3%) была приблизительно на 6% выше, чем стабильность плазмиды в партии 3 (91,8%), таким образом показывая эффективность катионов калия и магния в улучшении устойчивости плазмиды (фиг. 3). Стабильность плазмиды, полученная в присутствии катионов магния и калия, была на 116,2% выше, чем в партии 1 (в отсутствие высокой концентрации солей в фазе продуцирования).
Объемный выход Г-КСФ, как определяли денситометрическим количественным анализом полосы ГКСФ по отношению к стандартной кривой аутентичного стандарта, после 8Ό8-ΡΆΟΕ, составил 5,48 г/л в партии 3 и 8,35 г/л в партии 4 (фиг. 4). Объемный выход в партии 4 был на приблизительно 55% выше, чем в партии 1.
Пример 3. Влияние высокой скорости удельного роста во время фазы продуцирования на объемный выход.
Эксперимент выполнили в 30-л ферментере. Среды фазы продуцирования обеих партий (партии 4 и партии 5) были идентичными, включая концентрации катионов калия и магния. Средняя удельная скорость роста во время фазы продуцирования для партии 5 была выше, чем в фазе продуцирования для партии 4. Посевной материал, клетки Ε. сой ВЬ21 (ΌΕ3), трансформированные с геном Г-КСФ человека, засевали в среды для выращивания следующего состава.
Компонент
Концентрация перед засевом
КН2РО4 | 13,3 | г/л |
(ΝΗ4)2ΗΡΟ4 | 4,0 | г/л |
Дрожжевой экстракт | 1,0 | г/л |
Глюкоза | 10,0 | г/л |
Лимонная кислота | 1,7 | г/л |
МдЗО4-7Н2О | 1,2 | г/л |
Раствор микроэлементов | 20,0 | мл/л |
Канамицин | 50 мг/л |
- 6 015498
Раствор неорганических микроэлементов Компонент
ЕеС13’6Н2О
ΖηΟ12·4Η2Ο
СоС12-6Н20
Ыа2Мо04-2Н20
СаС12'2Н2О
СиС12
Н3ВО3
Концентрация
0,162 г/л
0,0144 г/л
О,12 г/л
0,012 г/л
0,006 г/л
1,9 г/л
0,5 г/л
Добавление следующей среды для выращивания способом культивирования с подпиткой в режиме культивирования, лимитируемым субстратом, обуславливало основное увеличение биомассы
Компонент Концентрация
Глюкоза 700 г/л
МдЗО4‘7Н2О | 20 г/л |
Раствор микроэлементов | 20 мл/л |
Канамицин | 500 мг/л |
В фазе роста гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН в диапазоне от 6,8 до 7,0. Температуру поддерживали при 37°С. После достижения оптической плотности приблизительно 50 ед.погл. (при 600 нм) в культуральную жидкость добавляли среду преиндукции, имеющую следующий состав:
Компонент
Концентрация
Дрожжевой экстракт | 84,38 г/л |
Хлорид калия | 75,44 г/л |
Тиамина гидрохлорид | 8,38 г/л |
Сульфат магния
Затем начинали подачу следующей среды продуцирования
Компонент
Глюкоза
Сульфат магния
Дрожжевой экстракт
Тиамина гидрохлорид
Хлорид калия
187,06 г/л
Концентрация
270 г/л
50,3 г/л
214 г/л г/л
8,94 г/л
Экспрессию гена Г-КСФ индуцировали многократными добавлениями стерилизованного фильтрацией раствора ΙΡΤ6 к культуральной среде. В фазе продуцирования гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН 6,8.
Температуру поддерживали при 37°С. Для создания селекционного воздействия к культуре добавляли канамицин. Эквивалентное количество канамицина (37,5 мг, добавлен однократно) использовали во время фазы продуцирования. Средняя удельная скорость роста во время фазы продуцирования в партии 4 составила приблизительно 0,04 л/ч, тогда как в партии 5 составила приблизительно 0,07 л/ч.
Объемный выход Г-КСФ, определенный, как описано ранее, составил 8,35 г/л в партии 4 и 9,94 г/л в партии 5. Объемный выход в партии 5 был примерно на 19% выше, чем выход в партии 4 (фиг. 5). Стабильность плазмиды в образцах, взятых в конце процесса из обеих партий, была высокой (>75%).
Пример 4. Влияние использования высокой концентрации тиамина в фазе продуцирования на объемный выход.
Эксперимент выполняли в 30-л ферментере. Посевную культуру клеток Е. сой ВЬ21 (ΌΕ3), трансформированных геном Г-КСФ человека, засевали в среду для выращивания следующего состава.
- 7 015498
Компонент | Концентрация перед |
КН2РО4 | 13,3 г/л |
(ΝΗ4)2ΗΡΟ4 | 4,0 г/л |
Дрожжевой экстракт | 1,0 г/л |
Глюкоза | 10,0 г/л |
Лимонная кислота | 1,7 г/л |
Мд504-7Н20 | 1,2 г/л |
Раствор микроэлементов | 20,0 мл/л |
Канамицин
СиС12
НзВОз
Ампициллин
Раствор неорганических микроэлементов
Добавление следующей среды для выращивания способом культивирования с подпиткой в режиме культивирования, лимитируемым субстратом, обуславливало основное увеличение биомассы Компонент Концентрация
Глюкоза
МдЗО4- 7Н2О
700 г/л г/л
Раствор микроэлементов мл/л
Канамицин
500 мг/л {В Партии 1)
Ампициллин мг/л культуральной жидкости при каждом добавлении
ТОЛЬКО В
Партии 6. Суммарно сделали шесть добавлений во время фазы рост при культивировании с подпиткой
В фазе роста гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН приблизительно 6,8. Температуру поддерживали при 37°С. После достижения оптической плотности приблизительно 50 ед.погл. (при 600 нм) начинали подачу следующей среды продуцирования
Компонент Концентрация
Глюкоза
МдЗО4- 7Н2О
270 г/л г/л
Дрожжевой экстракт
214 г/л
Тиамина гидрохлорид г/л (Только в Партии 1)
Канамицин
2,925 г (добавлен несколько раз в Партии 1) г (добавлен несколько раз в Партии 6)
2,689
Ампициллин
Экспрессию гена Г-КСФ индуцировали многократными добавлениями стерилизованного фильтрацией раствора 1РТС к культуральной среде. В фазе продуцирования гидроксид аммония использовали как регулятор рН, чтобы поддерживать рН 6,8. Температуру поддерживали при 37°С.
Объемный выход Г-КСФ определяли, как описано выше.
Объемный выход в партии 1 в образце, взятом в конце процесса (партия с высокой концентрацией тиамина), был приблизительно на 10,7% выше, чем выход в партии 6 (4,86 г/л), таким образом, показывая эффективность высокой концентрации тиамина в улучшении объемного выхода Г-КСФ (фиг. 6).
- 8 015498
Преимущества заявленного способа:
(1) более высокий объемный выход делает возможным больший выход при меньшем масштабе, ограничивая, таким образом, капитальные расходы на увеличение масштаба;
(2) высокий объемный выход достигнут, используя компоненты сред (магний, калий и соли магния) с очень низкой стоимостью;
(3) культура, обладающая высокой стабильностью плазмиды, более способна для увеличения объемного выхода Г-КСФ в метаболически напряженных условия, таких как экспрессия гена Г-КСФ в условиях высокой удельной скорости роста.
Claims (13)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения высокого объемного выхода гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) при ферментации в культуральной жидкости, где культуральная жидкость получает непрерывную подпитку ионами К в диапазоне концентрации от 60 до 180 мМ в комбинации с высокой концентрацией неорганических катионов, выбранных из Να или Мд.
- 2. Способ по п.1, где концентрация ионов Να находится в диапазоне от 90 до 300 мМ и ионов Мд находится в диапазоне от 150 до 250 мМ.
- 3. Способ по п.1 или 2, где культуральная жидкость включает комплексные компоненты среды, выбранные из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, триптона, пептона, ферментативного гидролизата казеина и гидролизата соевого казеина.
- 4. Способ по любому из пп.1-3, где способ представляет собой лимитируемый субстратом процесс культивирования с подпиткой.
- 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где многократные индукции гена выполнены во время фазы продуцирования.
- 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где культуральная жидкость дополнительно содержит источник(и) углерода, выбранный из глюкозы, глицерина и фруктозы.
- 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где средняя удельная скорость роста поддерживается постоянной между фазами продуцирования и препродуцирования.
- 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где концентрация ионов К составляет от 90 до 150 мМ, ионов Να от 60 до 120 мМ и ионов Мд от 180 до 220 мМ.
- 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стабильность плазмиды составляет по меньшей мере 75%.
- 10. Способ улучшения стабильности плазмиды Г-КСФ добавлением ионов К в диапазоне от 60 до 180 мМ в культуральную жидкость в режиме непрерывной подпитки.
- 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где концентрация антибиотика в фазе продуцирования ниже, чем концентрация, использованная в фазе роста.
- 12. Способ получения Г-КСФ, включающий стадии:ί) засева ферментера подходящей культурой Е. сой, предварительно трансформированной подходящим экспрессирующим вектором, кодирующим Г-КСФ;ίί) выполнения фазы роста в периодическом режиме культивирования или культивирования с подпиткой для увеличения биомассы;ϊϊΐ) добавления подходящей среды преиндукции;ίν) добавления подходящей среды продуцирования в режиме культивирования с подпиткой, лимитируемом субстратом, в котором осуществляются многократные индукции гена;где конечная концентрация ионов К, Να и Мд в культуральной жидкости представляет собой концентрацию, указанную в одном или нескольких предшествующих пунктов.
- 13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где объемный выход Г-КСФ находится в диапазоне от 5 до 9,5 г/л.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IN309MU2006 | 2006-03-06 | ||
PCT/IN2007/000105 WO2007102174A2 (en) | 2006-03-06 | 2007-03-05 | Process for preparing human g-csf |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200870320A1 EA200870320A1 (ru) | 2009-02-27 |
EA015498B1 true EA015498B1 (ru) | 2011-08-30 |
Family
ID=38436804
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200870320A EA015498B1 (ru) | 2006-03-06 | 2007-03-05 | Способ получения г-ксф человека |
EA201100718A EA022782B1 (ru) | 2006-03-06 | 2007-03-05 | Способ получения г-ксф человека |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201100718A EA022782B1 (ru) | 2006-03-06 | 2007-03-05 | Способ получения г-ксф человека |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8021862B2 (ru) |
EP (2) | EP1994138B1 (ru) |
JP (2) | JP4927103B2 (ru) |
KR (1) | KR101176794B1 (ru) |
CN (2) | CN102776261B (ru) |
AP (2) | AP3142A (ru) |
AU (1) | AU2007224331B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0707078A2 (ru) |
CA (1) | CA2642654C (ru) |
DK (2) | DK2182007T3 (ru) |
EA (2) | EA015498B1 (ru) |
HK (2) | HK1127617A1 (ru) |
MX (1) | MX2008011407A (ru) |
MY (1) | MY149168A (ru) |
NZ (2) | NZ596111A (ru) |
PL (2) | PL1994138T3 (ru) |
WO (1) | WO2007102174A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200806978B (ru) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL2201120T3 (pl) * | 2007-09-21 | 2014-05-30 | Cadila Healthcare Ltd | Systemy białek fuzyjnych GCSF odpowiednie do wysokiej ekspresji peptydów |
WO2011086447A2 (en) | 2010-01-12 | 2011-07-21 | Lupin Limited | Fermentation process for the preparation of recombinant heterologous proteins |
CN108103243A (zh) * | 2018-01-04 | 2018-06-01 | 哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司 | 一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用 |
CN114350588B (zh) * | 2021-12-31 | 2024-03-15 | 山东新时代药业有限公司 | 一种rhG-CSF的发酵培养基及其发酵方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0459630A2 (en) * | 1990-04-30 | 1991-12-04 | Zeneca Limited | Polypeptides |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2591235C (en) * | 2004-12-20 | 2014-03-11 | Cadila Healthcare Limited | Process for preparing high levels of interferon beta |
-
2007
- 2007-03-05 MX MX2008011407A patent/MX2008011407A/es active IP Right Grant
- 2007-03-05 NZ NZ596111A patent/NZ596111A/xx not_active IP Right Cessation
- 2007-03-05 EP EP07736565.8A patent/EP1994138B1/en active Active
- 2007-03-05 MY MYPI20083266A patent/MY149168A/en unknown
- 2007-03-05 CN CN201210265322.XA patent/CN102776261B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-03-05 CA CA2642654A patent/CA2642654C/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-03-05 AU AU2007224331A patent/AU2007224331B2/en not_active Ceased
- 2007-03-05 DK DK10153219.0T patent/DK2182007T3/da active
- 2007-03-05 KR KR1020087022969A patent/KR101176794B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2007-03-05 PL PL07736565T patent/PL1994138T3/pl unknown
- 2007-03-05 AP AP2012006440A patent/AP3142A/xx active
- 2007-03-05 JP JP2008557902A patent/JP4927103B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-03-05 WO PCT/IN2007/000105 patent/WO2007102174A2/en active Application Filing
- 2007-03-05 DK DK07736565.8T patent/DK1994138T3/da active
- 2007-03-05 CN CN2007800080771A patent/CN101410410B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-03-05 PL PL10153219T patent/PL2182007T3/pl unknown
- 2007-03-05 BR BRPI0707078-0A patent/BRPI0707078A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-03-05 NZ NZ571337A patent/NZ571337A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-03-05 US US12/280,496 patent/US8021862B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-03-05 EA EA200870320A patent/EA015498B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-03-05 AP AP2008004592A patent/AP2647A/xx active
- 2007-03-05 EP EP10153219.0A patent/EP2182007B1/en not_active Not-in-force
- 2007-03-05 EA EA201100718A patent/EA022782B1/ru not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-08-13 ZA ZA200806978A patent/ZA200806978B/xx unknown
-
2009
- 2009-08-13 HK HK09107452.7A patent/HK1127617A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-11-23 US US12/952,277 patent/US8492120B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-08-17 JP JP2011178332A patent/JP5460660B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-04-02 HK HK13103987.4A patent/HK1176645A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0459630A2 (en) * | 1990-04-30 | 1991-12-04 | Zeneca Limited | Polypeptides |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
CHOI SEUNG-JIN ET AL.: "Plasmid stability in long-term hG-CSF production using L-arabinose promoter system of Escherichia coli" JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 10, no. 3, June 2000 (2000-06), pages 321-326, XP008083145 ISSN: 1017-7825 cited in the application the whole document * |
FATEMI SEYED SAFA-ALI ET AL.: "Selection of a suitable strain from recombinant Escherichia coli strains with the same genetic structure expressing periplasmic hGM-CSF". JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 96, no. 6, December 2003 (2003-12), pages 578-580, XP002449225 ISSN: 1389-1723 the whole document * |
JEONG KI JUN ET AL.: "Secretory production of human granulocyte colony-stimulating factor in Escherichia coli" PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 23, no. 2, 2001, pages 311-318, XP002263043 ISSN: 1046-5928 cited in the application the whole document * |
JEVSEVAR S. ET AL.: "Production of nonclassical inclusion bodies from which correctly folded protein can be extracted" BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol. 21, no. 2, March 2005 (2005-03), pages 632-639, XP002426305 ISSN: 8756-7938 cited in the application the whole document * |
YIM S.C. ET AL.: "High-level secretory production of human granulocyte-colony stimulating factor by fed-batch culture of recombinant Escherichia coli" BIOPROCESS AND BIOSYSTEMS ENGINEERING, vol. 24, no. 4, November 2001 (2001-11), pages 249-254, XP002449223 ISSN: 1615-7591 cited in the application the whole document, page 250, left-hand column, line 13 - right-hand column, line 21 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102132132B1 (ko) | 재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법 | |
JPS60217898A (ja) | 異種タンパス質の製造方法 | |
CN102154189A (zh) | 一种rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法 | |
HUE027035T2 (hu) | Eljárások csont morfogenetikus fehérjék termelésének fokozására | |
CN106566795A (zh) | 用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒dna的培养基及培养方法 | |
CN116535494A (zh) | 一种重组类人源ⅲ型胶原蛋白及其应用 | |
EA015498B1 (ru) | Способ получения г-ксф человека | |
CN110066331B (zh) | 一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法 | |
CN104152515A (zh) | 一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基及发酵方法 | |
CN111378711A (zh) | 重组蛛丝蛋白的产业化生产方法 | |
CN108251375B (zh) | 一种发酵生产重组人白介素-12的方法 | |
JPH10113095A (ja) | ミジンコの培養方法 | |
CN112063562A (zh) | 一种高效表达超螺旋质粒dna的大肠杆菌发酵方法 | |
CN105695385B (zh) | 重组人胰岛素基因工程菌高表达株筛选培养基及制备方法 | |
RU2321424C1 (ru) | ПРЕПАРАТ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pSX70, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГРАНУЛОЦИТ-КОЛОНИЙСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА (Г-КСФ), ШТАММ Escherichia coli SX70-ПРОМЫШЛЕННЫЙ ШТАММ ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО Г-КСФ И СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ Г-КСФ | |
SU1703690A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 22, кодирующа синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии РSеUDомоNаS Sp. -продуцент- интерферона @ -11 человека | |
EA013263B1 (ru) | Способ получения интерферона-бета | |
KR100429331B1 (ko) | 재조합 효모를 이용한 에스에이치엘케이엔-1 단백질의대량생산방법 | |
CN108265061B (zh) | 一种大规模制备重组人成纤维细胞生长因子21(fgf21)的生产方法 | |
CN1289781A (zh) | 截短型人胰岛素样生长因子-ⅰ及其制备方法 | |
RU2486248C2 (ru) | Способ биосинтеза l-лизина | |
CN85102303A (zh) | 生产干扰素的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |
|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY RU |