EA015498B1 - Способ получения г-ксф человека - Google Patents

Способ получения г-ксф человека Download PDF

Info

Publication number
EA015498B1
EA015498B1 EA200870320A EA200870320A EA015498B1 EA 015498 B1 EA015498 B1 EA 015498B1 EA 200870320 A EA200870320 A EA 200870320A EA 200870320 A EA200870320 A EA 200870320A EA 015498 B1 EA015498 B1 EA 015498B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
csf
concentration
ions
preceding paragraphs
production
Prior art date
Application number
EA200870320A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200870320A1 (ru
Inventor
Санджив Кумар Мендиратта
Вибхор Сарасват
Панкадж Р. Пател
Original Assignee
Кадила Хелзкэр Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Кадила Хелзкэр Лимитед filed Critical Кадила Хелзкэр Лимитед
Publication of EA200870320A1 publication Critical patent/EA200870320A1/ru
Publication of EA015498B1 publication Critical patent/EA015498B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/68—Stabilisation of the vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения Г-КСФ с высоким выходом за счет значительного увеличения стабильности плазмиды, индуцированной солями, во время фазы продуцирования.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения Г-КСФ с высоким выходом, с использованием плазмиды с высокой стабильностью, индуцированной солью, в фазе продуцирования.
Предпосылки изобретения
Лечение цитокином, гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ) значительно улучшает качество жизни пациентов с тяжелой хронической нейтропенией [1оие8 е! а1. 1АМА 270: 11321133 (1993)]. Г-КСФ представляет собой мощный эндогенный элемент запуска высвобождения нейтрофилов из запасов костного мозга и их активации для усиленной антимикробной активности. Г-КСФ широко рассматривался в различных доклинических моделях острых заболеваний, как правило, с многообещающими результатами [Магкйа11 1.С. Моск 24: 120-9 (2005)]. Благодаря его доказанной эффективности в циклах химиотерапии Г-КСФ является важным биофармацевтическим лекарственным средством, используемым в онкологии. Г-КСФ клонирован и экспрессирован в различных типах клеток, например бактериальных клетках |8оиха Б.М. 8с1епсе 232: 61-65 (1986); Ни Ζ.Υ. е! а1. Ζΐιοηββΐιο 8йепдйиа Уао\\и Ζηζΐιί (1999), 20: 55-57], дрожжевых клетках [Бакшк Μ.Α. е! а1. Бю1есЬпо1. Вюепд. 81: 768-774 (2003); Бее 8.М. е! а1. Когеап ра!еп! КН 160934 В1 19981116], клетках риса [Нопд е! а1. Рто!ет Ехрг РипГ. ЕриЬ айеаб оГ ρτίηΐ (2005)], клетках кошачьих [Уашашо!о е! а1. Оепе 274: 263-269 (2001)], клетках яичника китайского хомячка [Мопасо Ь. е! а1. Оепе. 180:145-150 (1996)], клетках насекомых [8Ыпка1 е! а1. Рто!еш Ехрг РипГ. 10: 379-385 (1997)] и даже трансгенных коз [Ко 1.Н. е! а1. Ттапкдешс Кек. 9: 215-22 (2000)]. Для фармацевтического использования Г-КСФ преимущественно получают в ЕксйепсЫа сой [1еукеуат 8. е! а1. Вю!есйпо1. Ргод. 21: 632-639 (2005)], где он продуцируется как тела включений, которые представляют собой нерастворимые агрегаты рекомбинантного белка в ненативной конформации [Вапеух Б. & Мщаск М. №1!иге Вю!ес11по1. 22: 1399-1408 (2004)], которые, как правило, не обладают биологической активностью [Ве^ηа^беζ С.Е. Сигг. Орш. Вю!ес11по1. 9: 157-163 (1998)]. Также опубликован способ его секреторного получения [1еопд К.1. & Бее 8.Υ. Рто!ет Ехрг РипГ. 23: 311-318 (2001); Бее 8.Υ. е! а1. Мебюбк Мо1. Вю1. 308: 31-42 (2005)]. Секреторная экспрессия приводит, как правило, к высвобождению в периплазматическое пространство или внеклеточную среду Г-КСФ в надлежащем образом свернутой форме, но выходы его много меньше выходов, получаемых с телами включения. Поэтому с коммерческой точки зрения выгоднее экспрессировать Г-КСФ как тела включения в Е. соб. Надлежащим образом свернутый биологически активный белок Г-КСФ легко получают из тел включения коммерчески приемлемым способом, с использованием процесса денатурации и ренатурации после отделения и растворения тел включения [Кибо1рй К., 1п Рто!еш Епдтееппд: Рппс1р1ек и Ртасбсе; С1е1апб, 1.Б., Сга1к, 8.С, Ебк.; ХУПеу-Ыкк. 1пс.: Ыете Уогк, 1996; рр 283-298; Ка!1юге Α.8. е! а1. 1. Рйагт. Вютеб. Апа1. 32:1199-1211 (2003)].
Одним из наиболее эффективных способов получения рекомбинантных белков в Е. сой является способ культивирования с подпиткой, который можно выполнять в циклическом или в нециклическом режиме. Нециклический процесс менее сложный и поэтому более пригоден для промышленного производства. Действительно, в уровне техники описан один из наивысших выходов Г-КСФ в способе культивирования с подпиткой, который находится в диапазоне от 4,2 до 4,4 г/л [У1т 8.С. е! а1. Вюртосекк апб Вюкук!етк Епдшееппд (2001), 24, 249-254]. Выполнение ферментации с подпиткой в циклическом режиме, для получения более высокого совокупного выхода, приводит к высокой нестабильности плазмиды [Сйо1 8.-1. е! а1. 1. МютоЬю1. Вю!есйпо1. 10: 321-326 (2000)], при этом ограничивая устойчивость процесса.
Как правило, для того чтобы иметь высокую экспрессию продукта, необходимо поддерживать внехромосомную плазмиду, содержащую ген продукта, внутри клетки в надлежащем состоянии.
Как правило, это достигается селекционным воздействием на рекомбинантный микроорганизм путем добавления подходящего антибиотика к культуральной жидкости. Было описано увеличение уровня экспрессии Г-КСФ за счет добавления каждые 1-2 ч антибиотика (ампициллина) во время ферментации для уменьшения сегрегационной нестабильности рекомбинантного штамма (Кпуора1оуа Ο.Ν. е! а1. Кикк1ап Ра!еп! КН 2158303 С2 20001027). Нормативное требование о подтверждении очистки конечного продукта от антибиотика ограничивает его использование. Широкое использование антибиотиков также может с большей вероятностью привести к нежелательному воздействию на окружающую среду. Но уменьшение создаваемого антибиотиками селекционного воздействия часто приводит к уменьшению стабильности плазмиды и уровней экспрессии, что ставит под угрозу устойчивость процесса. Следовательно, ограничение использования антибиотика с увеличением стабильности плазмиды и уровня экспрессии, особенно в фазе образования продукта, представляет собой техническую проблему. Кроме того, низкая стабильность плазмиды в течение фазы образования продукта также может быть обусловлена метаболическим стрессом [8атак^а! V. е! а1. БЕМ8 М1стоЬю1. Бей. 179: 367-373 (1999)] и может приводить к низким уровням экспрессии [Сйепд С. е! а1. Вю!есйпо1. Вюепд. 56: 23-31 (1997)], обычно в культурах большого объема.
Кроме обусловленного антибиотиком селекционного воздействия стабильность плазмиды может быть улучшена на уровне конструкции вектора [8сйетебет Т. е! а1. Арр1. МютоЬю1. Вю!есйпо1. 38:91-93 (1992); Рап 8.Н. и Ма1сот В.А. Вю!ес11пк|иек. 29:1234-1238 (2000)]. В процессе культивирования она может быть улучшена подбором условий культивирования, такими как избежание недостатка подачи пита
- 1 015498 тельных веществ |8ιηί11ι & ВИосйка Сап. 1. МюгоЬю1. 44: 351-355 (1998)]. При проведении крупномасштабных ограничиваемых субстратом способов культивирования с подпиткой ограничение/недостаток подачи питательных веществ неизбежны, и добавление антибиотика слишком часто или в больших количествах представляет собой нецелесообразное и затратное решение для обеспечения высокого выхода продукта и высокой стабильности плазмиды в процессе с низкой степенью комплексности. Следовательно, существует очевидная необходимость разработки альтернативного способа получения Г-КСФ с высоким объемным выходом за счет поддержания высокой стабильности плазмиды, используя простой и устойчивый процесс.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение описывает нециклический способ культивирования с подпиткой для получения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) с высоким объемным выходом в Е5с11спс1иа сой за счет поддержания высокой стабильности плазмиды в культуре с использованием ионов калия в сочетании с ионами магния или натрия в высоких концентрациях в среде продуцирования и в культуральной жидкости.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показано влияние использования высоких концентраций катионов калия и натрия в фазе образования продукта на стабильность плазмиды, содержащей ген Г-КСФ, в клетках ВЬ21 (ΌΕ3) в момент сбора партии. Партия 2 получена при высокой концентрации солей калия и натрия, тогда как партия 1 получена в отсутствии высокой концентрации солей калия или натрия в фазе образования продукта. Партии получены раздельно в 30-л ферментере.
На фиг. 2 показано влияние использования высоких концентраций катионов калия и натрия в фазе образования продукта на объемный выход Г-КСФ в полученных партиях. Партия 2 получена при высокой концентрации солей калия и натрия, тогда как партия 1 получена в отсутствие высокой концентрации солей калия или натрия в фазе образования продукта. Партии получены раздельно в 30-л ферментере.
На фиг. 3 показано влияние использования высокой концентрации катионов магния и калия в фазе образования продукта на стабильность плазмиды, содержащей ген Г-КСФ, в клетках ВЬ21 (ΌΕ3) во время сбора партии. Партия 4 получена при высокой концентрацией соли магния, тогда как для партии 3 в фазе образования продукта не использовали высокую концентрацию магния. Обе партии получены при высокой концентрация соли калия раздельно в 30-л ферментере.
На фиг. 4 показано влияние использования высокой концентрации катионов магния и натрия на объемный выход Г-КСФ в полученных партиях. Партию 4 получали при высокой концентрации соли магния, тогда для партии 3 не использовали высокую концентрацию соли магния в фазе образования продукта. Обе партии получены при высокой концентрации соли калия раздельно в 30-л ферментере.
На фиг. 5 показано влияние использования высокой удельной скорости роста в фазе образования продукта на объемный выход Г-КСФ в собранных партиях. Во время фазы образования продукта средняя удельная скорость роста для партии 4 составляла приблизительно 0,04 л/ч, тогда как средняя удельная скорость роста для партии 5 составляла приблизительно 0,07 л/ч. Обе партии получены при высокой концентрации солей калия и магния, раздельно в 30-л ферментере.
На фиг. 6 показано влияние использования высокой концентрации тиамина в фазе образования продукта на объемный выход в полученных партиях. Во время фазы образования продукта партия 1 содержала 7 г/л тиамина в продуцирующей среде, тогда как партия 6 получена без использования тиамина в среде продуцирования. Обе партии получены раздельно в 30-л ферментере.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к улучшенному способу ферментации для производства гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) с улучшенным уровнем объемного выхода. Оно также раскрывает условия культивирования для улучшенной стабильности плазмиды, что в дальнейшем приводит к высокому объемному выходу Г-КСФ. Способ по изобретению включает нециклический способ культивирования с подпиткой с использованием многократных индукций, выполняемый в присутствии высокой концентрация калия, в сочетании с другими неорганическими солями, такими как натриевые, магниевые и т.п., в высоких концентрациях в продуцирующей среде. Как ни удивительно, когда такой способ, использующий соли по настоящему изобретению, как детально описано здесь, использовали в сочетании с высокой удельной скоростью роста, он все еще поддерживал высокую стабильность плазмиды, ведущую к дополнительному увеличению объемного выхода.
Настоящее изобретение дополнительно подробно описано ниже.
Можно использовать любой полипептид, относящийся к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (также именуемому здесь Г-КСФ). Термин гранулоцитарный колониестимулирующий фактор или Г-КСФ относится к природному Г-КСФ, белку, появляющемуся в результате мутаций, фрагментам, синтетическим конструкциям, его аналогам и производным или демонстрирующему по меньшей мере 60% биологической или рецепторсвязывающей активности как природного чГ-КСФ или сохраняющему по меньшей мере приблизительно 80% аминокислотной идентичности. Примеры таких последовательностей включают последовательность из СепЬапк ГО 01:27437048 и последовательности, описанные в патенте США № 4810643.
- 2 015498
Клетки Е^еНспеЫа сой трансформированы подходящим экспрессирующим вектором, содержащим кодирующую последовательность Г-КСФ и подходящий промотор, выбранный из 17, 1ас и подобных промоторов наряду с другими компонентами вектора, используя способы трансформации, хорошо известные в данной области техники.
В описанном ниже способе ферментация относится к анаэробному выращиванию микроорганизмов, предпочтительно рекомбинантных Е. сой, для получения Г-КСФ. В таком способе загрузочная фаза выращивания относится к периоду, в котором после засева в культуральную жидкость в ферментере не добавлено никакое питательное вещество кроме гидроксида аммония (если требуется). Культуральная жидкость представляет собой суспензию клеток, сред и производных сред и клеток (если таковые имеются). Фаза роста в способе культивирования с подпиткой, ограничиваемом субстратом, относится к той части фазы роста, в которой основное увеличение биомассы (по меньшей мере 2 удвоения) происходит при добавлении среды для выращивания с подпиткой к культуральной жидкости таким образом, что лимитирующей является концентрация основного источника углерода/энергии (например, глюкозы). Расход указанной среды определяет удельную скорость роста культуры. Преиндукционная среда относится к среде с составом, отличным от среды для выращивания, которая добавлена к культуральной жидкости перед добавлением индуктора (например, 1РТС). Индукция представляет собой процесс существенного увеличения концентрация Г-КСФ в клетках, как определено средствами, известными из уровня техники, при добавлении индуктора (например, 1РТС и лактозы). Среда продуцирования имеет состав, отличный от среды для выращивания, и добавляется к культуральной жидкости в ферментере во время индукции гена Г-КСФ. Среду продуцирования также добавляли таким способом, что концентрация субстрата (например, глюкозы) оставалась ограничивающей. Расход среды продуцирования определяет удельную скорость роста культуры на фазе продуцирования.
Клетки-хозяева Е. сой, предварительно трансформированные подходящим вектором экспрессии, кодирующим Г-КСФ, первоначально культивировали при 37°С в колбе-качалке, чтобы вырастить посевной материал для ферментера. Культуру посевного материала использовали для засева стерильной среды для выращивания в ферментере. Режим фазы роста ферментации с подпиткой, ограничиваемой субстратом, начинают, как только начинает расти культура рекомбинантных Е. сой и концентрация глюкозы в культуральной жидкости падает до 0,5 г/л или менее. Подача среды для выращивания в процессе с подпиткой, добавляемой в режиме подпитки, ограничиваемой субстратом, поддерживается непрерывной (экспоненциальная или постоянная скорость) или прерывистой во время фазы роста. После достижения плотности клеток 1-60 г/л сухой массы клеток и концентрации глюкозы в культуральной жидкости менее чем 0,5 г/л добавление препродуцирующих сред завершают, а затем начинают и продолжают подачу сред продуцирования непрерывным или прерывистым, ограничиваемым субстратом, образом. Многократные индукции гена Г-КСФ выполняют 1РТС. Среднюю удельную скорость роста не уменьшают во время или после добавления индуктора. Значение рН поддерживают приблизительно равным 5-7. Температуру поддерживают приблизительно равной 30-42°С. После от 2 до 48 ч добавления препродуцирующей среды среду для культивирования удаляют и подвергают последующей обработке согласно способам, известным в данной области техники.
Среда фазы роста содержит источники углерода и энергии, выбранные из группы, включающей глюкозу, глицерин и т.п., или их смеси, комплексные компоненты среды выбраны из группы, включающей дрожжевой экстракт, триптон, пептон, продукт ферментативного гидролиза казеина, продукт гидролиза соевого казеина и т.п., или их смеси, подходящие соли/питательные вещества выбраны из группы, включающей лимонную кислоту, хлорид калия, хлорид натрия, сульфат магния, гидрофосфат диаммония, дигидрофосфат калия, бутират натрия, тиамин, глицин и хлорид цинка.
Другие условия ферментации, такие как аэрация, перемешивание, посевная культура, время засева и т.п., все выбраны для удобства как известные из уровня техники.
Среда препродукции включает комплексные компоненты среды, выбранные из экстракта дрожжей, триптона, пептона, продуктов ферментативного гидролиза казеина, продуктов гидролиза соевого казеина, наряду с питательными веществами, такими как тимин, глицин и т.п. или их смесей; антибиотики, такие как канамицин, ампициллин и т. п. Подходящие соли выбирают из группы, включающей лимонную кислоту, хлорид калия, хлорид натрия, сульфат магния, гидрофосфат диаммония, дигидрофосфат калия, бутират натрия и хлорид цинка, таким образом, чтобы среда содержала высокий уровень концентрации ионов К в сочетании с ионами или Ыа, или Мд.
Среда продуцирования содержит источник углерода в дополнение к компонентам среды препродукции. Подходящий источник углерода можно выбрать из группы, состоящей из глицерина, глюкозы, фруктозы и т.п. или их смесей. Предпочтительный источник углерода по настоящему изобретению представляет собой глюкозу. Во время фазы продуцирования культуральную жидкость поддерживают с высоким уровнем ионов К в сочетании с ионами или Ыа, или Мд. Концентрацию в культуральной жидкости ионов К поддерживают от приблизительно 60 до приблизительно 300 мМ, ионов Να от приблизительно 60 до приблизительно 300 мМ и ионов Мд от приблизительно 150 до приблизительно 250 мМ. В предпочтительном варианте осуществления концентрация ионов К составляет от 90 до 150 мМ, концентрация
- 3 015498 ионов Να составляет от 60 до 120 мМ и концентрация ионов Мд в культуральной жидкости находится в диапазоне от 180 до 220 мМ.
В дополнительном варианте осуществления добавление тимина в высокой концентрации (в диапазоне от 5 до 10 г/л) обеспечивает выход Г-КСФ в диапазоне 5-6 г/л.
Способ по настоящему изобретению приводит к получению Г-КСФ с высоким выходом (5-9,5 г/л) с поддержанием высокой стабильности плазмиды на всем протяжении фазы роста и продуцирования (7590%).
Пример 1. Влияние высокой концентрации ионов Να и К на стабильность плазмиды и объемный выход.
Эксперимент выполняли в 30-л ферментере. Посевной материал клеток Е. со11 ВЬ21 (ЭЕ3), трансформированных с геном Г-КСФ человека, засевали в среду для выращивания следующего состава.
Концентрация перед засевом
Компонент
КН2РО4 13, 3 г/л
(ΝΗΗ 2НРО4 4,0 г/л
Дрожжевой экстракт 1,0 г/л
Глюкоза 10, 0 г/л
Лимонная кислота 1,7 г/л
МдЗО4 7Н2О 1,2 г/л
Раствор микроэлементов 20,0 мл/л
Канамицин 50 мг/л
Раствор неорганических микроэлементов
Компонент
ГеС13·6Н2О
ΖηΟ12·4Н2О
СоС12· 6Н2О
Ν32Μο04·2Η20
СаС12-2Н20
СцС12
Н3ВО3
Концентра имя
0,162 г/л 0,0144 г/л
0,12 г/л
0,012 г/л
0,006 г/л
1,9 г/л
0,5 г/л
Добавление следующей среды для выращивания способом культивирования с подпиткой в режиме культивирования, лимитируемым субстратом, привело к основному увеличению биомассы Компонент Концентрация
Глюкоза 700 г/л
Мд8О4 7Н2О 20 г/л
Раствор микроэлементов 20 мл/л
Канамицин 500 мг/л
В фазе роста гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН в диапазоне от 6,8 до 7,0. Температуру поддерживали при 37°С. После достижения оптической плотности приблизительно 50 ед.погл. (при 600 нм) в партии 2 в культуральную жидкость добавляли среду преиндукции, состоящую из следующих компонентов:
Компонент
Дрожжевой экстракт
Хлорид калия
Хлорид натрия
Тиамина гидрохлорид
Концентрация
84,38 г/л
75,41 г/л
123,13 г/л
8,44 г/л
Конечная концентрация катионов калия и натрия в культуральной жидкости составляла приблизительно 120 и 250 мМ соответственно.
Затем начинали подачу следующей среды продуцирования:
Компонент Концентрация
Глюкоза 270 г/л
- 4 015498
Мд5О4 · 7Н2О
Дрожжевой экстракт
Тиамина гидрохлорид
Хлорид калия
Хлорид натрия г/л
214 г/л г/л
8,94 г/л (только в Партии 2)
17,5 г/л (только в Партии 2)
Экспрессию гена Г-КСФ индуцировали многократными добавлениями стерилизованного фильтрованием раствора 1РТС к культуральной жидкости. В фазе продуцирования гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН 6,8. Температуру поддерживали при 37°С. Для создания селекционного воздействия к культуре добавляли канамицин. Количество канамицина, использованного во время фазы продуцирования для партии 2 (37,5 мг, добавлен однократно), составляло приблизительно 1% от количества использованного в партии 1 (2925 мг, многократные добавления), для того чтобы тщательно проверить влияние солей на стабильность плазмиды.
Стабильность плазмиды определяли сначала асептическим отбором образца готовой партии в стерильную пробирку и асептическим распределением подходящего объема соответствующего разведенного образца по среде Луриа-Бертани с канамицином (50 мг/л) и без. Чашки Петри инкубировали при 37°С в течение 48 ч и чашки, имевшие статистически значимые колонии, подвергали учету. Величина, полученная делением количества колоний, полученных на канамицинсодержащих чашках, на количество колонией в чашках, не содержащих канамицин, использовали для того, чтобы вычислить стабильность плазмиды. Стабильность плазмиды в партии 2 (96,8%) была более чем вдвое выше по сравнению со стабильностью плазмиды в партии 1 (45,0%), тем самым показывая важность катионов натрия и калия в улучшении стабильности плазмиды (фиг. 1).
Объемный выход Г -КСФ, как определено денситометрическим измерением полосы Г-КСФ по сравнению со стандартной кривой аутентичного стандарта после 8Ό8-ΡΆΟΕ, составлял 5,38 г/л в партии 1 и 5,81 г/л в партии 2. Объемный выход в партии 2 был приблизительно на 8% выше, чем в партии 1 (фиг. 2).
Пример 2. Влияние высокой концентрации магния и калия на стабильность плазмиды и объемный выход.
Эксперимент выполняли в 30-л ферментере. Так как среды фазы продуцирования обеих партий (партии 3 и партии 4) были идентичны, включая концентрации катиона калия, кроме только концентрации катиона магния, результаты отражали влияние сочетания катионов калия и магния. Посевной материал клеток Ε. сой ВЬ21 (ΌΕ3), трансформированных с геном Г-КСФ человека, засевали в среды для выращивания следующего состава.
Компонент
Концентрация перед засевом
КН2РО4 13,3 г/л
(ΝΗ4) 2НРО4 4,0 г/л
Дрожжевой экстракт 1,0 г/л
Глюкоза 10, 0 г/л
Лимонная кислота 1,7 г/л
МдЗОг 7Н2О 1,2 г/л
Раствор микроэлементов 20, 0 мл/л
мг/л
Канамицин
Раствор неорганических микроэлементов
Компонент
Концентрация
ЕеС13·6Н2О
0,
162 г/л
ΖηΟ12·4Η2Ο
0144 г/л
СоС12-6Н2О г/л
ИагМо04*2Н20
0,
012 г/л
СаС12-2Н2О
006 г/л
СиС12 г/л
Н3ВО3
0, г/л
Добавление следующей среды для выращивания способом культивирования с подпиткой в режиме культивирования, лимитируемым субстратом, обусловливало основное увеличение биомассы
- 5 015498
Компонент
Глюкоза
Мд5О4 · 7Нг0
Концентрация
700 г/л г/л
Раствор микроэлементов
Канамицин мл/л
500 мг/л
В фазе роста гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН в диапазоне от 6,8 до 7,0. Температура поддерживалась при 37°С. После достижения оптической плотности приблизительно 50 ед.погл. (при 600 нм) среду преиндукции, состоящую из следующей смеси, добавляли в культуральную жидкость
Компонент
Дрожжевой экстракт
Хлорид калия
Тиамина гидрохлорид
Сульфат магния
Концентрация
84.38 г/л
75,44 г/л
8.38 г/л
187,06 г/л (только в Партии 4)
Затем начинали подачу следующей среды продуцирования
Компонент
Глюкоза
Концентрация
270 г/л
Сульфат магния
Сульфат магния
Дрожжевой экстракт г/л (только в Партии 3)
50,3 г/л (только в Партии 4)
214 г/л
Тиамина гидрохлорид г/л
Хлорид калия
8,94 г/л
Экспрессию гена Г-КСФ индуцировали многократными добавлениями к культуральной жидкости стерилизованного фильтрацией 1РТС. В фазе продуцирования гидроксид аммония использовали как регулятор рН, чтобы поддерживать рН 6,8. Температуру поддерживали при 37°С. Для того чтобы создать селекционное воздействие, к культуре добавляли канамицин. Равное количество канамицина (37,5 мг, добавлен однократно) использовали в фазе продуцирования. Концентрация в культуральной жидкости катионов калия и магния во время фазы продуцирования составляла приблизительно 120 и 200 мМ соот ветственно.
Стабильность плазмиды определяли, как описано выше. Стабильность плазмиды в партии 4 (97,3%) была приблизительно на 6% выше, чем стабильность плазмиды в партии 3 (91,8%), таким образом показывая эффективность катионов калия и магния в улучшении устойчивости плазмиды (фиг. 3). Стабильность плазмиды, полученная в присутствии катионов магния и калия, была на 116,2% выше, чем в партии 1 (в отсутствие высокой концентрации солей в фазе продуцирования).
Объемный выход Г-КСФ, как определяли денситометрическим количественным анализом полосы ГКСФ по отношению к стандартной кривой аутентичного стандарта, после 8Ό8-ΡΆΟΕ, составил 5,48 г/л в партии 3 и 8,35 г/л в партии 4 (фиг. 4). Объемный выход в партии 4 был на приблизительно 55% выше, чем в партии 1.
Пример 3. Влияние высокой скорости удельного роста во время фазы продуцирования на объемный выход.
Эксперимент выполнили в 30-л ферментере. Среды фазы продуцирования обеих партий (партии 4 и партии 5) были идентичными, включая концентрации катионов калия и магния. Средняя удельная скорость роста во время фазы продуцирования для партии 5 была выше, чем в фазе продуцирования для партии 4. Посевной материал, клетки Ε. сой ВЬ21 (ΌΕ3), трансформированные с геном Г-КСФ человека, засевали в среды для выращивания следующего состава.
Компонент
Концентрация перед засевом
КН2РО4 13,3 г/л
(ΝΗ4)2ΗΡΟ4 4,0 г/л
Дрожжевой экстракт 1,0 г/л
Глюкоза 10,0 г/л
Лимонная кислота 1,7 г/л
МдЗО4-7Н2О 1,2 г/л
Раствор микроэлементов 20,0 мл/л
Канамицин 50 мг/л
- 6 015498
Раствор неорганических микроэлементов Компонент
ЕеС13’6Н2О
ΖηΟ12·4Η2Ο
СоС12-6Н20
Ыа2Мо04-2Н20
СаС12'2Н2О
СиС12
Н3ВО3
Концентрация
0,162 г/л
0,0144 г/л
О,12 г/л
0,012 г/л
0,006 г/л
1,9 г/л
0,5 г/л
Добавление следующей среды для выращивания способом культивирования с подпиткой в режиме культивирования, лимитируемым субстратом, обуславливало основное увеличение биомассы
Компонент Концентрация
Глюкоза 700 г/л
МдЗО4‘7Н2О 20 г/л
Раствор микроэлементов 20 мл/л
Канамицин 500 мг/л
В фазе роста гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН в диапазоне от 6,8 до 7,0. Температуру поддерживали при 37°С. После достижения оптической плотности приблизительно 50 ед.погл. (при 600 нм) в культуральную жидкость добавляли среду преиндукции, имеющую следующий состав:
Компонент
Концентрация
Дрожжевой экстракт 84,38 г/л
Хлорид калия 75,44 г/л
Тиамина гидрохлорид 8,38 г/л
Сульфат магния
Затем начинали подачу следующей среды продуцирования
Компонент
Глюкоза
Сульфат магния
Дрожжевой экстракт
Тиамина гидрохлорид
Хлорид калия
187,06 г/л
Концентрация
270 г/л
50,3 г/л
214 г/л г/л
8,94 г/л
Экспрессию гена Г-КСФ индуцировали многократными добавлениями стерилизованного фильтрацией раствора ΙΡΤ6 к культуральной среде. В фазе продуцирования гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН 6,8.
Температуру поддерживали при 37°С. Для создания селекционного воздействия к культуре добавляли канамицин. Эквивалентное количество канамицина (37,5 мг, добавлен однократно) использовали во время фазы продуцирования. Средняя удельная скорость роста во время фазы продуцирования в партии 4 составила приблизительно 0,04 л/ч, тогда как в партии 5 составила приблизительно 0,07 л/ч.
Объемный выход Г-КСФ, определенный, как описано ранее, составил 8,35 г/л в партии 4 и 9,94 г/л в партии 5. Объемный выход в партии 5 был примерно на 19% выше, чем выход в партии 4 (фиг. 5). Стабильность плазмиды в образцах, взятых в конце процесса из обеих партий, была высокой (>75%).
Пример 4. Влияние использования высокой концентрации тиамина в фазе продуцирования на объемный выход.
Эксперимент выполняли в 30-л ферментере. Посевную культуру клеток Е. сой ВЬ21 (ΌΕ3), трансформированных геном Г-КСФ человека, засевали в среду для выращивания следующего состава.
- 7 015498
Компонент Концентрация перед
КН2РО4 13,3 г/л
(ΝΗ4)2ΗΡΟ4 4,0 г/л
Дрожжевой экстракт 1,0 г/л
Глюкоза 10,0 г/л
Лимонная кислота 1,7 г/л
Мд504-7Н20 1,2 г/л
Раствор микроэлементов 20,0 мл/л
Канамицин
СиС12
НзВОз
Ампициллин
Раствор неорганических микроэлементов
Добавление следующей среды для выращивания способом культивирования с подпиткой в режиме культивирования, лимитируемым субстратом, обуславливало основное увеличение биомассы Компонент Концентрация
Глюкоза
МдЗО4- 7Н2О
700 г/л г/л
Раствор микроэлементов мл/л
Канамицин
500 мг/л {В Партии 1)
Ампициллин мг/л культуральной жидкости при каждом добавлении
ТОЛЬКО В
Партии 6. Суммарно сделали шесть добавлений во время фазы рост при культивировании с подпиткой
В фазе роста гидроксид аммония использовали как регулятор рН для поддержания рН приблизительно 6,8. Температуру поддерживали при 37°С. После достижения оптической плотности приблизительно 50 ед.погл. (при 600 нм) начинали подачу следующей среды продуцирования
Компонент Концентрация
Глюкоза
МдЗО4- 7Н2О
270 г/л г/л
Дрожжевой экстракт
214 г/л
Тиамина гидрохлорид г/л (Только в Партии 1)
Канамицин
2,925 г (добавлен несколько раз в Партии 1) г (добавлен несколько раз в Партии 6)
2,689
Ампициллин
Экспрессию гена Г-КСФ индуцировали многократными добавлениями стерилизованного фильтрацией раствора 1РТС к культуральной среде. В фазе продуцирования гидроксид аммония использовали как регулятор рН, чтобы поддерживать рН 6,8. Температуру поддерживали при 37°С.
Объемный выход Г-КСФ определяли, как описано выше.
Объемный выход в партии 1 в образце, взятом в конце процесса (партия с высокой концентрацией тиамина), был приблизительно на 10,7% выше, чем выход в партии 6 (4,86 г/л), таким образом, показывая эффективность высокой концентрации тиамина в улучшении объемного выхода Г-КСФ (фиг. 6).
- 8 015498
Преимущества заявленного способа:
(1) более высокий объемный выход делает возможным больший выход при меньшем масштабе, ограничивая, таким образом, капитальные расходы на увеличение масштаба;
(2) высокий объемный выход достигнут, используя компоненты сред (магний, калий и соли магния) с очень низкой стоимостью;
(3) культура, обладающая высокой стабильностью плазмиды, более способна для увеличения объемного выхода Г-КСФ в метаболически напряженных условия, таких как экспрессия гена Г-КСФ в условиях высокой удельной скорости роста.

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения высокого объемного выхода гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) при ферментации в культуральной жидкости, где культуральная жидкость получает непрерывную подпитку ионами К в диапазоне концентрации от 60 до 180 мМ в комбинации с высокой концентрацией неорганических катионов, выбранных из Να или Мд.
  2. 2. Способ по п.1, где концентрация ионов Να находится в диапазоне от 90 до 300 мМ и ионов Мд находится в диапазоне от 150 до 250 мМ.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, где культуральная жидкость включает комплексные компоненты среды, выбранные из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, триптона, пептона, ферментативного гидролизата казеина и гидролизата соевого казеина.
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, где способ представляет собой лимитируемый субстратом процесс культивирования с подпиткой.
  5. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где многократные индукции гена выполнены во время фазы продуцирования.
  6. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где культуральная жидкость дополнительно содержит источник(и) углерода, выбранный из глюкозы, глицерина и фруктозы.
  7. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где средняя удельная скорость роста поддерживается постоянной между фазами продуцирования и препродуцирования.
  8. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где концентрация ионов К составляет от 90 до 150 мМ, ионов Να от 60 до 120 мМ и ионов Мд от 180 до 220 мМ.
  9. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стабильность плазмиды составляет по меньшей мере 75%.
  10. 10. Способ улучшения стабильности плазмиды Г-КСФ добавлением ионов К в диапазоне от 60 до 180 мМ в культуральную жидкость в режиме непрерывной подпитки.
  11. 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где концентрация антибиотика в фазе продуцирования ниже, чем концентрация, использованная в фазе роста.
  12. 12. Способ получения Г-КСФ, включающий стадии:
    ί) засева ферментера подходящей культурой Е. сой, предварительно трансформированной подходящим экспрессирующим вектором, кодирующим Г-КСФ;
    ίί) выполнения фазы роста в периодическом режиме культивирования или культивирования с подпиткой для увеличения биомассы;
    ϊϊΐ) добавления подходящей среды преиндукции;
    ίν) добавления подходящей среды продуцирования в режиме культивирования с подпиткой, лимитируемом субстратом, в котором осуществляются многократные индукции гена;
    где конечная концентрация ионов К, Να и Мд в культуральной жидкости представляет собой концентрацию, указанную в одном или нескольких предшествующих пунктов.
  13. 13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где объемный выход Г-КСФ находится в диапазоне от 5 до 9,5 г/л.
EA200870320A 2006-03-06 2007-03-05 Способ получения г-ксф человека EA015498B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN309MU2006 2006-03-06
PCT/IN2007/000105 WO2007102174A2 (en) 2006-03-06 2007-03-05 Process for preparing human g-csf

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200870320A1 EA200870320A1 (ru) 2009-02-27
EA015498B1 true EA015498B1 (ru) 2011-08-30

Family

ID=38436804

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200870320A EA015498B1 (ru) 2006-03-06 2007-03-05 Способ получения г-ксф человека
EA201100718A EA022782B1 (ru) 2006-03-06 2007-03-05 Способ получения г-ксф человека

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100718A EA022782B1 (ru) 2006-03-06 2007-03-05 Способ получения г-ксф человека

Country Status (18)

Country Link
US (2) US8021862B2 (ru)
EP (2) EP1994138B1 (ru)
JP (2) JP4927103B2 (ru)
KR (1) KR101176794B1 (ru)
CN (2) CN102776261B (ru)
AP (2) AP3142A (ru)
AU (1) AU2007224331B2 (ru)
BR (1) BRPI0707078A2 (ru)
CA (1) CA2642654C (ru)
DK (2) DK2182007T3 (ru)
EA (2) EA015498B1 (ru)
HK (2) HK1127617A1 (ru)
MX (1) MX2008011407A (ru)
MY (1) MY149168A (ru)
NZ (2) NZ596111A (ru)
PL (2) PL1994138T3 (ru)
WO (1) WO2007102174A2 (ru)
ZA (1) ZA200806978B (ru)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2201120T3 (pl) * 2007-09-21 2014-05-30 Cadila Healthcare Ltd Systemy białek fuzyjnych GCSF odpowiednie do wysokiej ekspresji peptydów
WO2011086447A2 (en) 2010-01-12 2011-07-21 Lupin Limited Fermentation process for the preparation of recombinant heterologous proteins
CN108103243A (zh) * 2018-01-04 2018-06-01 哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司 一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用
CN114350588B (zh) * 2021-12-31 2024-03-15 山东新时代药业有限公司 一种rhG-CSF的发酵培养基及其发酵方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0459630A2 (en) * 1990-04-30 1991-12-04 Zeneca Limited Polypeptides

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2591235C (en) * 2004-12-20 2014-03-11 Cadila Healthcare Limited Process for preparing high levels of interferon beta

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0459630A2 (en) * 1990-04-30 1991-12-04 Zeneca Limited Polypeptides

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOI SEUNG-JIN ET AL.: "Plasmid stability in long-term hG-CSF production using L-arabinose promoter system of Escherichia coli" JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 10, no. 3, June 2000 (2000-06), pages 321-326, XP008083145 ISSN: 1017-7825 cited in the application the whole document *
FATEMI SEYED SAFA-ALI ET AL.: "Selection of a suitable strain from recombinant Escherichia coli strains with the same genetic structure expressing periplasmic hGM-CSF". JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 96, no. 6, December 2003 (2003-12), pages 578-580, XP002449225 ISSN: 1389-1723 the whole document *
JEONG KI JUN ET AL.: "Secretory production of human granulocyte colony-stimulating factor in Escherichia coli" PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 23, no. 2, 2001, pages 311-318, XP002263043 ISSN: 1046-5928 cited in the application the whole document *
JEVSEVAR S. ET AL.: "Production of nonclassical inclusion bodies from which correctly folded protein can be extracted" BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol. 21, no. 2, March 2005 (2005-03), pages 632-639, XP002426305 ISSN: 8756-7938 cited in the application the whole document *
YIM S.C. ET AL.: "High-level secretory production of human granulocyte-colony stimulating factor by fed-batch culture of recombinant Escherichia coli" BIOPROCESS AND BIOSYSTEMS ENGINEERING, vol. 24, no. 4, November 2001 (2001-11), pages 249-254, XP002449223 ISSN: 1615-7591 cited in the application the whole document, page 250, left-hand column, line 13 - right-hand column, line 21 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080104011A (ko) 2008-11-28
PL2182007T3 (pl) 2014-06-30
ZA200806978B (en) 2009-05-27
EA022782B1 (ru) 2016-03-31
AP3142A (en) 2015-02-28
CA2642654A1 (en) 2007-09-13
CN102776261B (zh) 2014-09-24
EP1994138A2 (en) 2008-11-26
AU2007224331B2 (en) 2011-05-26
US8492120B2 (en) 2013-07-23
MY149168A (en) 2013-07-31
CA2642654C (en) 2014-04-22
US20090305354A1 (en) 2009-12-10
EA201100718A1 (ru) 2012-02-28
NZ596111A (en) 2012-12-21
JP2009528836A (ja) 2009-08-13
WO2007102174A3 (en) 2008-01-03
AP2012006440A0 (en) 2012-08-31
AP2647A (en) 2013-04-17
CN101410410B (zh) 2013-06-12
EP2182007A1 (en) 2010-05-05
HK1176645A1 (en) 2013-08-02
EP2182007B1 (en) 2014-03-05
AP2008004592A0 (en) 2008-08-31
AU2007224331A1 (en) 2007-09-13
KR101176794B1 (ko) 2012-08-24
CN101410410A (zh) 2009-04-15
DK2182007T3 (da) 2014-04-22
CN102776261A (zh) 2012-11-14
JP4927103B2 (ja) 2012-05-09
WO2007102174A2 (en) 2007-09-13
JP2011229541A (ja) 2011-11-17
EP1994138B1 (en) 2014-04-30
US20110070611A1 (en) 2011-03-24
DK1994138T3 (da) 2014-05-12
EA200870320A1 (ru) 2009-02-27
JP5460660B2 (ja) 2014-04-02
BRPI0707078A2 (pt) 2011-04-19
US8021862B2 (en) 2011-09-20
MX2008011407A (es) 2008-09-24
NZ571337A (en) 2011-12-22
PL1994138T3 (pl) 2014-08-29
HK1127617A1 (en) 2009-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102132132B1 (ko) 재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법
JPS60217898A (ja) 異種タンパス質の製造方法
CN102154189A (zh) 一种rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法
HUE027035T2 (hu) Eljárások csont morfogenetikus fehérjék termelésének fokozására
CN106566795A (zh) 用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒dna的培养基及培养方法
CN116535494A (zh) 一种重组类人源ⅲ型胶原蛋白及其应用
EA015498B1 (ru) Способ получения г-ксф человека
CN110066331B (zh) 一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法
CN104152515A (zh) 一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基及发酵方法
CN111378711A (zh) 重组蛛丝蛋白的产业化生产方法
CN108251375B (zh) 一种发酵生产重组人白介素-12的方法
JPH10113095A (ja) ミジンコの培養方法
CN112063562A (zh) 一种高效表达超螺旋质粒dna的大肠杆菌发酵方法
CN105695385B (zh) 重组人胰岛素基因工程菌高表达株筛选培养基及制备方法
RU2321424C1 (ru) ПРЕПАРАТ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pSX70, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГРАНУЛОЦИТ-КОЛОНИЙСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА (Г-КСФ), ШТАММ Escherichia coli SX70-ПРОМЫШЛЕННЫЙ ШТАММ ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО Г-КСФ И СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ Г-КСФ
SU1703690A1 (ru) Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 22, кодирующа синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии РSеUDомоNаS Sp. -продуцент- интерферона @ -11 человека
EA013263B1 (ru) Способ получения интерферона-бета
KR100429331B1 (ko) 재조합 효모를 이용한 에스에이치엘케이엔-1 단백질의대량생산방법
CN108265061B (zh) 一种大规模制备重组人成纤维细胞生长因子21(fgf21)的生产方法
CN1289781A (zh) 截短型人胰岛素样生长因子－ⅰ及其制备方法
RU2486248C2 (ru) Способ биосинтеза l-лизина
CN85102303A (zh) 生产干扰素的方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU