CN108265061B - 一种大规模制备重组人成纤维细胞生长因子21(fgf21)的生产方法 - Google Patents

一种大规模制备重组人成纤维细胞生长因子21(fgf21)的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了人FGF21基因、人FGF21表达载体、人FGF21工程菌以及表达人FGF21的方法，适用于大规模生产。

Description

一种大规模制备重组人成纤维细胞生长因子21(FGF21)的生 产方法
技术领域
本发明属于蛋白质或多肽制备技术领域，具体而言，本发明涉及FGF21的表达的方法及其优化的基因。
技术背景
成纤维细胞生长因子-21(FGF21)是成纤维细胞生长因子家族的一员，与FGF19和FGF23同属于一个亚家族，分子量为19.5KDa，由181个氨基酸组成，且与鼠源FGF21有75％同源性。FGF21是细胞代谢的一种调节因子，在体内和体外展现多种有利的影响，比如抑制肝葡萄糖生成，刺激脂肪组织葡萄糖摄取，增加褐色脂肪组织产热，保护胰岛质量和胰岛素水平且无促有丝分裂效应或其他副作用。FGF21可作为胰岛素和GLP1类似物的替代物，是治疗II型糖尿病药物中极具前景的一种。
天然人FGF-21蛋白在液体发酵条件下非常容易降解，大规模表达FGF21的技术难题限制了其应用。尤其是已有的临床数据报道，FGF-21临床拟用剂量高达3～20mg/人次，因此，FGF-21的发酵低产量直接决定产品的生产成本和临床价格高。为此，国际前列的美国礼来公司和辉瑞公司对FGF-21天然蛋白进行了结构改造，通过一级结构的改变来避免天然人FGF-21的不足。但是，从礼来公司/LY2405319和辉瑞公/PF-05231023临床降糖效果分析，FGF-21改构体可能存在与天然FGF-21人体内降糖作用的差异。
本发明人没有在现有技术的困难面前退缩，经过艰苦努力，从大量研究中发明了一种FGF21的表达的方法，通过优化的基因序列和各种规模的表达方法，能够高产天然人FGF-21。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的人FGF21的表达方法，适合大规模生产。另外，本发明还涉及人FGF21基因、人FGF21表达载体、人FGF21工程菌等。
在第一方面，本发明提供了人FGF21基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该基因优化了表达，其中并没有完全使用常规的优化密码子。
在第二方面，本发明提供了包含本发明第一方面的人FGF21基因的人FGF21表达载体。优选该人FGF21表达载体是pET-3c质粒，即将人FGF21基因克隆入pET-3c质粒所得的质粒。
在第三方面，本发明提供了导入了本发明第二方面的人FGF21表达载体上的人FGF21工程菌。优选该人FGF21工程菌是大肠杆菌BL21(DE3)，即将人FGF21表达载体上导入大肠杆菌BL21(DE3)所得的菌。
在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的人FGF21基因、本发明第二方面的人FGF21表达载体或本发明第三方面的人FGF21工程菌在表达人FGF21中的应用。优选该表达是大规模(不小于30L，优选大于100L)发酵表达。
在第五方面，本发明提供了表达人FGF21的方法，其包括：
(1)接种本发明第三方面的人FGF21工程菌；
(2)在不加IPTG的情况下培养；和
(3)加入IPTG培养。
优选在本发明第五方面的步骤(1)中，接种至的培养基包含胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化铵和葡萄糖。优选该培养基的含量(以g/L计)为胰蛋白胨17.0、酵母粉23.0、氯化钠4.0、磷酸二氢钾1.0、磷酸氢二钾3.0、氯化铵4.0和葡萄糖5.0。
优选在本发明第五方面的步骤(2)的培养中，(通过流加补料)控制pH在6.8～7.0之间并(通过转数、通气量)控制DO值≥30％，于36.8～37.2℃培养至A600达到15～17时终止步骤(2)。
优选在本发明第五方面的步骤(3)的培养中，待A600达到15～17开始培养，流加IPTG，(通过流加补料)控制pH在7.0～7.2之间，(通过转数、通气量)控制DO值≥30％，于36.8～37.2℃诱导培养。
更优选其中，补料溶液包括：
碳源，优选为葡萄糖；
氮源，优选为胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁；
无机盐，优选为硫酸镁和氯化钙；
生长因子，优选为维生素B1；和
碱，优选为氨水。
优选在本发明第五方面的方法为发酵罐发酵表达的方法，其中发酵罐不小于30L，优选大于100L。
本发明具有以下有益效果：高产FGF21，适合大规模生产，可以降低生产成本和临床价格等。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1显示了rhFGF-21工程菌的生长曲线。
图2显示了不同诱导时间对菌体密度(A600)的曲线。
图3显示了rhFGF-21工程菌诱导1～6h电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～8：分别为诱导后1～6h。
图4显示了不同诱导剂浓度对菌体密度(A600)曲线。
图5显示了不同IPTG浓度对rhFGF-21表达电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～9：IPTG浓度分别为0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L。
图6显示了诱导时机对rhFGF-21工程菌影响曲线。
图7显示了诱导时机对目的蛋白表达电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～8：分别在A600为0.2、0.4、0.8、1.2、1.8、2.5诱导。
图8显示了不同培养温度对菌体密度(A600)曲线。
图9显示了不同诱导温度对菌体密度(A600)曲线。
图10显示了最适诱导温度的选择，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marke；3～6：分别33℃、35℃、37℃、39℃诱导4h。
图11显示了不同初始培养pH值对菌体密度(A600)曲线。
图12显示了不同诱导pH值对菌体密度(A600)曲线。
图13显示了不同pH下目的蛋白表达电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～7：pH分别为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4。
图14显示了不同培养基装量对菌体密度(A600)曲线。
图15显示了不同培养基装量对菌体密度(A600)曲线。
图16显示了不同培养基装量下目的蛋白表达电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～6：装液量分别为25、50、75、100mL。
图17显示了不同葡萄糖浓度对菌体密度(A600)曲线。
图18显示了不同葡萄糖浓度对菌体密度(A600)曲线。
图19显示了不同葡萄糖浓度对目的蛋白表达电泳图1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～8：葡萄糖终浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、5g/L、10g/L、20g/L。
图20显示了不同氯化铵浓度对菌体密度(A600)曲线。
图21显示了不同氯化铵浓度对菌体密度(A600)曲线。
图22显示了不同氯化铵浓度对目的蛋白表达电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～7：氯化铵终浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、8g/L。
图23显示了rhFGF-21工程菌罐发酵生长曲线。
具体实施方式
实施例1工程菌的构建
根据GenBank中公布的人FGF-21天然碱基序列(基因序列登录号为AB021975.1)及氨基酸序列(氨基酸序列登录号为：BAA99415.1，209个氨基酸，1-28号为无活性的信号肽结构)，结合本发明人长期研究获得的经验，设计并合成了优化的rhFGF-21基因序列(SEQ IDNO：1)。然后根据常规DNA重组技术，以如下引物扩增，酶切后构建到pET-3c载体上的Nde I和BamH I之间，将阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得表达rhFGF-21的工程菌。表达产物经Western-blotting、质谱分析及氨基酸N端测序等，确证了结构，其保留了天然人FGF-21的一级结构。
P I：5’-CGCCATATGCACCCCATCCCTGAC-3’
Nde I
PII：5’-GAGGATCCTCAGGAAGCGTAG-3’
BamH I
该优化的的基因比天然人FGF-21基因在摇瓶培养的表达量要高30％以上，比常规优化的密码子要高10％左右。
实施例2表达方法的优化
rhFGF-21工程菌发酵工艺研究分三部分：摇瓶工艺研究、小试工艺(30L发酵罐)研究和中试工艺(200L发酵罐)研究。首先，通过摇瓶工艺研究，为小试放大工艺确定基本条件，并在发酵罐水平上对培养条件的控制和优化、建立流加补料的方式，进行工艺摸索与优化，最终确定了本工程菌高密度发酵优化生产工艺。实验结果，表达量大于20％，每升发酵液可收获菌体35g以上。本工艺再经过连续四批中试规模(200L发酵罐)的生产，证实工艺稳定，符合规模化生产技术要求，具备产业化价值。
1.1.rhFGF-21摇瓶发酵研究
摇瓶发酵的目的是通过一系列实验如：培养和诱导温度、pH值、溶解氧等情况及诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间等参数摸索，确立初步的发酵工艺，为小试放大研究提供数据参考。
1.1.1.rhFGF-21工程菌生长曲线
取工作种子批甘油菌(即甘油保存的工程菌，下同)，以1∶100(V/V)，接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜；再以1∶100(V/V)转种，37℃，200rpm振荡培养，每小时分别取样测定A600值，培养12h，取平均值以A600为纵坐标绘出菌体生长曲线。结果如图1所示，工程菌在0h～1.0h处于延迟期，1.0h～9.0h为对数生长期，9.0h～12.0h为平衡期，呈现S形生长曲线。其中1.0h～3.0h为对数生长初期，3.0h～6.0h为对数生长中期，6.0h～9.0h为对数生长后期，9.0h～12.0h为平衡期。重组蛋白一般选择在对数生长中期进行诱导。
1.1.2.rhFGF-21工程菌诱导时间的选择
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种，37℃，200rpm振荡培养至A600达到0.8～1.2时，将菌液以30mL每瓶，分装至250mL三角瓶中，添加IPTG至终浓度为1.0mmol/L开始诱导，每小时分别取样测定A600值，共诱导6h每小时取样品进行SDS-PAGE检测，分析目的蛋白的表达量。结果如图2和图3所示，在诱导4h后，目的蛋白表达量达到最大值，其后蛋白表达量基本稳定。综合考虑，确定最佳发酵诱导时间为4h。
1.1.3.rhFGF-21工程菌诱导剂(IPTG)浓度的选择
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种，37℃，200rpm振荡培养至A600达到0.8～1.2时，将菌液以30mL每瓶，分装至250mL三角瓶中，分别添加IPTG溶液至终浓度0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L进行诱导，共诱导4h。取诱导前、不同IPTG终浓度诱导4h样品进行SDS-PAGE检测，分析目的蛋白的表达量及诱导4h后的菌体密度。结果如图4和图5所示，0.5mmol/LIPTG菌体生长稳定，诱导蛋白量高，所以最终选择0.5mmol/L IPTG浓度诱导蛋白表达。
1.1.4.诱导时机对rhFGF-21工程菌的影响
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种，37℃，200rpm振荡培养。在菌体生长的不同时期(A600为0.2、0.4、0.8、1.2、1.8、2.5)，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG进行诱导，共诱导4h。取诱导前、不同诱导时机4h样品进行SDS-PAGE检测，分析目的蛋白的表达量及菌体密度。结果如图6和图7所示，rhFGF-21工程菌在对数生长初期(A600为0.2～0.4)加入诱导剂诱导，菌体密度均较低；在对数生长中期(A600为0.8～1.2)添加诱导剂，目的蛋白表达量较高，也能获得较高的菌体密度；在对数生长后期(A600为1.8～2.5)添加诱导剂，虽能获得较高的菌体密度，但目的蛋白的表达量较对数生长中期低。综合考虑，确定最佳诱导时机为工程菌的对数生长中期，即摇瓶A600为0.8～1.2时。
1.1.5.温度对rhFGF-21工程菌的影响
1.1.5.1温度对rhFGF-21工程菌生长的影响
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种，选择不同温度(温度从33℃、35℃、37℃、39℃)，200rpm振荡培养10h。每小时分别取样测定A600值。结果如图8所示，rhFGF-21工程菌前期适宜于35℃～37℃进行培养。最佳在37℃振荡培养，在各个时期，其菌密度均高于其他对照组。综合考虑，确定rhFGF-21工程菌的最适生长温度确定为37℃。
1.1.5.2温度对rhFGF-21工程菌表达的影响
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种，37℃，200rpm振荡培养至A600达到0.8～1.2时，将菌液以30mL每瓶，分装至250mL三角瓶中，选择不同温度(温度从33℃、35℃、37℃、39℃)，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG进行诱导，200rpm诱导4h。取诱导前、不同诱导温度4h样品进行SDS-PAGE检测，分析目的蛋白的表达量及菌体密度。结果如图9和图10所示，工程菌适合诱导温度范围为37℃～39℃，综合考虑产物的收率和表达量，最终确定最适诱导温度为37℃。
1.1.6 pH值对rhFGF-21工程菌的影响
1.1.6.1 pH值对rhFGF-21工程菌生长的影响
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种，选择不同pH值(初始pH值分别为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4)LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养，共培养10h。每小时分别取样测定A600值。结果如图11所示，rhFGF-21工程菌在pH范围是6.8～7.0时在在前期生长过程中其菌密度均高于其他对照组。综合考虑，确定rhFGF-21工程菌生长的最适pH范围为6.8～7.0。
1.1.6.2 pH值对rhFGF-21蛋白表达的影响
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种，37℃，200rpm振荡培养至A600达到0.8～1.2时，将菌液以30mL每瓶，分装至250mL三角瓶中，调节菌液pH(pH值从6.6、6.8、7.0、7.2、7.4)，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG进行诱导，在37℃下，开始诱导，共诱导4h。取诱导前、诱导4h的不同pH样品进行SDS-PAGE检测，分析目的蛋白的表达量及菌体密度。结果如图12和图13所示，诱导期发酵液的pH值对表达影响有差异，pH7.0～7.2时，菌体密度较高，蛋白表达量较高。综合考虑，确定rhFGF-21工程菌表达的最适pH范围为7.0～7.2。
1.1.7溶氧量对rhFGF-21工程菌的影响
1.1.7.1溶氧量对rhFGF-21工程菌生长的影响
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种于250mL三角瓶中(250mL三角瓶中分别装25、50、75、100mL培养基)，37℃，200rpm振荡培养，共培养10h。每小时分别取样测定A600值。结果如图14所示，工程菌适宜生长溶氧≥30％(用溶氧电极测得，250mL三角瓶中装液量小于50mL时溶解氧大于30％)。在此条件下，菌体的生长可达到较好的水平。
1.1.7.2溶氧量对rhFGF-21蛋白表达的影响
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种，37℃，200rpm振荡培养至A600达到0.8～1.2时，用100mL量筒(已灭菌)分别取25、50、75、100mL，加入到250mL三角瓶中(已灭菌)，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG进行诱导，在37℃、初始pH7.2、200rpm下开始诱导，共诱导4h。取诱导前、诱导4h样品进行SDS-PAGE检测，分析目的蛋白的表达量及菌体密度。结果如图15和图16所示，工程菌适宜表达溶氧≥30％(用溶氧电极测得，250mL三角瓶中装液量小于50mL时溶解氧大于30％)。在此条件下，菌体的表达可达到较好的水平。
1.1.8不同葡萄糖浓度对rhFGF-21工程菌的影响
1.1.8.1葡萄糖浓度对rhFGF-21工程菌生长的影响
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种于30mL液体LB培养基的250mL三角瓶中(250mL三角瓶中加葡萄糖终浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、5g/L、10g/L、20g/L)，37℃，200rpm振荡培养，共培养10h。每小时分别取样测定A600值。结果如图17所示，底物中碳源(葡萄糖)浓度对生长影响较小，当葡萄糖浓度在5g/L时生长较高，综合考虑，确定在生长时期底物碳源(葡萄糖)的浓度为5g/L。
1.1.8.2葡萄糖浓度对rhFGF-21蛋白表达的影响
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种，37℃，200rpm振荡培养至A600达到0.8～1.2时，将菌液以30mL每瓶，分装至250mL三角瓶中(已灭菌)，分别加入葡萄糖至终浓度0.5g/L、1g/L、2g/L、5g/L、10g/L、20g/L，混匀后再加入终浓度为0.5mmol/L IPTG进行诱导，在37℃、pH7.2、200rpm下开始诱导，共诱导4h。取诱导前、诱导4h样品进行SDS-PAGE检测，分析目的蛋白的表达量及菌体密度。结果如图18和图19所示，控制诱导期的葡萄糖浓度对表达和菌体密度整体起促进作用。当在5g/L的浓度时菌体密度和蛋白表达量较其他组偏高，综合考虑，确定诱导后葡萄糖的浓度控制在5g/L左右。
1.1.9不同氯化铵浓度对rhFGF-21工程菌的影响
1.1.9.1铵盐对rhFGF-21工程菌生长的影响
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种于30mL液体LB培养基的250mL三角瓶中(250mL三角瓶中加氯化铵终浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、8g/L)，37℃，200rpm振荡培养，共培养10h。每小时分别取样测定A600值。结果如图20所示，设定的不同铵盐对生长并无显著影响，其中在4g/L显示出一定的促菌体生长的优势。综合考虑，确定生长时培养基中铵盐浓度为4g/L。
1.1.9.2氯化铵浓度对rhFGF-21蛋白表达的影响
取工作种子批甘油菌，以1∶100(V/V)，分别接种到30mLLB培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜10～12h；再以1∶100(V/V)转种，37℃，200rpm振荡培养至A600达到0.8～1.2时，将菌液以30mL每瓶，分装至250mL三角瓶中(已灭菌)，分别加入氯化铵至终浓度0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、8g/L，混匀后再加入终浓度为0.5mmo1/L IPTG进行诱导，在37℃、pH7.2、200rpm下开始诱导，共诱导4h。取诱导前、诱导4h样品进行SDS-PAGE检测，分析目的蛋白的表达量及菌体密度。结果如图21和图22所示，设定的不同铵盐对表达有一定的影响，其中在4g/L浓度的菌体密度和表达量最高。综合考虑，确定诱导后培养基中铵盐浓度为4g/L。
1.1.10小试摇瓶研究工作总结：
通过上述对rhFGF-21工程菌在摇瓶中的小试工艺摸索，初步确立发酵生产工艺为：培养阶段温度为37℃，pH为6.8左右，溶解氧≥30％，培养基中葡萄糖浓度为5g/L，氯化铵浓度为4g/L；诱导阶段：温度为37℃，pH为7.2左右；溶解氧≥30％，诱导时机为对数生长期中期、诱导剂(IPTG)浓度为0.5mmol/L、诱导时间为4h。
1.2 30L发酵罐工艺研究(小试研究)
通过摇瓶实验，初步得到一定的实验数据，对培养基的组成进行了调整，并在30L发酵罐上进行了放大与验证，考察目前工艺的适用性，基本确定了发酵工艺参数。再通过之后的中试研究，最终确立稳定、具有产业化价值的发酵生产工艺，为以后顺利转入大规模生产做准备。
1.2.1材料
1.2.1.1一代种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠10.0，加纯化水溶解至100mL。
1.2.1.2二代种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉10.0，氯化钠4.0，磷酸二氢钾1.0，磷酸氢二钾3.0，加纯化水溶解至1000mL。
1.2.1.3发酵罐内培养基(g/L)：胰蛋白胨17.0，酵母粉23.0，氯化钠4.0，磷酸二氢钾1.0，磷酸氢二钾3.0，氯化铵4.0，葡萄糖5.0，加纯化水溶解至12L。
1.2.1.4补料溶液
碳源(w/v)：400g葡萄糖加纯化水溶解至1400mL。
氮源(w/v)：胰蛋白胨17.0g，酵母粉23.0g，氯化钠4.0g，磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾3.0g，硫酸镁6.0g，加纯化水溶解至700mL。
无机盐(w/v)：硫酸镁7.2g；氯化钙0.156g，分别加纯化水溶解至100mL。
生长因子(w/v)：维生素B1 0.06g加纯化水溶解至50mL。
碱溶液(v/v)：纯氨水与灭菌纯化水以1∶3比例混合，配制成1L碱液。
以上溶液混合为补液溶液。
1.2.1.5诱导剂
IPTG：将1.25g IPTG溶于100mL灭菌纯化水，0.22μL微孔滤器过滤除菌。
1.2.2上罐前培养方法
1.2.2.1一代种子液制备(活化)
取工作种子批甘油菌2支，以1∶100(v/v)接种到一代种子培养基中进行活化，以200rpm、37℃振荡培养3h～4h至A600达到0.8～1.2。
1.2.2.2二代种子液制备(扩增)
取一代种子液以1∶10的比例接种于二代种子培养基中进行扩增，以150rpm、37℃振荡培养10h～12h至A600达到6.0～8.0。
1.2.3罐发酵工艺摸索
1.2.3.1 rhFGF-21工程菌生长曲线
罐内培养基在线灭菌并控制温度至37℃，在火焰条件保护下，将二代种子液以1∶10(v/v)的比例进行接种，37℃发酵培养。通过流加碱控制pH在6.8～7.0之间，通过转数、通气量控制DO值≥30％，期间自然流加碳源控制营养供给。每小时分别取样测定A600值，培养12h，以A600为纵坐标绘出菌体生长曲线。结果如图23所示，rhFGF-21工程菌株在罐培养过程中A600在14～30阶段处于对数生长期中期。综合考虑，确定rhFGF-21诱导表达A600为15～17。
1.2.3.2罐发酵三批小试研究
罐内培养基灭菌并降温至37℃，在火焰条件保护下，将二代种子液以1∶10(v/v)的比例进行接种，并加入无机盐及生长因子，37℃发酵培养。通过流加补料控制pH在6.8～7.0之间，通过转数、通气量控制DO值≥30％。待培养至A600达到15～17，流加IPTG，37℃进行诱导培养。通过流加补料控制pH在7.0～7.2之间，通过转数、通气量控制DO值≥30％，诱导4h。当菌体密度趋于稳定时设定为发酵终点。发酵全过程中每1h取样测A600值；诱导后每小时留样进行SDS-PAGE检测。
1.2.3.3离心
发酵结束后，发酵液用管式离心机进行离心，收集菌体，称量湿重，-20℃冻存。
1.2.3.4结果
发酵培养过程中，参考小试发酵试验数据并根据罐实际情况进行适当调整，取得较为满意的结果。在发酵培养基组成中适宜的底物碳源(葡萄糖)的浓度可以有效的控制菌种的生长速率。根据溶解氧与pH值的变化情况，合理调节营养物质流加速率，和通过调节转数、通气量来调整至适于菌种生长的环境，并能很好的控制菌种的诱导时机。待A600培养至15～17时通过流加诱导剂(IPTG)进行诱导表达。在表达阶段根据pH变化情况，调节碳源流加速率并流加新鲜营养成分如氮源、磷酸盐类物质，提高了菌体产量及表达量。三批rhFGF-21工程菌发酵结果显示，rhFGF-21发酵既能高密度培养又能缩短发酵周期，连续三批发酵平均菌体湿重达到42.1g/L，平均表达量27.6％，适用于工程化生产。
表1三批发酵主要培养参数
(F20121201)
Figure BDA0001603865000000121
Figure BDA0001603865000000131
(F20121202)
Figure BDA0001603865000000132
(F20121203)
Figure BDA0001603865000000133
表2 IPTG诱导三批发酵培养结果
Figure BDA0001603865000000141
1.3 200L发酵罐工艺研究(中试研究)
通过完成30L发酵罐小试实验，初步得到一定的实验数据，然后在200L发酵罐上进行了放大与验证，考察目前工艺的适用性，通过连续中试四批rhFGF-21的发酵工艺研究，基本确定了发酵工艺参数。最终确立稳定、具有产业化价值的发酵生产工艺，为以后顺利转入大规模生产做准备。
1.3.1材料
1.3.1.1一代种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠10.0，加纯化水溶解至120mL。
1.3.1.2二代种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉10.0，氯化钠4.0，磷酸二氢钾1.0，磷酸氢二钾3.0，加纯化水溶解至1200mL。
1.3.1.3发酵罐内培养基(g/L)：胰蛋白胨17.0，酵母粉23.0，氯化钠4.0，磷酸二氢钾1.0，磷酸氢二钾3.0，氯化铵4.0，葡萄糖5.0，加纯化水溶解至84L。
1.3.1.4补料溶液
碳源(w/v)：2800.0g葡萄糖加纯化水溶解至9.8L。
氮源(w/v)：胰蛋白胨119.0g，酵母粉161.0g，氯化钠28.0g，磷酸二氢钾7.0g，磷酸氢二钾21.0g，硫酸镁28.0g，加纯化水溶解至7.0L。
无机盐(w/v)：硫酸镁50.4g；氯化钙1.092g分别加纯化水溶解至100mL。
生长因子(w/v)：维生素B1 0.42g加纯化水溶解至100mL。
碱溶液(v)：纯氨水800mL。
以上溶液混合为补液溶液。
1.3.1.5诱导剂
IPTG：将8.75g IPTG溶于200mL灭菌纯化水，0.22μL微孔滤器过滤除菌。
1.3.2上罐前培养方法
1.3.2.1一代种子液制备(活化)
取工作种子批甘油菌2支，以1∶100(v/v)接种到一代种子培养基中进行活化，以200rpm、37℃振荡培养3h～4h至A600达到0.8～1.2。
1.3.2.2二代种子液制备(扩增)
取一代种子液以1∶10的比例接种于二代种子培养基中进行扩增，以150rpm、37℃振荡培养10h～12h至A600达到6.0～8.0。
1.3.3研究结果
罐内培养基灭菌并降温至37℃，将二代种子液以1∶20(v/v)的比例进行接种，并加入无机盐及生长因子，37℃发酵培养。通过流加补料控制pH在6.8～7.0之间，通过转数、通气量控制DO值≥30％。待培养至A600达到15～17，流加IPTG，37℃进行诱导培养。通过流加补料控制pH在7.0～7.2之间，通过转数、通气量控制DO值≥30％，诱导4h。当菌体密度趋于稳定时设定为发酵终点。发酵全过程中每1h取样测A600值；诱导后每小时留样进行SDS-PAGE检测。
表3四批发酵主要培养参数
(F20161001)
Figure BDA0001603865000000151
Figure BDA0001603865000000161
(F20161002)
Figure BDA0001603865000000162
(F20161003)
Figure BDA0001603865000000163
Figure BDA0001603865000000171
(F20161004)
Figure BDA0001603865000000172
表4 IPTG诱导四批发酵培养结果
Figure BDA0001603865000000173
四批rhFGF-21工程菌中试发酵结果显示，rhFGF-21发酵既能高密度培养又能缩短发酵周期，连续4批发酵平均菌体湿重达到38.9g/L，平均表达量30.8％，适用于工程化生产。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 一种大规模制备重组人成纤维细胞生长因子21（FGF21）的生产方法
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 549
<212> DNA
<213> 人FGF21基因(Homo sapiens)
<400> 1
catccgattc cggatagcag cccgctgctg cagtttggtg gtcaggtgcg tcagcgttat 60
ctgtataccg atgatgcgca gcagaccgaa gcgcatctgg aaattcgtga agatggtacc 120
gtgggtggtg cggcggatca gagcccggaa agcctgctgc agctgaaagc gctgaaaccg 180
ggtgtgattc agattctggg tgtgaaaacc agccgttttc tgtgccagcg tccggatggt 240
gcgctgtatg gtagcctgca ttttgatccg gaagcgtgca gctttcgtga actgctgctg 300
gaagatggtt ataatgtgta tcagagcgaa gcgcatggtc tgccgctgca tctgccgggt 360
aataaaagcc cgcatcgtga tccggcgccg cgtggtccgg cgcgttttct gccgctgccg 420
ggtctgccgc cggcgctgcc ggaaccgccg ggtattctgg cgccgcagcc gccggatgtg 480
ggtagcagcg atccgctgag catggtgggt ccgagccagg gtcgtagccc gagctatgcg 540
agctaatga 549

Claims (3)

1.发酵罐发酵表达人FGF21的方法，其中发酵罐不小于30L，所述方法包括：
(1)接种人FGF21工程菌，其中，所述人FGF21工程菌是导入了人FGF21表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)，所述人FGF21表达载体是包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的人FGF21基因的pET-3c质粒，接种至的培养基包含胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化铵和葡萄糖，而且含量g/L为胰蛋白胨17.0、酵母粉23.0、氯化钠4.0、磷酸二氢钾1.0、磷酸氢二钾3.0、氯化铵4.0和葡萄糖5.0；
(2)在不加IPTG的情况下培养，其中，通过流加补料控制pH在6.8～7.0之间并控制DO值≥30％，于36.8～37.2℃培养至A600达到15～17时终止步骤(2)；和
(3)加入IPTG培养，其中，待A600达到15～17开始培养，流加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，通过流加补料控制pH在7.0～7.2之间，控制DO值≥30％，于36.8～37.2℃诱导培养，
其中，所述补料的溶液的制备方法如下：
2800.0g葡萄糖加纯化水溶解至9.8L；胰蛋白胨119.0g，酵母粉161.0g，氯化钠28.0g，磷酸二氢钾7.0 g，磷酸氢二钾21.0g，硫酸镁28.0g，加纯化水溶解至7.0L；硫酸镁50.4g，加纯化水溶解至100mL；氯化钙1.092g，加纯化水溶解至100mL；维生素B1 0.42g加纯化水溶解至100mL；纯氨水800mL；并将以上溶液混合。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤（2）或（3）的培养中，通过转数、通气量控制DO值≥30％。
3.权利要求1所述的方法，其中发酵罐大于100L。
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