KR100429331B1

KR100429331B1 - 재조합 효모를 이용한 에스에이치엘케이엔-1 단백질의대량생산방법

Info

Publication number: KR100429331B1
Application number: KR10-2002-0005189A
Authority: KR
Inventors: 우성환; 임형권; 김성근; 박두홍; 정경환
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2002-01-29
Filing date: 2002-01-29
Publication date: 2004-04-29
Also published as: KR20030065042A

Abstract

본 발명은 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모를 공기 공급량 5 내지 80 v/v, 압력 300 내지 1500 mbar, 교반속도 200 내지 1000 rpm의 조건으로 용존산소량을 10% 이상으로 유지하면서 글리세롤을 탄소원으로 하여 배양시키는 회분발효단계, 상기 효모에 유가배양배지를 공급하여 DO-스탯트 방법으로 배양시키는 유가배양단계, 및 상기 배지에서 글리세롤을 고갈시킨 후, 탄소원으로 메탄올을 첨가하여 배양시키면서 고농도로 shLkn-1를 배양액 중으로 분비시키고, 발효물을 주기적으로 덜어내는 반연속식 유가배양단계를 포함하는 재조합 효모를 이용한 shLkn-1 단백질의 대량생산방법에 관한 것이다. 상기 방법에 따라 조혈모세포 증식억제 기능을 갖는 C6 β-케모카인에 속하는 shLkn-1의 대량생산을 통하여 항암보조제로서의 실용화를 가능하게 한다.

Description

재조합 효모를 이용한 에스에이치엘케이엔-1 단백질의 대량생산방법{Mass production method of shLkn-1 protein using recombinant yeast}

본 발명은 재조합 효모를 이용한 shLkn-1 (short version of human Leukotactin-1)의 대량 생산방법에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 조혈모세포증식억제 기능을 갖는 C6 β-케모카인에 속하는 shLkn-1을 재조합 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 형질전환하여 대량생산하는 방법에 관한 것이다.

조혈모세포는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등을 만드는 미분화된 골수조혈세포의 조상세포로, 몸 전체에서 발견되며, 특히 골수에서 대량생산된다. 조혈모세포의 이상과 관련된 질환으로 재생불량성 빈혈, 백혈병, 골수이형성 증후군 등이 있고, 또한 항암제의 지나친 투여로 조혈모세포의 손상을 야기할 수 있다.

케모카인은 분자량이 작은 염기성 단백질들로 이루어진 사이토카인류에 속하는 물질로서, HIV-억제작용, 면역 조절작용, 조혈 모세포의 분열 억제능(참조: Cocchi, F. et al., Science, 270:1811(1995); Wolpe, S.D. et al., J. Exp. Med., 167:570(1988); Graham, G.J. et al., Nature, 344:442(1990); Broxmeyer, H.E. et al., Blood, 76:1110(1990); Youn, B. S. et al., J. Immunol., 155:2661-2667(1995)) 등의 생물학적 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다.

한편, 케모카인 물질 중 조혈모세포 증식억제 기능을 갖고 있는 것으로 밝혀진 MIP-1α, IL-8, MCP-1, MPIF-1등에 대한 생물학적 기초 연구와 임상적 응용을 위한 연구가 여러 연구 기관들에 의하여 경쟁적으로 이루어지고 있는 상황이고, 이중, MIP-1α의 경우에는 시험관내(in vitro) 뿐만 아니라 화학항암제를 투여한 실험동물을 이용한 생체내(in vivo) 동물실험에서 화학항암제로부터의 조혈모세포 보호활성이 확인되었으며, 현재 영국의 British Biotech Pharmaceutical 사와 미국의 Genetics Institutes사에서 이의 약제화를 위한 전임상 및 임상시험을 수행 중에 있다.

반면에 국내 기업이나 연구기관에 의한 케모카인 물질의 약제화 시도는 전무한 실정으로, 화학항암제로부터 조혈모세포를 보호할 수 있는 약제 등으로 실용화하기 위한 케모카인 물질의 대량생산을 위한 발현체계의 개발에 대한 요구가 있다.

본 발명자들은 기 출원한 국제 특허출원 PCT/KR99/00262호에서 조혈모세포 증식억제 인자인 Lkn-1의 트렁케이티드 폼(truncated form)으로 Lkn-1 보다 생물학적 활성이 큰 shLkn-1의 유전자를 확보하고, 이를 메탄올 자화효모균인 파이키아 파스토리스에서 대량 생산하고자 발현체계를 구축(Pichia pastorisGS115:pPM2-HF, 한국종균협회:KCCM-10159) 하였다.

그러나, 이와같은 재조합 파이키아 파스토리스라는 효모로부터 발현체계를 이용한 단백질의 대량생산방법은 아직까지 개발되지 못하고 있는 실정이다.

이에 본 발명에서는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모인 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115;pPM2-HF(KCCM-10159)를 종래의 유가배양배지 Ⅰ의 조성을 변화시켜 세포성장구간을 반으로 줄이고, 메탄올을 반연속식 유가배양단계 초기부터 용존산소값을 기준값에서 일정범위내로 유지하면서 공급시키고, 일정주기마다 발효액의 일부를 덜어내는 과정을 반복하는 반연속식 유가배양을 통하여 shLkn-1을 대량생산할 수 있었고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 shLkn-1이라 명명된 기존의 Lkn-1 유전자 보다 생물학적 활성이 큰 조혈모세포 증식억제인자를 대량생산하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 방법은 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모를 공기 공급량 5 내지 80 v/v, 압력 300 내지 1500 mbar, 교반속도 200 내지 1000 rpm의 조건으로 용존산소량을 10% 이상으로 유지하면서 글리세롤을 탄소원으로 하여 배양시키는 회분발효단계, 상기 효모에 유가배양배지를 공급하여 DO-스탯트 방법으로 배양시키는 유가배양단계, 및 상기 배지에서 글리세롤을 고갈시킨 후, 탄소원으로 메탄올을 첨가하여 배양시키면서 고농도로 shLkn-1를 배양액 중으로 분비시키고, 발효물을 주기적으로 덜어내는 반연속식 유가배양단계로 shLkn-1를 대량생산하는 것으로 이루어진다.

도 1은 재조합 효모 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115로부터 shLkn-1을 생산하는데 있어서 순산소의 공급없이 용존산소농도를 일정수준 이상으로 유지함을 나타낸 그래프이고,

도 2는 본 발명의 유가배양배지 Ⅰ에 의한 균체의 성장속도의 증가를 나타낸 그래프이고,

도 3은 메탄올의 공급방식변화에 따른 용존산소량의 변화를 도식화한 그래프이고,

도 4는 메탄올 공급방식에 따른 shLkn-1의 생산량을 비교한 그래프이고,

도 5는 발효 시간에 따라 배양액 중에 분비된 shLkn-1의 발현양상을 나타낸 SDS page 사진이다.

이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모를 일정한 물리적 조건을 통하여 순산소의 공급없이 용존산소량을 유지하면서 글리세롤을 탄소원으로 하는 회분발효 단계, 상기 효모에 유가배양배지를 공급하여 DO-스탯트 방법으로 배양시키는 유가배양단계, 및 상기 배지에서 글리세롤을 고갈시킨 후, 탄소원과 shLkn-1 유도물질인 메탄올의 공급속도를 결정하고, 메탄올을 첨가하면서 배양된 발효물을 덜어내는 반연속식 유가배양단계를 포함하는 shLkn-1의 대량생산 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모로는 본 출원인에 의해 기 출원된 것으로서파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115;pPM2-HF(KCCM-10159)이다.

본 발명의 shLkn-1의 대량생산방법은 우선, 효모를 글리세롤을 탄소원으로 하여 배양하다가 적정 세포농도로 자랐을 때 탄소원을 메탄올로 완전히 바꾸어줌으로써 shLkn-1 단백질이 발현 및 분비되도록 한다.

보다 상세한 발효공정은 하기와 같다.

본 발명에서는 먼저 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모를 워킹셀뱅크로 접종하여 24시간내에 적절한 균체량과 활성도를 얻어낼 수 있도록 종배양시키고, 이는 계속되는 회분배양단계의 일정한 배양시간 유지와 균체의 활성능력에 중요하다.

본 발명의 회분발효 및 유가배양단계는 세포성장 단계로서, 먼저 회분발효 단계는 발현 및 분비에 알맞은 세포량이 될 때까지 세포를 양적으로 증대시키는 과정으로 종배양액을 1% 이상 접종하고, 탄소원으로 글리세롤을 사용하여 원하는 단백질의 발현 및 분비를 억제하면서 세포를 양적으로 증대시킨다. 회분발효단계 후반부에서는 균체들의 왕성한 호흡작용으로 인해 용존산소량이 급격히 고갈되어 일반적으로 순산소를 공급하는 방법을 사용하나, 본 발명에서는 공기공급량 5 내지 80 v/v, 압력 300 내지 1500 mbar, 교반속도 200 내지 1000 rpm의 물리적 조건을 조절하는 것을 회분발효단계 후반부에서부터 발효 종료시까지 적용함으로써 용존산소량을 10% 이상으로 유지할 수 있었다(도 1 참조). 이로 인하여 대규모 발효조에서 순산소를 사용하지 않고도 용존산소값을 일정수준 이상으로 유지하여 생산비용을 감소시킬 수 있었다.

유가배양단계는 발효조 내의 용존산소량을 세포 영양상태의 지표로 삼는 단계로 용존산소량이 일정 수준 이상 증가하면 영양성분을 보충하여 주고, 이후 보충된 영양성분의 소비와 함께 감소된 용존 산소량이 영양성분의 고갈로 인해 다시 증가하면, 영양성분을 또 다시 보충하여 주는 DO-스탯트 방법에 의해 고농도 배양을 수행하였다. 본 발명에서 사용된 유가배양배지는 글리세롤 100 g/L 내지 1000 g/L, 황산 칼슘 반수염 0.1 g/L 내지 1 g/L, 황산 칼륨 1 g/L 내지 20 g/L, 황산 마그네슘 1 g/L 내지 20 g/L, 수산화칼륨 1 g/L 내지 10 g/L, 포스포릭산 1 ml/L 내지 50 ml/L, 효모미량금속용액 1 ml/L 내지 50 ml/L 으로 구성되고, 이는 종래 유가배지 I (표 1)에 포함되어 있지 않은 세포성장에 필요한 염성분, 효모미량금속, 인 성분의 보충과 포스포릭산 첨가와 이에 따른 pH 변화를 막기 위해 자동으로 첨가되는 질소원으로써의 암모니아수의 공급을 통해 종래 배지(표 1)로는 원하는 균체량을 얻기 위해 14시간 이상이 소요되는 세포성장 구간을 7시간으로 단축할 수 있었으며, 균체량은 기존의 배지를 사용하였을 때의 균체량과 동일한 흡광광도량 300을 얻을 수 있었다.

반연속식 유가배양단계는 상기 글리세롤과 같은 탄소원을 고갈시킨 후, 발현 유도물질이면서 세포의 탄소원으로 사용되는 메탄올을 첨가하여 유가배양시켜 발효물을 얻는 단계로, 이때 세포성장 자체는 세포성장 단계에 비하여 탄소원의 이용속도 차이에 의하여 둔화된다. 그러나, 증가한 세포량으로부터 효과적으로 원하는 단백질을 얻을 수 있다. 상기 단계에서는 shLkn-1의 본격적인 생산을 위해 메탄올 공급양과 공급방식이 매우 중요한 인자로 작용하게 된다. 메탄올이 과량으로 공급되면 균체가 사멸하게 되어 shLkn-1을 생산하지 못하며, 또 너무 소량의 메탄올이 첨가되면 발현량이 작게되는 문제를 안고있기 때문에 적절한 양의 메탄올의 공급이 높은 생산량을 얻을 수 있는 핵심인자인 것이다.

이를 위해 본 발명에서는 반연속식 유가배양단계의 초기부터 용존산소값을 기준값에서 일정범위내로 유지하는 방식으로 메탄올을 공급하고, 발효조의 워킹볼륨의 포화를 극복하기 위하여 반연속식 유가배양법을 도입하였다. 상기 메탄올 공급 방식은 용존산소량을 주시하며 적절한 값으로 메탄올을 첨가하는 방식으로 용존산소량의 기준값을 단계적으로 70 내지 30으로 하향 설정을 하고, 설정된 기준값에서 용존산소값이 ±20% 내에서 유지하도록 메탄올 첨가 속도를 조절하여 발효기간 중 발효조내에 잔존하는 메탄올 농도의 측정없이 shLkn-1의 발현을 증가시킬 수 있었다. 상기 메탄올 공급 방식은 균체들이 탄소원의 공급시 이를 이용하기 위해 왕성한 호흡작용을 일으키게 되어 용존산소값이 떨어지게 되고, 탄소원의 공급을 중단하면 용존산소값이 올라가게 되는 원리를 이용한 것이다. 즉, 용존산소기준값 이상으로 용존산소량이 측정되면 적정한 속도로 메탄올을 공급하여 주고 용존산소량이 기준값 이하가 되면 메탄올의 공급을 중단하는 방식을 통하여 용존산소값을 기준값에서 ±20%로 유지시킬 수 있었다.

한편, 상기 반연속식 유가배양법은 발효조의 발효액이 메탄올 공급으로 인하여 워킹볼륨이 포화되었을 때 더 이상 발효를 수행할 수 없는 발효조의 워킹볼륨을 극복하기 위해 10% 이상의 발효액을 shLkn-1생산을 위하여 덜어내고, 메탄올의 공급을 계속함으로써 발현을 지속적으로 유도하였고, 이 단계를 반복함으로써 계속하여 shLkn-1을 얻어 낼 수 있었다. 이 과정 중, 발효액의 일부를 덜어낼 때, 메탄올의 공급속도를 용존산소값을 기준값에서 ±20% 이상 벗어나지 않도록 하는 상기 메탄올 공급 방식을 통하여 조절하였고, 상기 반연속식 유가배양 과정을 8회 이상 반복하여 분비된 shLkn-1을 발효 200시간 이상 동안 1 L의 배양액 당 1 g 이상 얻을 수 있었다.

종래 메탄올 공급방식은 메탄올 공급속도를 결정하여 발효를 진행하고, 일정시간 간격으로 배지내 잔존하는 메탄올의 양을 측정하여 메탄올의 공급속도를 수정하는 과정을 계속적으로 반복해야 함으로써 메탄올의 측정이 실시간으로 이루어지지 않아 과잉 또는 과소 공급으로 인해 세포가 사멸하거나 단백질 발현이 실패하여 생산량이 줄어드는 즉, 발효액의 일부를 덜어내면 발효조 안의 세포수가 급감하게 되고, 이에 따라 요구되는 메탄올의 공급양을 변경하여야 하는데 실시간으로 이를 해결할 수가 없는 문제점을 본 발명에서 적용한 용존산소기준값을 이용한 메탄올 공급방식 및 공급시의 주입속도 조절 방식의 단백질 생산량을 연속적으로 얻어 낼 수 있는 반연속식 유가배양법으로 세포의 요구에 따라 메탄올 공급펌프의 켜짐과 꺼짐을 자동 조절하여 급격한 세포수의 변화에도 메탄올 공급이 적절하게 이루어지도록 하였다.

본 발명의 유가배양배지 Ⅰ, 메탄올 공급방식, 반연속식 유가배양 과정을 포함하는 배양방법을 통하여 조혈모세포억제 기능을 갖는 shLkn-1 단백질을 저비용으로 대량생산할 수 있었다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예

재조합 shLkn-1의 생산균주로 호스트는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115를 사용하였고, 발현벡터 pPM2에 shLkn-1- 유전자를 삽입하여 기 확립한 재조합 파이키아파스토리스(Pichia pastorisstrain : KCCM-10159)로부터 원하는 단백질인 shLkn-1을 효과적으로 생산하기 위하여 종래 알려진 생산공정(Stefan Mining, Alicia Serrano, Pau Ferrer, Carles Sola, Rolf D. Schmid, Francisco Valero, Optimazation of the high-level production of Rhizopus oryzae lipase inPichia pastoris, Journal of Biotechnology, 88, 2001, 59-70)을 기초로 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 배지 조성으로 기본적인 발효공정에 대한 실험을 수행하였다.

발효배지 조성
	성분	함량
회분발효배지	글리세롤CaSO_4·2H₂OK₂SO₄MgSO₄KOHNH₄OH(25%)H₃PO₄(85%)*효모미량금속용액	40.00 g/L0.93 g/L18.20 g/L14.9 g/L4.13 g/L30.00 ml/L26.7 ml/L4.35 ml/L
유가배양배지 Ⅰ	글리세롤*효모미량금속용액	500 g/L12.00 ml/L
유가배양배지 Ⅱ	메탄올*효모미량금속용액	500 g/L12.00 ml/L
*효모미량금속용액	CuSO_4·5H₂OKIMnSO_4·H₂ONaMo_·H₂OH₃BO₄CoCl₂ZnCl₂FeSO_4·H₂O바이오틴H₂SO₄	6.00 g/L0.08 g/L3.00 g/L0.20 g/L0.02 g/L0.50 g/L20.00 g/L65.00 g/L0.30 g/L5 ml/L

실시예 1

재조합 shLkn-1의 회분 발효 및 유가배양단계

우선, 종균배양은 YDP에서 24시간의 진탕배양을 통하여 수행하였다. 발효조는 75 L 규모의 발효조를 사용하였다. 초기 시작배지는 20 L이었으며 DO-스탯트 유가배양방법에 의하여 최종 워킹부피가 약 40 L가 되도록 고농도배양을 수행하였다. 상기 YPD에서 종균배양을 수행한 후, 초기 시작배지에 10%를 접종하여 회분배양을 수행하였다. 초기 배양 조건은 배양 온도 25℃ 내지 35℃, pH 2 내지 8, 교반속도 200 내지 1000 rpm, 압력 300 내지 1500 mbar, 공기공급량 5 v/v 내지 100v/v 이었다. 회분배양의 후반부에 균체들의 왕성한 호흡작용으로 인해 용존산소량이 급격히 고갈되는 경우 일반적으로 순산소를 공급하나, 본 발명에서는 공기공급량 5 내지 80 v/v, 압력 300 내지 1500 mbar, 교반속도 200 내지 1000 rpm의 물리적 조건을 조절하는 것을 통해 순산소 공급없이 용존산소량을 10% 이상으로 유지하였다.

회분 배양 후반부 DO값이 갑자기 증가하는 신호를 회분배양의 끝으로 보고 유가배양배지를 공급함으로써 유가배양을 수행하였다. 하기 표 2에 나타낸 배지 조성을 사용한 것을 제외하고, 상기 회분배양 후반부의 물리적 조건과 동일하게 하여 유가배양시켰다. 종래의 유가배양배지로 배양시킨 경우와 비교하여 세포성장 양상을 도 2에 나타내었다.

	유가배양배지 Ⅰ	본 발명의 유가배양배지
조성	글리세롤 500 g/L	글리세롤 100 g/L 내지 1000 g/L
	*효모미량금속용액 12 ml/L	황산 칼슘 반수염 0.1 g/L 내지 1 g/L
		황산 칼륨 1 g/L 내지 20 g/L
		황산 마그네슘 1 g/L 내지 20 g/L
		수산화칼륨 1 g/L 내지 10 g/L
		포스포릭산 1 ml/L 내지 50 ml/L
		효모미량금속용액 1 ml/L 내지 50 ml/L

도 2에 나타낸 바와 같이 종래의 배지를 사용하여 유가배양시킨 경우 세포농도 흡광광도량 300을 얻기 위한 소요시간이 14시간이었으나, 본 발명의 배지의 경우 7시간만에 같은 흡광광도량의 균체를 얻을 수 있었다.

실시예 2

메탄올 공급 방식

유가배양단계가 끝난 후 배지공급을 중단하고, 상기 실시예 1의 배양 조건을 유지하면서, 배지의 공급 없이 배치상태로 방치함으로써 용존산소값이 100 이상이 되어 지속되는 시간을 30분 이상 유지시켜서 배양기내에 남아있는 글리세롤을 모두 소비시키고, 그 다음 메탄올을 포함하는 유가배양배지 Ⅱ를 공급하여 유가배양시켰다.

상기 유가배양배지 Ⅱ의 공급 방식을 하기 A-C의 방식으로 수행하였고, 그 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.

A: 일정한 속도로 유가배양배지 Ⅱ를 공급

B: 일정한 속도로 유가배양배지 Ⅱ를 공급하다가 용존산소값을 기준값에서 ±20% 이상 벗어나지 않도록 하는 방식으로 변환

C: 처음부터 용존산소기준값을 30 내지 70으로 설정하고 기준값에서 ±20% 이상 벗어나지 않도록 메탄올 공급속도를 조절하는 방식으로 유가배양배지 Ⅱ 공급

상기한 바와 같이 유가배양배지 Ⅱ의 공급에 따른 용존산소량의 변화를 도 3에 나타내었다. C의 공급 방식을 사용하였을 경우 반연속식 유가배양단계에서 용존산소량을 일정하게 유지할 수 있었다.

또한, 배양액 중으로 분비된 shLkn-1의 발현양을 도 4에 나타내었다. 상기 도 4에서 나타낸 바와 같이, C방식으로 메탄올을 공급하는 것이 가장 높은 발현양을 얻을 수 있음을 확인하였으며, 배양액 중으로 분비된 shLkn-1 단백질의 양이 발효시간 경과에 따라 점차 증가되는 것을 도 5의 SDS page 분석을 통하여 확인할 수있었다.

실시예 3

반연속식 유가배양

상기 반연속식 유가배양단계의 진행 중 발효조의 발효액이 메탄올 공급으로 인하여 워킹볼륨이 포화되었을때, 10% 이상의 발효액을 덜어내고 메탄올의 공급을 계속함으로써 발현을 지속적으로 유도하는 과정을 수행하며 이 단계를 반복함으로써 계속하여 shLkn-1을 얻어 낼 수 있었다.

반연속식 유가배양단계 진행 중 발효조의 발효액이 계속되는 메탄올 공급으로 인해 40 L로 포화되면, 샘플포트를 통해 멸균용기에 발효액 중 10% 부피 이상 얻어내고 균체를 제거한 후 상등액을 모아 저온냉동기에 보관하였고, 그 후 배양액을 매 24시간 마다 공급되는 유가배지 II의 총 부피만큼 들어 내어 상기와 같은 방법으로 균체를 제거하고 보관하였다. 반연속식 유가배양 과정을 24시간을 주기로 8회 이상 수행하여 shLkn-1을 발효 200시간 이상 동안 지속적으로 1 L의 배양액 당 1 g 이상 얻었다.

이때, 발효액의 일부를 덜어내면 세포의 양이 줄어들기 때문에 메탄올의 공급속도를 조절하여야 하는데, 탄소원의 소비 속도는 세포의 양에 비례하기 때문에 용존산소값을 기준값에서 ±20% 이상 벗어나지 않도록 하는 상기 메탄올 공급 방식을 통하여 메탄올의 공급속도가 자동조절 되도록 하였다.

또한, 상기 발현 및 분비된 shLkn-1의 분석 및 정량은 SDS-PAGE 분석(Novex, 4∼20% Tris-Glycine gradient gel)과 HPLC 분석(Gilson 322 322 HPLC system,Gilson UniPoint system software 3.0, Vydac사의 C18 protein peptide column)을 통하여 수행하였다.

전술한 바와 같이, 본 발명에서는 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 효모를 이용하여 상기 일정한 물리적 조건에서 탄소원으로 글리세롤을 이용하여 회분발효시키고, 본 발명의 유가배양배지로 세포성장 구간을 반으로 줄이고, 일정 범위 내로 용존산소량을 유지하는 메탄올 공급방식과 반연속식 유가배양을 통하여 대규모 발효조에서 shLkn-1을 저비용으로 대량생산하여 약제로 실용화할 수 있다.

Claims

파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모를 공기 공급량 5 내지 80 v/v, 압력 300 내지 1500 mbar, 교반속도 200 내지 1000 rpm의 조건으로 용존산소량을 10% 이상으로 유지하면서 글리세롤을 탄소원으로 하여 배양시키는 회분발효단계;

상기 효모에 유가배양배지를 공급하여 DO-스탯트 방법으로 배양시키는 유가배양단계; 및

상기 배지에서 글리세롤을 고갈시킨 후, 탄소원으로 메탄올을 첨가하여 배양시키면서 고농도로 shLkn-1를 배양액 중으로 분비시키고, 발효물을 주기적으로 덜어내는 반연속식 유가배양단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 효모를 이용한 shLkn-1 단백질의 대량생산방법.
제1항에 있어서, 상기 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115;pPM2-HF(KCCM-10159)인 것을 특징으로 하는 대량생산방법.
제1항에 있어서, 상기 세포성장을 위한 유가배양배지는 글리세롤 100 g/L 내지 1000 g/L, 황산 칼슘 반수염 0.1 g/L 내지 1 g/L, 황산 칼륨 1 g/L 내지 20 g/L, 황산 마그네슘 1 g/L 내지 20 g/L, 수산화칼륨 1 g/L 내지 10 g/L, 포스포릭산 1 ml/L 내지 50 ml/L, 효모미량금속용액 1 ml/L 내지 50 ml/L 으로 구성되는 것을 특징으로 하는 대량생산방법.
제1항에 있어서, 상기 메탄올은 반연속식 유가배양단계의 초기부터 용존산소 기준값을 30 내지 70 사이로 설정하고, 이 기준값에서 용존산소값이 ±20% 이상 벗어나지 않도록 유지하면서 공급되는 것을 특징으로 하는 대량생산방법.
제1항에 있어서, 상기 반연속식 유가배양단계는 24시간 마다 발효액의 10% 이상을 주기적으로 덜어내는 과정을 반복하여 재조합 단백질 생산 시간을 연장하여 생산성을 높히는 것을 특징으로 하는 대량생산방법.
제1항에 있어서, 상기 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115를 이용하여 재조합 shLkn-1을 세포 밖으로 고농도로 분비시키는 것을 특징으로 하는 대량생산 방법.