ES2709381T3 - Método de enriquecimiento de biomasa de microalgas con proteínas - Google Patents

Abstract

Método de enriquecimiento con proteínas de una microalga cultivada en heterotrofia, microalga del género Chlorella, caracterizado por que el cultivo heterotrófico comprende una etapa que tiene como objeto limitar el crecimiento de dicha microalga por una carencia del medio de fermentación de glucosa con un suministro de glucosa de modo continuo en cantidad insuficiente con el fin de obtener una tasa de crecimiento de la microalga inferior a la de dicha microalga en ausencia de limitación nutricional, y por un aumento de la temperatura de fermentación con respecto a la temperatura óptima de fermentación, permitiendo de ese modo conseguir un contenido de proteínas de la biomasa superior a un 50 % en peso.

Description

DESCRIPCION

Metodo de enriquecimiento de biomasa de microalgas con protemas

La presente invencion se refiere a un metodo de enriquecimiento de biomasa de microalgas con protemas, mas particularmente del genero Chlorella, incluso mas particularmente de la especie Chlorella sorokiniana o Chlorella protothecoides. La presente invencion tambien se refiere a un metodo de enriquecimiento con protemas de la biomasa de ciertas microalgas, mas particularmente de Chlorella protothecoides, protemas cuyo contenido de arginina y glutamina es notablemente elevado.

Las algas, macro y micro, tienen una riqueza espedfica en gran parte sin explorar. Su explotacion para fines alimentarios, qmmicos o bioenergeticos es incluso muy secundaria. Sin embargo esconden compuestos de gran valor, en riqueza como en abundancia.

Las microalgas son en efecto fuentes de vitaminas, lfpidos, protemas, azucares, pigmentos y antioxidantes.

Las algas y microalgas interesan por lo tanto en el sector industrial que las usa para la fabricacion de complementos alimentarios, alimentos funcionales, cosmeticos, medicamentos o para acuicultura.

Las microalgas son ante todo microorganismos fotosinteticos que colonizan todos los biotopos expuestos a la luz. A escala industrial, su cultivo monoclonal se realiza en fotobiorreactores (condiciones autotroficas: en la luz con CO2) o para algunas entre ellas, tambien en fermentadores (condiciones heterotroficas: en la oscuridad en presencia de una fuente de carbono).

Varias especies de microalgas son en efecto capaces de desarrollarse en ausencia de luz: Chlorella, Nitzschia, Cyclotella, Tetraselmis, Crypthecodinium, Schizochytrium.

Ademas se calcula que el cultivo en condiciones heterotroficas tiene un coste 10 veces menos elevado que en condiciones fototroficas ya que, para el Experto en la tecnica, estas condiciones heterotroficas permiten:

- el uso de fermentadores identicos a los usados para las bacterias y las levaduras y permiten el control de todos los parametros de cultivo.

- la produccion de biomasas en cantidad mucho mas elevada que la que se obtiene mediante cultivo basado en la luz.

La explotacion rentable de las microalgas generalmente necesita el dominio de las condiciones de fermentacion lo que permite acumular sus componentes de interes, tales como:

- pigmentos (clorofila a, b y c, p-caroteno, astaxantina, lutema, ficocianina, xantofilas, ficoeritrina...) cuya demanda es creciente, tanto por sus propiedades antioxidantes notables, como por su suministro de colores naturales en la alimentacion,

- lfpidos, esto con el fin de optimizar su contenido de acidos grasos (hasta un 60 %, incluso un 80 % en peso de su materia seca) en particular para:

• aplicaciones en biocarburantes, y tambien

• aplicaciones en Alimentacion humana o animal, cuando las microalgas seleccionadas producen acidos grasos poliinsaturados o PUFA denominados "esenciales" (es decir, proporcionados por la alimentacion ya que no son producidos de forma natural por el ser humano o el animal), o

- protemas, esto con el fin de optimizar las cualidades nutritivas o por ejemplo para favorecer el suministro de aminoacidos de interes.

En el contexto del suministro de aminoacidos de interes, en efecto puede ser ventajoso disponer de fuentes de protemas ricas en arginina y en glutamato.

La arginina es un aminoacido que presenta numerosas funciones en el reino animal.

La arginina se puede degradar y por lo tanto puede servir de fuente de energfa, de carbono y nitrogeno para la celula que la asimila.

En diversos animales, entre ellos los mairnferos, la arginina se descompone en ornitina y en urea. Esta ultima es una molecula nitrogenada que se puede eliminar (mediante excrecion en las orinas) con el fin de regular la cantidad de compuestos nitrogenados presentes en las celulas de los organismos animales.

La arginina permite la smtesis del monoxido de nitrogeno (NO) mediante la NO sintetasa, interviniendo de ese modo en la vasodilatacion de las arterias, lo que reduce la rigidez de los vasos sangumeos, aumenta el flujo sangumeo y mejora de ese modo el funcionamiento de los vasos sangumeos.

Los complementos alimentarios que contienen arginina se recomiendan para estimular la salud del corazon, la funcion vascular, para prevenir « la agregacion de las plaquetas » (riesgo de formacion de coagulos sangumeos) y para reducir la presion arterial.

La implicacion de la arginina en la cicatrizacion de las heridas esta relacionada con su papel en la formacion de prolina, otro aminoacido importante para la smtesis de colageno.

Por ultimo la arginina es un compuesto que se usa con frecuencia, en particular por los deportistas, en las bebidas energeticas.

Con respecto al acido glutamico, no es solamente uno de los componentes elementales usados para la smtesis de las protemas, sino que tambien es el neurotransmisor excitante mas extendido en el sistema nervioso central (encefalo medula espinal) y es un precursor del GABA en las neuronas GABAergicas.

Con el codigo « E620 », el glutamato se usa como potenciador del sabor de los alimentos. Se anade a las preparaciones alimentarias para reforzar su gusto.

Ademas del glutamato, el Codigo Alimentario tambien ha reconocido como potenciadores del sabor a sus sales de sodio (E621), de potasio (E622), calcio (E623), amonio (E624) y magnesio (E625).

El glutamato (o sus sales) a menudo esta presente en los platos listos para tomar (sopas, salsas, patatas fritas, platos cocinados). Normalmente tambien se usa en la cocina asiatica.

En la actualidad se usa frecuentemente en combinacion con aromas en los aperitivos (sabor a beicon, sabor a queso). Esto permite de destacar el sabor del beicon, del queso, etc. Es raro encontrar un aperitivo que no lo contenga.

Tambien se encuentra en ciertas capsulas de medicamentos pero no por sus funciones gustativas.

Por ultimo, es el componente mayoritario de los aditivos de cocina (cubitos de caldo, fondos de salsas, salsas, etc.). Para conseguir explotar las riquezas metabolicas de las microalgas, tambien se ha trabajado mucho en primeros metodos de fermentacion que permiten obtener altas densidades celulares (acronimo en ingles: HCD para High-Cell-Density), con el fin de obtener rendimientos y productividades maximas en protemas o en lfpidos.

El objeto de estos cultivos de HCD fue la obtencion de la concentracion lo mas elevada posible del producto deseado en el transcurso de tiempo mas corto.

Esta recomendacion se verifica por ejemplo para la biosmtesis de astaxantina mediante Chlorella zofingiensis, en la que se muestra que el crecimiento de la microalga se correlaciona directamente con la produccion de este compuesto (Wang y Peng, 2008, World J Microbiol. Biotechnol., 24 (9), 1915-1922).

Sin embargo, el hecho de mantener el crecimiento en su tasa maxima (|j, en h-1) no siempre se correlaciona con la produccion elevada del producto deseado.

En efecto para los especialistas del campo se manifesto rapidamente que por ejemplo habfa que someter a las microalgas a un estres nutricional que limita su crecimiento cuando se desea hacer que produzcan importantes reservas lipfdicas.

Por lo tanto de aqm en adelante se ha procedido al desacoplamiento de crecimiento / produccion en los metodos de fermentacion.

Por ejemplo, para favorecer la acumulacion de acidos grasos poliinsaturados (en el centro documento acido docosahexaenoico o DHA), la solicitud de patente WO 01/54510 recomienda disociar el crecimiento celular y la produccion de acidos grasos poliinsaturados.

De forma mas particular se reivindica un metodo para la produccion de lfpidos microbianos, que comprende las etapas que consisten en:

(a) realizar una fermentacion de un medio que comprende microorganismos, una fuente de carbono y una fuente nutritiva limitante y asegurando condiciones suficientes para mantener una tasa de oxfgeno disuelto de al menos aproximadamente un 4 % de la saturacion en dicho medio de fermentacion para aumentar la biomasa;

(b) a continuacion proporcionar condiciones suficientes para mantener una tasa de oxfgeno disuelto aproximadamente igual o inferior a un 1 % de la saturacion en dicho medio de fermentacion y proporcionar condiciones suficientes para permitir que dichos microorganismos produzcan dichos lfpidos;

(c) y recoger dichos lfpidos microbianos, en el que al menos aproximadamente un 15 % de dichos lfpidos microbianos estan constituidos por lfpidos poliinsaturados;

y en el que en el transcurso de la fermentacion se obtiene una densidad de biomasa de al menos aproximadamente 100 g/l.

Por lo tanto en la cepa ATCC 20888 de la microalga Schizochytrium sp, se precede mas particularmente a una primera fase de crecimiento en presencia de una fuente de carbono y una fuente de nitrogeno pero sin limitacion de oxfgeno, con el fin de favorecer la obtencion de una alta densidad celular y a continuacion, en una segunda fase, detener la provision de nitrogeno y ralentizar progresivamente el suministro de oxfgeno (gestion de la presion de oxfgeno disuelto o pO2 de un 10 %, a un 4 %, la continuacion un 0,5 %), con el fin de estresar a la microalga, ralentizar su crecimiento e iniciar la produccion de los acidos grasos de interes.

En la microalga Crypthecodinium cohnii, el contenido mas elevado de acido docosahexaenoico (DHA, acido graso poliinsaturado) se obtiene a concentracion de glucosa baja (del orden de 5 g/l), y por lo tanto a una tasa de crecimiento baja (Jiang y Chen, 2000, Process Biochem., 35 (l0), 1205-1209).

Estos resultados ilustran bien el hecho de que las cineticas de formacion de los productos tambien pueden estar en asociadas tanto de zona positiva como de forma negativa con el crecimiento de las microalgas, incluso tambien con una combinacion de las dos.

Por lo tanto, en el caso en el que la formacion de los productos no se correlaciona con un crecimiento celular elevado, es sensato dominar la tasa de crecimiento celular.

En general, el experto en la tecnica elige controlar el crecimiento de las microalgas mediante el dominio de las condiciones de fermentacion (Tp, pH...), o mediante la alimentacion regulada con compuestos nutricionales del medio de fermentacion (condiciones semi continuas denominadas « fed-batch »).

Si se elige controlar el crecimiento de las microalgas en heterotrofia mediante el suministro de fuentes de carbono, experto en la tecnica elige generalmente adaptar la fuente de carbono (glucosa pura, acetato, etanol...) para la microalga (C. cohnii, Euglena gracilis...) en funcion del metabolito producido (por ejemplo un acido graso poliinsaturado de tipo DHA).

La temperatura tambien puede ser un parametro fundamental:

- por ejemplo se informo que la smtesis de acidos grasos poliinsaturados en ciertas especies de microalgas, tales como la EPA por Chlorella minutissima, se favorece a una temperatura mas baja que la necesaria para el crecimiento optimo de dicha microalga;

- por el contrario el rendimiento de lutema es mas elevado en Chlorella protothecoides cultivada en heterotrofia, cuando se aumenta la temperatura de produccion de 24 a 35 °C.

Chlorella protothecoides se reconoce justamente como una de las mejores microalgas productoras de aceite.

En condiciones heterotroficas, esta transforma rapidamente los hidratos de carbono en trigliceridos (mas de un 50 % de su materia seca).

Para optimizar esta produccion de trigliceridos, el experto en la tecnica se ve obligado a optimizar el flujo de carbono hacia la produccion de aceite, al actuar sobre el entorno nutricional del medio de fermentacion.

Por lo tanto se sabe que la acumulacion de aceite se produce durante un suministro de carbono suficiente, pero en condiciones de carencia de nitrogeno.

Por lo tanto la proporcion C/N aqu es determinante, y si admite que los mejores resultados se obtienen al actuar directamente sobre el contenido de nitrogeno, el contenido de glucosa no siendo limitante.

De manera no sorprendente, esta carencia de nitrogeno afecta al crecimiento celular, lo que da como resultado una tasa de crecimiento de un 30 % mas baja que la tasa de crecimiento normal de la microalga (Xiong et al., Plant Physiology, 2010, 154, pp 1001-1011).

Para explicar este resultado, Xiong et al, en el artreulo que se ha mencionado anteriormente, demuestran en efecto que si la biomasa de Chlorella se divide en sus 5 componentes principales, es decir, hidratos de carbono, lfpidos, protemas, ADN y ARN (que representan un 85 % de su materia seca), si la proporcion C/N no tiene ningun impacto en el contenido de ADN, ARN e hidratos de carbono, se hace preeminente para el contenido de protemas y de lfpidos.

Es de este modo que las celulas de Chlorelas cultivadas con una proporcion C/N baja contienen un 25,8 % de protemas y un 25,23 % de lfpidos, mientras que una proporcion C/N elevada permite la smtesis de un 53,8 % de ifpidos y un 10,5 % de protemas.

Para optimizar su produccion de aceite, es por lo tanto primordial para el experto en la tecnica controlar el flujo de carbono desviandolo hacia la produccion de aceite, en perjuicio de la produccion de las protemas; el flujo de carbono se redistribuye y se acumula en sustancias de reserva lipfdicas cuando las microalgas se colocan en medio con carencia de nitrogeno.

Con el respaldo de esta ensenanza, para la produccion de biomasas ricas en protemas, el experto en la tecnica se ve obligado por lo tanto a enfrentarse a este control metabolico, es dedr, trabajar las condiciones de fermentacion en favoreciendo bastante una proporcion C/N baja, y por lo tanto:

- realizar un suministro importante de fuente de nitrogeno al medio de fermentacion, a la vez que se mantiene constante la carga de fuente de carbono que se convertira en protemas y

- estimular el crecimiento de la microalga.

Se trata de modificar el flujo de carbono hacia la produccion de protemas (y por lo tanto debio masas), en perjuicio de la produccion de los lfpidos de reserva.

SANSAWA et al. (2004, Journal of Bioscience and Bioengineering, 98, 437-444) describio un metodo de cultivo en heterotrofia de una microalga, Chlorella regulars, que comprende una etapa que tiene como objeto limitar el crecimiento de dicha microalga mediante una carencia total de alimentacion de glucosa del medio de fermentacion, permitiendo de este modo conseguir un contenido de protemas de la biomasa de un 63 % en peso.

El documento WO2014154787, publicado despues del deposito de la presente solicitud, describio un metodo de enriquecimiento con protemas de una microalga cultivada en heterotrofia, microalga del genero Chlorella, metodo de cultivo heterotrofico que comprende una etapa que tiene como objeto limitar el crecimiento de dicha microalga por una carencia del medio de fermentacion de glucosa.

En el contexto de la invencion, la comparua Solicitante ha elegido por el contrario explorar una via original que propone una solucion alternativa a la considerada clasicamente por el experto en la tecnica.

Por lo tanto la invencion se refiere a un metodo de enriquecimiento con protemas de una microalga cultivada en heterotrofia, microalga del genero Chlorella, mas particularmente incluso Chlorella sorokiniana o Chlorella protothecoides, metodo de cultivo heterotrofico que comprende una etapa que tiene como objeto limitar el crecimiento de dicha microalga por una carencia del medio de fermentacion de glucosa.

Esta etapa es una etapa de cultivo heterotrofico en la que la glucosa se proporciona en cantidad insuficiente en el medio para permitir el crecimiento de la microalga.

En el sentido de la invencion, se entiende que « el enriquecimiento » hace referencia a un aumento del contenido de protemas de la biomasa para conseguir un contenido de protemas de la biomasa superior a un 50 %, un 60 %, un 65 % o un 70 % en peso.

De forma mas precisa la invencion se refiere a un metodo de cultivo heterotrofico de dichas microalgas que comprende una etapa que tiene como objeto limitar el crecimiento de dicha microalga por una carencia del medio de fermentacion de glucosa. La temperatura de fermentacion se modifica con el fin de ralentizar el crecimiento de la microalga. La temperatura de fermentacion se puede aumentar en particular en 1, 2, 3, 4 o 5 grados con respecto a la temperatura optima de fermentacion que habitualmente es de aproximadamente 28 °C. De preferencia, la temperatura de fermentacion se aumenta aproximadamente 3 °C, por ejemplo pasando de 28 °C a 31 °C.

Tal como se usa en el presente documento, el termino « aproximadamente » se prefiere a un valor /- 20 %, 10 %, 5 % o 2 %. Por lo tanto la presente invencion se refiere a un metodo de enriquecimiento con protemas de una microalga cultivada en heterotrofia, microalga del genero Chlorella, mas particularmente incluso Chlorella sorokiniana o Chlorella protothecoides, metodo que comprende el cultivo heterotrofico que comprende una etapa que tiene como objeto limitar el crecimiento de dicha microalga por una carencia del medio de fermentacion de glucosa, permitiendo de este modo conseguir un contenido de protemas de la biomasa superior a un 50, un 60 o un 70 % en peso.

Por « carencia del medio de fermentacion de glucosa » se hace referencia a un cultivo en el que la glucosa se proporciona a la microalga en cantidad insuficiente para permitir su crecimiento. Esta carencia se traduce por una tasa de crecimiento de la microalga inferior a la dicha microalga en ausencia de limitacion nutricional.

Esto se traduce por una ausencia de glucosa residual en el medio de cultivo, la microalga consumiendo este factor nutritivo segun su suministro.

En el sentido de la invencion, el criterio esencial es por lo tanto bien la limitacion del crecimiento celular inducido por un estres, estres celular provocado por la carencia de glucosa del medio de fermentacion.

Por lo tanto esta estrategia se va a enfrentar bien contra el prejuicio tecnico segun el cual para aumentar el contenido de protemas de la biomasa, es inevitablemente necesario aumentar esta biomasa y por lo tanto el crecimiento celular.

Como se hara a modo de ejemplo a continuacion, de forma ventajosa se puede elegir limitar el crecimiento de Chlorella sorokiniana mediante una carencia de glucosa del medio de fermentacion.

De manera opcional, la limitacion del crecimiento de dicha microalga se puede obtener mediante la adicion en el medio de cultivo de sustancias inhibidoras del crecimiento celular, como los sulfatos.

La ralentizacion del crecimiento de dicha microalga tambien se produce modificando la temperatura de fermentacion, por ejemplo aumentando de 1 a 5 °C aproximadamente, de preferencia aproximadamente 3 °C, con respecto a la temperatura optima de fermentacion. Esta temperatura optima de fermentacion es habitualmente de aproximadamente 28 °C.

Ademas, sin quedar ligado a una teona cualquiera, la comparM a Solicitante encontro que el flujo de glucosa normalmente se usa en las microalgas del genero Chlorella sorokiniana de acuerdo con un orden de prioridad bien preciso:

1. el metabolismo basal,

2. el crecimiento, es decir, formacion de una biomasa rica en protemas,

3. las sustancias de reserva (lfquidos e hidratos de carbono tal como el almidon).

Este principio permite explicar las variaciones naturales de contenido de protemas en el transcurso del crecimiento de la microalga, a pesar del suministro constante de nitrogeno.

La comparM a Solicitante encontro por lo tanto que, para enriquecer la biomasa de microalgas con protemas, es necesario limitar el crecimiento de la microalga y controlar su consumo de fuente nutritiva ademas del nitrogeno, por ejemplo de glucosa con el fin de:

- asignartodo el consumo de glucosa a las vfas de produccion de protemas,

- evitar la acumulacion de sustancia de reserva como los lfpidos.

En efecto, evitar una carencia de nitrogeno permite impedir la desviacion de los flujos metabolicos hacia la produccion de lfpidos.

De manera opcional, puede ser ventajoso avanzar hasta bloquear completamente toda smtesis de material de reserva, al actuar mediante el intermediario de inhibidores espedficos.

En efecto se sabe que un cierto numero de inhibidores de las vfas de smtesis de los lfpidos incluso del almidon (Hidratos de carbono de reserva por excelencia de las microalgas verdes):

- para los lfpidos, la cerulenina se describe como inhibidor de la smtesis de los acidos grasos, o la lipstatina, sustancia natural producida por Streptomyces toxytricini, como inhibidor de las lipasas...

- para el almidon, los iminoazucares (obtenido por simple sustitucion del atomo de oxfgeno endodclico de los azucares por un atomo de nitrogeno) se conocen historicamente como inhibidores potentes de las glicosidasas, de las glicosiltransferasas, de las glucogeno fosforilasas, o de la UDP-Galp mutasa.

Por lo tanto con el metodo comprende la fermentacion de una biomasa de microalgas en condiciones heterotroficas con una primera etapa de crecimiento de la biomasa y con una segunda etapa de carencia del medio de fermentacion en glucosa.

Esta segunda etapa permite enriquecer la biomasa con protema. En particular, permite conseguir un contenido de protemas de la biomasa superior a un 50, un 60, un 65 o un 70 % en peso (en eso de materia seca).

En un primer modo preferente de realizacion de acuerdo con la invencion, el metodo de cultivo heterotrofico de dichas microalgas, en particular Chlorella sorokiniana, comprende:

o una primera etapa de crecimiento de las microalgas, en la que la cantidad de glucosa en el medio (en modo discontinuo) o el caudal de suministro de glucosa (en modo continuo o semicontinuo) se ajusta a su capacidad de consumo, con el fin de obtener rapidamente una biomasa importante,

o una segunda etapa de produccion de protemas por las microalgas, en la que el caudal de suministro de glucosa se fija a un valor claramente por debajo de su capacidad de consumo de la glucosa, con el fin de impedir la acumulacion suplementaria de sustancias de reserva, incluso favorecer su consumo.

Como se hara a continuacion a modo de ejemplo, la primera etapa de crecimiento de las microalgas se puede realizar el modo discontinuo o "batch", en el que la glucosa proporcionada inicialmente es consumida totalmente por la microalga, lo que conduce a la produccion de una biomasa de base.

La segunda etapa de produccion de protemas se produce en condiciones en las que se realiza:

a) bien un suministro de medio completo en modos semicontinuo, denominado « fed-batch », despues del consumo de la glucosa proporcionada inicialmente; los otros parametros de realizacion de la fermentacion permanecen sin cambios. En este caso como la glucosa se proporciona en modo continuo y la velocidad de suministro es entonces inferior a la velocidad de consumo que la cepa podna realizar de manera que el contenido residual de glucosa en el medio se mantiene nulo. El crecimiento de la cepa entonces se limita mediante la disponibilidad de glucosa (condicion limitante de glucosa).

b) un funcionamiento en modo continuo de tipo quimioestatico, en el que la tasa de crecimiento de la cepa (|j) se mantienen en su valor mmimo, el crecimiento de la cepa estando limitado por el suministro de glucosa. Este modo de funcionamiento permite obtener una biomasa de gran contenido de protemas gracias a la limitacion de la glucosa y a la baja de tasa de crecimiento impuesta a la vez que se asegura una buena productividad.

La invencion se comprendera mejor con la ayuda de los ejemplos que siguen a continuacion, los cuales pretenden ser ilustrativos y no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Produccion de Chlorella sorokiniana en fermentacion de tipo « modo discontinuo secuencial » sin limitacion del suministro de medio nutritivo

La cepa usada es une Chlorella sorokiniana (cepa UTEX 1663 - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin - USA).

Cultivo previo:

- 600 ml de medio en un Erlenmeyer de 2 l;

- Composicion del medio (tabla 1 que sigue a continuacion)

Tabla 1.

El pH se ajusta a 7 antes de esterilizacion por adicion de NaOH 8 N. La incubacion se desarrolla en las siguientes condiciones:

- duracion: 72 h;

- temperatura: 28 °C;

- agitacion: 110 rpm (Incubadora Infors Multitron).

El cultivo previo se transfiere a continuacion a un fermentador de 30 l de tipo Sartorius.

Cultivo para produccion de biomasa:

El medio es identico al del cultivo previo, pero la urea se sustituye por NH4CI.

Tabla 2.

El volumen inicial (Vi) del fermentador se ajusta a 13,5 l despues de la siembra.

Se lleva a 16 - 20 l en final.

Los parametros de realizacion de la fermentacion son los siguientes:

Tabla 3.

Cuando la glucosa proporcionada inicialmente se consume, un suministro de medio identico al medio inicial, sin el agente antiespuma, se realiza en forma de una solucion concentrada que contiene 500 g/l de glucosa y los otros elementos en las mismas proporciones con respecto a la glucosa que en el medio inicial, con el fin de obtener un contenido de glucosa de 20 g/l en el fermentador.

Otras adiciones identicas se realizan de la misma manera en cada momento que la concentracion residual de glucosa se convierte en nula.

El agente antiespuma Clerol FBA 3107 se anade a demanda para evitar una formacion de espuma excesiva.

Resultados:

Despues de 46 h de cultivo, se obtienen 38 g/l de biomasa con un contenido de protemas (evaluado por el N 6,25) de un 36,2 %

Ejemplo 2: Produccion de C. sorokiniana en fermentacion de tipo « cultivo semicontinuo » con suministro de glucosa limitante

En este ejemplo, un suministro de medio completo (modo « cultivo semicontinuo ») se inicio despues del consumo de la glucosa proporcionada inicialmente. Los otros parametros de realizacion de la fermentacion se mantienen sin cambios.

La glucosa se proporciona en modo continuo con la ayuda de una solucion concentrada a 500 g/l. La velocidad de suministro es inferior a la velocidad de consumo que la cepa podna realizar de modo que el contenido residual de glucosa en el medio se mantiene nulo, es decir, el crecimiento de la cepa esta limitado por la disponibilidad de glucosa (condicion limitante de glucosa).

Esta velocidad aumenta en el transcurso del tiempo de forma exponencial. La formula que sirve para calcular el caudal de adicion se caracteriza por un factor |j que corresponde a la tasa de crecimiento que la cepa puede adoptar si consume toda la glucosa proporcionada:

S = So x exp ( j . t)

S = caudal de suministro de glucosa (en g/h)

So = caudal de suministro inicial de glucosa, determinado en funcion de la biomasa presente al final del cultivo discontinuo. En las condiciones de los inventores es de 12 g/h.

y = factor de aceleracion del caudal. Debe ser inferior a 0,11 h-1 que es la tasa de crecimiento de la cepa en ausencia de limitacion nutricional.

t = duracion del cultivo semi continuo (en h)

Si es posible las sales se proporcionan en cultivo continuo, por separado o en mezcla con la glucosa. Pero tambien se pueden suministrar de forma secuencial en varias veces. La tabla 4 que sigue a continuacion proporciona las necesidades de sales para 100 g de glucosa.

Tabla 4.

Las concentraciones de los otros elementos distintos a la glucosa se determinaron con el fin de que estuvieran en exceso con respecto a las necesidades nutricionales de la cepa.

El agente antiespuma Clerol FBA 3107 se anade a demanda para evitar una formacion de espuma excesiva.

Resultados: efecto de la velocidad de suministro de glucosa durante el cultivo semicontinuo

Se realizan ensayos a diferentes velocidades de suministro de la glucosa en « cultivo semicontinuo ». se caracterizan por el j aplicado. El contenido de protema de la biomasa obtenida se evalua mediante la medicion del nitrogeno total expresado en N 6.25.

Tabla 5.

Estos resultados muestran que el hecho de trabajar con glucosa limitante permite aumentar el contenido de protemas.

En efecto se observo que, incluso con un |j elevado de 0,09, se obtiene un contenido de protemas mas elevado que el obtenido sin limitacion como en el ejemplo 1 (un 39,3 % en lugar de un 36,2 %).

Acentuar la limitacion del metabolismo por la glucosa comprende una mejora suplementaria del contenido de protemas.

En las condiciones de estos ensayos, es necesario imponer a la cepa un j inferior a 0,06 h-1 para obtener un contenido de protemas superior a un 50 %.

Se debe indicar que esta condicion va emparejada con una reduccion de la productividad: 0,56 g/l/h en lugar de 1,35 g/l/h con el ensayo 3.

Ejemplo 3: Produccion de C. sorokiniana en fermentacion continua de tipo quimioestatico con suministros de glucosa limitante

En este ejemplo, el fermentador usado es de 2 l de tipo Sartorius Biostat B.

Se realiza como en el ejemplo 2, pero con volumenes 10 veces mas bajos: el inoculo es de 60 ml y el volumen inicial de 1,35 l.

El suministro en modo continuo del medio se inicio de acuerdo con el mismo principio que en el ejemplo 2, en este caso con las sales siendo mezcladas con glucosa en el aparato de distribucion de alimentacion. La velocidad de suministro se acelero de acuerdo con la misma formula exponencial que en el ejemplo 2 aplicando un j de 0,06 h-1. Modo quimioestatico

Cuando se alcanza un volumen de 1,6 l, es decir, una concentracion de biomasa de aproximadamente 50 g/l, el funcionamiento en modo continuo de tipo quimioestatico se pone en practica:

1. El fermentador se alimenta en modo continuo a un caudal de 96 ml/h con una solucion de medio nutritivo a 100 g/l de glucosa de la siguiente composicion:

Tabla 6.

Las concentraciones de los otros elementos ademas de la glucosa se determinaron con el fin de que estuvieran en exceso con respecto a las necesidades nutricionales de la cepa.

2. Se extrajo medio en modo continuo del fermentador gracias a un tubo introducido unido a una bomba con el fin de mantener el volumen del cultivo a 1,6 l.

Por lo tanto, el medio se renovo con una fraccion de 0,06 (6 %) por hora. Esta tasa de renovacion se denomina tasa de dilucion (D).

De acuerdo con el principio del cultivo en modo quimioestatico, la tasa de crecimiento de la cepa (|j) se establecio con el mismo valor ya que el crecimiento de la cepa esta limitado por el suministro de glucosa:

D = j = 0,06 h-1

Resultados

Despues de 97 h de funcionamiento en modo quimioestatico, la concentracion de biomasa se estabiliza en 48 g/l /-2 g/l y el contenido de protema en 53 /- 2 %.

Este modo de funcionamiento permite obtener una biomasa de gran contenido de protema gracias a la limitacion de glucosa y a la baja tasa de crecimiento impuesta a la vez que se asegura una productividad muy buena, del orden de 2,9 g/l/h, gracias a la concentracion elevada de biomasa.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Metodo de enriquecimiento con protemas de una microalga cultivada en heterotrofia, microalga del genera Chlorella, caracterizado por que el cultivo heterotrofico comprende una etapa que tiene como objeto limitar el crecimiento de dicha microalga por una carencia del medio de fermentacion de glucosa con un suministro de glucosa de modo continuo en cantidad insuficiente con el fin de obtener una tasa de crecimiento de la microalga inferior a la de dicha microalga en ausencia de limitacion nutricional, y por un aumento de la temperatura de fermentacion con respecto a la temperatura optima de fermentacion, permitiendo de ese modo conseguir un contenido de protemas de la biomasa superior a un 50 % en peso.

2. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que la microalga del genero Chlorella se elige entre el grupo constituido por Chlorella sorokiniana y Chlorella protothecoides.

3. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizado por que el cultivo heterotrofico de las microalgas de la especie Chlorella sorokiniana comprende:

a. una primera etapa de crecimiento de las microalgas, en la que el caudal de suministro de glucosa se ajusta a su capacidad de consumo, con el fin de obtener rapidamente una biomasa importante,

b. una segunda etapa de produccion de protemas por las microalgas, en la que el caudal de suministro de glucosa se fija a un valor claramente por debajo de su capacidad de consumo de la glucosa, con el fin de impedir la acumulacion suplementaria de sustancias de reserva, incluso favorecer su consumo.

4. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la temperatura de fermentacion aumenta en 1, 2, 3, 4 o 5 °C con respecto a la temperatura optima de fermentacion.

5. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, caracterizado por que la temperatura de fermentacion aumenta en aproximadamente 3 °C con respecto a la temperatura optima de fermentacion.

6. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la temperatura de fermentacion es aproximadamente 31 °C.

7. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado por que el aumento de la temperatura de fermentacion conduce a aumentar, de preferencia duplicar, la capacidad de enfriamiento del intercambiador termico del fermentador.