KR20170067748A

KR20170067748A - 반복 유가 배양 방법

Info

Publication number: KR20170067748A
Application number: KR1020177008993A
Authority: KR
Inventors: 케빈 베리맨; 지용 선; 마이클 밀웨이; 메르시아 발렌틴; 로버토 이 아르멘타
Original assignee: 마라 리뉴어블즈 코퍼레이션
Priority date: 2014-10-16
Filing date: 2015-10-12
Publication date: 2017-06-16
Also published as: CA2960450C; CN112961785A; EP3207165A4; BR112017003558B1; CN106604998A; AU2021202832B2; US20210123083A1; JP6773301B2; BR112017003558A2; US11827918B2; KR102501032B1; US20160108453A1; EP3207165A1; CN106604998B; CA2960450A1; WO2016059541A1; MX2017002150A; AU2015332095A1; AU2015332095B2; EP3207165B1

Abstract

본 명세서에서 미생물의 배양 방법이 제공된다. 상기 방법은 1종 이상의 미생물 및 배지를 포함하는 용기를 제공하는 단계를 포함하되, 미생물 및 배지는 시작 용적을 형성한다. 미생물 및 배지는 배양물이 역치 지표에 도달될 때까지 배양되되, 배양은 1종 이상의 탄소 공급원을 배양물에 공급하는 것을 포함하고, 역치 지표에 도달될 때 배양물은 역치 용적에 있다. 상기 방법은 또한 역치 용적의 일부분을 채취하여 시작 용적의 40% 이하인 잔여 용적을 남기는 단계 및 배양물의 용적을 시작 용적으로 되돌리는 양으로 용기에 새로운 배지를 첨가하는 단계를 포함한다.

Description

반복 유가 배양 방법{REPEATED FED-BATCH CULTURE METHODS}

관련출원에 대한 상호참조

본 출원은 2014년 10월 16일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/064,694호를 우선권 주장하며, 이 기초출원은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

스라우스토카이트리드(Thraustochytrid) 종을 포함하는 미생물의 종속 영양 발효는 고가치 오일 및 바이오매스 제품을 생산하는 효율적인 방법이다. 특정 배양 조건 하에서, 미생물은 세포내 오일을 합성하는데, 이는 바이오 연료(바이오디젤, 바이오-제트연료 등) 및 영양 지질(다불포화 지방산, 예를 들어, DHA, EPA, DPA)을 생산하기 위해 추출되고 사용될 수 있다. 미생물의 바이오매스, 예컨대 스라우스토카이트리드 종은 또한 고 PUFA 및 단백질 함량에 기인하여 큰 영양적 가치를 가지며, 동물 사료용 영양 보충물로서 사용될 수 있다.

미생물 발효 공정은 대부분 배취(batch) 또는 유가 공정으로 수행된다. 배취 공정은 전형적으로 세포가 발효기 내 특정 밀도에 대한 특정 조건(예를 들어, 특정 수준의 영양소, 온도, 압력 등) 하에 고정된 용적의 영양소 배양 배지에서 성장되고, 채취되며, 배취로서 가공되는 폐쇄 시스템 배양을 수반한다. 전형적인 유가 공정에서, 1종 이상의 영양소가 그들이 배양 공정의 마지막까지 남아있는 발효기에 제공되거나 또는 공급된다. 유가 배양 공정은 영양소의 농도를 조절하는 것이 목적으로 하는 생성물의 수율 또는 활성에 영향을 미칠 때, 배취 배양 공정보다 우수할 수 있다. 오일-생산 발효 공정은 전형적으로 2개의 배양 단계, 즉, 모든 필수 영양소가 제한되지 않은 배양물 성장(culture growth)을 위해 이용 가능한 동안의 세포 증식 단계, 이어서, 중요한 성장 영양소(전형적으로 질소)는 배지에서 고의로 제한되는 반면, 과량의 탄소 영양소가 제공되고 오일 합성으로 보내지는 동안의 오일 축적 단계를 포함한다. 표적 세포 농도 및 오일 함량이 도달될 때, 발효 공정은 중단되고, 오일-풍부 바이오매스가 채취된다. 이어서, 발효기 용기는 세정되고, 멸균되고 나서, 새로운 배지와 함께 다시 배취되어야 하고, 다시 생산 용기를 접종하기 위해(예를 들어, 배취/유가 발효 사이의 "턴어라운드(turnaround)" 작업) 종자 트레인(seed train)이 필요하다. 이러한 턴어라운드 작업은 종종 시간 및 에너지 소모적이며, 확립된 생산 공정을 위해 생산 용기의 총 이용 가능한 작업 시간을 제한한다. 대안적으로, 미생물은 새로운 배지가 발효기에 연속적으로 첨가되는 연속적 방법을 이용하여 배양될 수 있는 반면, 배양 지질은 배양 용적을 일정하게 유지하기 위해 지속적으로 제거된다. 연속 배양 공정은 특정 성장 속도 또는 생리적 정지 상태에서 미생물을 유지하기 위해 사용될 수 있지만, 붕괴 없이 유지하는 것이 어려울 수 있고, 전형적으로 연구 목적을 위해 사용되는데, 유가 또는 배취 배양이 더 양호한 결과(예를 들어, 더 높은 오일 수율)를 제공하는 경향이 있고 대규모 생산 목적을 위해 사용하는 데 더 용이하기 때문이다.

본 명세서에서 미생물의 배양 방법이 제공된다. 상기 방법은 1종 이상의 미생물 및 배지를 포함하는 용기를 제공하는 단계로서, 상기 미생물 및 배지는 시작 용적을 형성하는, 단계; 배양물이 역치 지표에 도달될 때까지 상기 배지 내 상기 미생물을 배양시키는 단계로서, 배양은 1종 이상의 탄소 공급원을 상기 배양물에 공급하는 것을 포함하고, 상기 역치 지표에 도달될 때 상기 배양물은 역치 용적에 있는, 단계; 역치 용적의 일부분을 채취하여 시작 용적의 40% 이하인 잔여 용적을 남기는 단계; 및 배양물의 용적을 시작 용적으로 되돌리는 양으로 용기에 새로운 배지를 첨가하는 단계를 포함한다.

도 1은 30L 발효기에서 반복 유가 발효(repeated fed-batch fermentation) 동안 시간에 따른 용기 내 바이오매스 농도 및 오일 농도의 진행을 나타내는 그래프를 도시한 도면이다.
도 2는 30L 발효기에서 반복 유가 발효 내내 바이오매스 생산성 및 오일 생산성 개선뿐만 아니라 유가 발효의 일정한 바이오매스 생산성 및 오일 생산을 나타내는 그래프를 도시한 도면이다. 범례의 RFB는 반복 유가를 나타낸다.
도 3은 7L 발효기에서 반복 유가 발효 동안 시간에 따른 용기 내 바이오매스 농도 및 오일 농도의 진행을 나타내는 그래프를 도시한 도면이다.
도 4는 7L 발효기에서 반복 유가 발효 내내 바이오매스 생산성 및 오일 생산성 개선뿐만 아니라 유가 발효의 일정한 바이오매스 생산성 및 오일 생산을 나타내는 그래프를 도시한 도면이다. 범례의 RFB는 반복 유가를 나타낸다.
도 5는 전체 평균화된 바이오매스 및 오일 생산성에 대해 잔여 종자 용적(20%, 30% 및 40%)을 변화시키는 것의 영향을 나타내는 그래프를 도시한 도면이다. 축의 RFB는 반복 유가를 나타낸다.

반복 유가 공정에 의해 미생물을 배양하는 방법 및 오일을 생산하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 제공된 방법은 전형적인 배취 또는 유가 공정보다 바이오매스와 오일 둘 다의 더 큰 전반적인 용적측정 생산성을 초래한다. 간략하게, 상기 공정은 유가 방법에서 미생물을 배양하는 단계를 수반하며, 여기서, 특정 용적에 도달함으로써 및/또는 용적측정 바이오매스 및 오일 수율을 충족시킴으로써 정해진 바와 같은 발효의 완료 시, 용기는 그의 멸균성을 유지하고 특정의 사전결정된 배양 용적(예를 들어, 초기 배지 용적의 10%)을 뒤에 남기는 방식으로 배출된다. 이어서, 새로운 멸균 배지는 용기에 첨가되며, 여기서 이전의 발효 뒤에 남아있는 배양물은 종자로서 사용된다. 이 공정은 무기한으로 반복될 수 있다. 그러나, 종자로서 사용을 위해 뒤에 남은 배양물의 양은 다를 수 있으며, 채취하지 않고 남아있는 바이오매스와 후속 발효의 정체기에서 소모된 감소된 시간 사이의 교환(tradeoff)을 고려하여야 한다. 반복 유가 공정을 이용함에 있어서, 발효기 턴어라운드 시간은 상당히 감소되는데, 이는 결국 통상적인 배취 및 유가공정을 훨씬 초과하는 바이오매스 및 오일의 더 높은 전체 용적측정 생산성을 야기한다. 또한, 반복 유가 공정은 세정 및 멸균에 대한 필요를 최소화함으로써 작업 비용을 낮춘다. 더 나아가, 노동과 에너지 비용을 둘 다 감소시키는 종자 트레인에 대한 의존도가 더 적다.

미생물

본 명세서에 기재된 방법은 미생물 집단으로부터 지질을 추출하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기재된 미생물의 집단은 조류(예를 들어, 미세조류), 진균(효모를 포함), 박테리아 또는 원생 생물일 수 있다. 선택적으로, 미생물은 스라우스토카이트알레스 목(Thraustochytriales)의 스라우스토카이트리드 및 더 구체적으로, 스라우스토카이트리움 속(Thraustochytrium)의 스라우스토카이트알레스를 포함한다. 선택적으로, 미생물의 집단은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,340,594호 및 제5,340,742호에 기재된 바와 같은 스라우스토카이트알레스를 포함한다. 미생물은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제8,163,515호에 기재된 바와 같은 ATCC 기탁 번호 PTA-6245(즉, ONC-T18)로서 기탁된 스라우스토카이트리움 종, 예컨대 스라우스토카이트리움 종일 수 있다. 따라서, 미생물은 서열번호 1에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 이상(예를 들어, 100%를 포함) 동일한 18s rRNA 서열을 가질 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기 위한 미생물은 다양한 지질 화합물을 생산할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 지질은 인지질, 유리 지방산, 지방산의 에스터, 트라이아실글리세롤, 스테롤 및 스테롤 에스터, 카로테노이드, 잔토필(예를 들어, 옥시카로테노이드), 탄화수소 및 당업자에게 공지된 기타 지질을 포함한다. 선택적으로, 지질 화합물은 불포화 지질을 포함한다. 불포화 지질은 다불포화 지질(즉, 2개 이상의 불포화 탄소-탄소 결합, 예를 들어, 이중 결합을 포함하는 지질) 또는 고도 불포화 지질(즉, 4개 이상의 불포화 탄소-탄소 결합을 포함하는 지질)을 포함할 수 있다. 불포화 지질의 예는 오메가-3 및/또는 오메가-6 다불포화 지방산, 예컨대 도코사헥사엔산(즉, DHA), 에이코사펜타엔산(즉, EPA), 및 기타 천연 유래 불포화, 다불포화 및 고도 불포화 화합물을 포함한다.

공정

본 명세서에서 미생물을 배양하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 1종 이상의 미생물 및 배지를 포함하는 용기를 제공하는 단계로서, 상기 미생물 및 배지는 시작 용적을 형성하는, 단계; 배양물이 역치 지표에 도달될 때까지 상기 배지 내 상기 미생물을 배양시키는 단계로서, 배양은 1종 이상의 탄소 공급원을 상기 배양물에 공급하는 것을 포함하고, 상기 역치 지표에 도달될 때 상기 배양물은 역치 용적에 있는, 단계; 역치 용적의 일부분을 채취하여 시작 용적의 40% 이하인 잔여 용적을 남기는 단계; 및 배양물의 용적을 시작 용적으로 되돌리는 양으로 용기에 새로운 배지를 첨가하는 단계를 포함한다.

상기 방법은 대규모 발효뿐만 아니라 소규모 발효 및 그 사이의 임의의 발효 규모에 적용 가능하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 대규모 발효는 용적측정 용량(즉, 작업 용적)이 대략 1,000L 이상이고, 헤드스페이스에 적절한 공간이 남아있는 발효기 내의 발효를 지칭한다. 소규모 발효는 일반적으로 용적측정 용량이 대략 100L 이하, 예컨대 5L, 10L, 50L 또는 100L인 발효기를 지칭한다. 본 유가 발효 공정의 입증된 이점은 이것이 5 내지 10L 발효기 규모에서 오일의 생산을 위해 이용될 수 있고, 임의의 용적, 예를 들어, 제한 없이 100L, 150L, 250L, 500L, 1000L 이상으로 측정 가능하다는 것이다.

이하의 실시예에 더 상세하게 기재하는 바와 같이, 반복 유가 공정은 용적측정 생산성을 증가시키는 궁극적인 목표와 함께 생산 용기의 턴어라운드 시간을 제거하지는 않지만 완화시킨다. 용적측정 생산성이 전형적인 유가 발효의 생산성 이상으로 증가되는 방법의 예는 도 1에 도시된다. 총 공정시간에 포함될 생산 용기에 대한 턴어라운드 시간을 24시간으로 가정하며, 임의의 주어진 시간에 전체 바이오매스(X) 생산성은 하기와 같이 계산될 수 있다: X(그램)/용기 작업 용적(L)/시간 * 24(시간/일)(최종 단위: g/L-일). 오일 생산성은 하기와 유사한 방식으로 계산될 수 있다: 오일(g)/용기 작업 용적(L)/시간 * 24(시간/일). 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 유가 공정의 바이오매스 및 오일 생산성은 시간에 따라 일정하게 남아있을 것이다. 정반대로, 반복 유가 공정 평균 생산성의 제1 주기가 증가된 후에, 턴어라운드 시간이 필요하지 않다면 유가 공정의 주기를 훨씬 초과하며, 주기 시간은 증가된 종자 밀도에 기인하여 감소되고, 이 데이터세트에서 20% 종자가 사용되었다.

제공된 방법에서, 잔여 용적은 시작 용적의 1% 내지 40%, 예를 들어, 1% 내지 5%, 1% 내지 10%, 1% 내지 20%, 1% 내지 30%, 5% 내지 10%, 5% 내지 20%, 5% 내지 30%, 10%, 내지 20%, 10% 내지 30%, 20% 내지 40%, 또는 시작 용적을 포함하는 1% 내지 40%의 임의의 용적일 수 있다. 선택적으로, 잔여 용적은 시작 용적의 약 10% 이상이다.

제공된 방법은 배양물이 매개변수에 대한 역치 지표에 도달될 때까지 미생물을 배양시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 매개변수는 미생물 배양의 진행을 조절하기 위해 모니터링 및 조절될 수 있는 배양 조건에서의 변수를 지칭한다. 역치 지표는 주어진 매개변수에 대해 사전선택된 수준 또는 농도이다. 이러한 매개변수는 배양물의 용적, 광학 밀도(OD), 세포 농도, 이산화탄소 생성 속도, pH, 용존 산소(DO), 시간, 배양 배지 내 영양소의 농도, 대사 부산물의 축적, 온도, 바이오매스 생산성 및 오일 생산성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 임의의 적합한 매개변수 또는 매개변수의 조합은 당업자에 의해 그리고 본 명세서에 제공된 가이드에 기반하여 사용을 위해 상정된다. 선택적으로, 역치 지표는 배양 배지 내 영양소의 사전선택된 수준 또는 농도이다. 배양 배지에서 측정될 수 있는 적합한 영양소는 탄소 및 질소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

제공된 방법은 선택적으로 (i) 배양물이 역치 지표에 도달될 때까지 배지 내 미생물을 배양시키는 단계로서, 배양은 배양물에 1종 이상의 탄소 공급원을 공급하는 것을 포함하고, 역치 지표에 도달될 때 배양물은 역치 용적에 있는, 단계; (ii) 역치 용적의 일부분을 채취하여 시작 용적의 40% 이하인 잔여 용적을 남기는 단계; 및 (iii) 배양물의 용적을 시작 용적으로 되돌리는 양으로 용기에 새로운 배지를 첨가하는 단계의 단계들을 반복하는 것을 포함한다. 선택적으로, 단계들은 2회 이상 반복된다. 선택적으로, 단계들은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 반복된다. 상기 공정은 상기 논의한 바와 같이 다회 반복되고, 시작 용적 및 잔여 용적은 매번 또는 매회 다를 수 있다. 선택적으로, 시작 용적 및 잔여 용적은 매번 또는 매회 동일하게 남을 수 있다. 예로서, 제1 라운드에서, 잔여 용적은 시작 용적의 2%일 수 있고, 연속 라운드에서, 잔여 용적은 시작 용적의 10%일 수 있다. 연속 라운드에서 잔여 용적은 또한 다를 수 있고, 예를 들어, 1라운드에 시작 용적의 10%이고, 다른 라운드에 시작용적의 20%일 수 있다. 제공된 방법은 유리하게는 배양물이 장기간의 시간에 걸쳐 유지되게 한다. 그렇게 해서, 배양을 유지하고 추가 사용을 위해 일부분을 채취하는 것이 요망된다면, 방법 단계들은 반복될 수 있다. 선택적으로, 배양은 몇 시간, 며칠, 몇 주 또는 몇 개월의 기간 동안 유지된다. 선택적으로, 배양은 150 이상 내지 500시간 동안 유지된다. 예를 들어, 배양은 250시간 이상 동안 유지될 수 있다. 선택적으로, 배양은 1, 2, 3, 4 또는 5주 동안 유지된다.

선택적으로, 제공된 방법은 단일 또는 단지 하나의 종자 또는 종자 트레인의 생산을 포함한다. 미생물의 전형적인 유가 배양은 종자 트레인으로 불리는 단계적 방식으로 생산된 종자 배양물의 생산을 필요로 한다. 종자 트레인은 세정 및 멸균 생산 용기를 접종하기 위해 배양물의 용적 및 밀도를 구성하는 역할을 한다. 종자 트레인은 시간, 멸균을 위한 에너지를 필요로 하며, 또한 배양물이 다중 용기 간에 전달됨에 따라 오염을 위한 더 많은 기회를 생성한다. 반복 유가 방법은 제1 주기를 접종하는 데만 이 종자 트레인이 필요하다. 마찬가지로, 생산 용기는 단지 초기 주기를 위해 멸균될 것이 필요하다. 따라서, 생산 용기(세정 및 멸균) 턴어라운드 시간이 절약되며, 종자 트레인에서 용기를 세정, 멸균 및 작동시키는 데 에너지가 절약된다. 따라서, 제공된 방법은 선택적으로 단일 멸균 단계를 포함한다. 게다가, 순차적 배취에 대해 종자 트레인 내 배양물 전달로부터 오염 위험이 완화된다. 따라서, 제공된 방법은 전형적인 배취 또는 유가 공정에 비해 감소된 오염을 초래한다.

연속적 배취를 위한 종자로서 생산 용기 배양물(즉, 잔여 용적)을 이용하는 것은 또한 종자 트레인에서 더 큰 장비 또는 추가적인 발효기의 구입을 필요로 하는 일 없이 종자 백분율을 선택하는 것의 선정을 허용한다. 예를 들어, 2% 종자 용적(200,000L 작업 용적 생산 용기에서 100,000L 시작 용적에 대해 2000L)을 초기 배취 발효를 위해 사용할 수 있었지만, 반면에 10% 종자를 이용하여 모든 다음의 반복을 접종할 수 있었다. 2% 종자 배양물은 종자 트레인 내 더 큰 용기(즉, 10,000L 작업 용적 용기)에 대한 필요를 제거하여, 종자 배양물의 전달이 한 번 더 적기 때문에 자본 비용/투자를 경감하고, 오염 위험을 낮춘다. 2% 종자를 이용함으로써, 미생물 성장의 정체기는 증가되고, 생산 용기에서 더 낮은 용적의 생산성을 야기한다. 그러나, 10% 종자 용적으로 접종 중인 반복 유가 방법을 이용하는 연속 배취에 의해, 이런 긴 정체기는 극적으로 단축된다.

제공된 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 미생물을 배양하기 위한 추가 단계들을 포함하거나 또는 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 스라우스토카이트리드, 예를 들어, 스라우스토카이트리움 종은 미국 특허 공개 제2009/0117194호 또는 제2012/0244584호에 기재된 방법에 따라 배양될 수 있으며, 이들의 전문은 그것에 사용된 방법들의 각각의 단계 또는 조성물에 대해 참고로 포함된다.

미생물은 성장 배지(또한 "배양 배지"로서 알려짐)에서 성장된다. 임의의 다양한 배지는 본 명세서에 기재된 미생물을 배양하는 데 사용하기에 적합할 수 있다. 선택적으로, 배지는 미생물에 대해 탄소 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 다양한 영양 성분을 공급한다. 스라우스토카이트리드 배양을 위한 배지는 임의의 다양한 탄소 공급원을 포함할 수 있다. 탄소 공급원의 예는 지방산, 지질, 글리세롤, 트라이글리세롤, 탄수화물, 폴리올, 아미노 당 및 임의의 종류의 바이오매스 또는 폐기물 스트림을 포함한다. 지방산은, 예를 들어, 올레산을 포함한다. 탄수화물은 글루코스, 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 프럭토스, 덱스트로스, 자일로스, 락툴로스, 갈락토스, 말토트리오스, 말토스, 락토스, 글리코겐, 젤라틴, 전분(옥수수 또는 밀), 아세트산염, m-이노시톨(예를 들어, 옥수수 침지액으로부터 유래됨), 갈락투론산(예를 들어, 펙틴으로부터 유래됨), L-푸코스(예를 들어, 갈락토스로부터 유래됨), 겐티오비오스, 글루코사민, 알파-D-글루코스-1-포스페이트(예를 들어, 글루코스로부터 유래됨), 셀로비오스, 덱스트린, 알파-사이클로덱스트린(예를 들어, 전분으로부터 유래됨) 및 수크로스(예를 들어, 당밀로부터 유래됨)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 폴리올은 말티톨, 에리트리톨 및 아도니톨을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 아미노 당은 N-아세틸-D-갈락토사민, N-아세틸-D-글루코사민 및 N-아세틸-베타-D-만노사민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 선택적으로, 탄소 공급원은 글루코스이다. 상기 주목한 바와 같이, 제공된 방법에서, 탄소 공급원은 고농도, 예를 들어, 200g/L 이상으로 제공된다.

선택적으로, 본 명세서에 제공된 미생물은 관심 대상의 바이오매스 및/또는 화합물(예를 들어, 오일 또는 총 지방산(TFA) 함량)의 생산을 증가시키는 조건 하에 배양된다. 스라우스토카이트리드는, 예를 들어, 전형적으로 식염수 배지에서 배양된다. 선택적으로, 스라우스토카이트리드는 염 농도가 약 0.5g/L 내지 약 50.0g/L인 배지에서 배양될 수 있다. 선택적으로, 스라우스토카이트리드는 염 농도가 약 0.5g/L 내지 약 35g/L(예를 들어, 약 18g/L 내지 약 35g/L)인 배지에서 배양된다. 선택적으로, 본 명세서에 기재된 스라우스토카이트리드는 저염 조건에서 성장될 수 있다. 예를 들어, 스라우스토카이트리드는 염 농도가 약 0.5g/L 내지 약 20g/L(예를 들어, 약 0.5g/L 내지 약 15g/L)인 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 선택적으로 NaCl을 포함한다. 선택적으로, 배지는 천연 또는 인공 해염 및/또는 인공 해수를 포함한다.

배양 배지는 나트륨의 공급원으로서 비-염화물-함유 나트륨 염을 포함할 수 있다. 본 방법에 따라 사용하기에 적합한 비염화 나트륨 염의 예는 소다회(탄산나트륨과 산화나트륨의 혼합물), 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 황산나트륨 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,340,742호 및 제6,607,900호를 참조하며, 이들 각각의 전문은 본 명세서에 참고로 포함된다. 총 나트륨의 상당 부분은, 예를 들어, 배양 배지 내 총 나트륨의 약 100%, 75%, 50% 또는 25%가 염화나트륨에 의해 공급되도록 비염화물 염에 의해 공급될 수 있다.

선택적으로, 배양 배지는 염화물 농도가 약 3g/L, 500㎎/L, 250㎎/L 또는 120㎎/L이다. 예를 들어, 제공된 방법에서 사용하기 위한 배양 배지는 염화물 농도가 약 60㎎/L 내지 120㎎/L(60㎎/L와 120㎎/L를 포함)일 수 있다.

스라우스토카이트리드 배양을 위한 배지는 임의의 다양한 질소 공급원을 포함할 수 있다. 예시적인 질소 공급원은 암모늄 용액(예를 들어, H₂O 중의 NH₄), 암모늄 또는 아민염(예를 들어, (NH₄)₂SO₄, (NH₄)₃PO₄, NH₄NO₃, NH₄OOCH₂CH₃ (NH₄Ac)), 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 어분, 글루탐산나트륨, 대두 추출물, 카사미노산 및 증류기 곡물을 포함한다. 적합한 배지 내 질소 공급원의 농도는 전형적으로 약 1g/L 내지 약 25g/L(1g/L와 25g/L를 포함)의 범위이다.

배지는 선택적으로 인산염, 예컨대 인산칼륨 또는 인산나트륨을 포함한다. 배지 내 무기염 및 미량의 영양소는 황산암모늄, 중탄산나트륨, 오쏘바나듐산나트륨, 크롬산칼륨, 몰리브덴산나트륨, 아셀렌산, 황산니켈, 황산구리, 황산아연, 염화코발트, 염화철, 염화망간, 염화칼슘 및 EDTA를 포함할 수 있다. 비타민, 예컨대 피리독신 염산염, 티아민 염산염, 판토텐산 칼슘, p-아미노벤조산, 리보플라빈, 니코틴산, 바이오틴, 엽산 및 비타민 B12가 포함될 수 있다.

배지의 pH는 산 또는 염기를 이용하여, 적절하다면, 그리고/또는 질소 공급원을 이용하여 3.0 내지 10.0(3.0와 10.0을 포함)으로 조절될 수 있다. 선택적으로, 배지는 멸균될 수 있다.

일반적으로, 미생물의 배양을 위해 사용되는 배지는 액체 배지이다. 그러나, 미생물의 배양을 위해 사용되는 배지는 고체 배지일 수 있다. 본 명세서에 논의되는 바와 같은 탄소 및 질소 공급원에 추가로, 고체 배지는 구조적 지지체를 제공하고/하거나 배지가 고체 형태가 되게 하는 하나 이상의 성분(예를 들어, 한천 또는 아가로스)을 함유할 수 있다.

세포는 시간 기간에 걸쳐 배양될 수 있다. 선택적으로, 세포는 1일 내지 60일 동안 배양된다. 선택적으로, 배양은 몇 시간, 며칠, 몇 주 또는 몇 개월의 기간 동안 유지된다. 선택적으로, 배양은 150 이상 내지 500시간 동안 유지된다. 선택적으로, 배양은 250시간 이상 동안 유지된다. 선택적으로, 배양은 1, 2, 3, 4 또는 5주 동안 유지된다. 배양은 선택적으로 약 4℃ 내지 약 30℃, 예를 들어, 약 18℃ 내지 약 28℃의 온도에서 수행된다. 배양은 통기-진탕배양, 진탕 배양, 정지 배양, 배취 배양, 반연속적 배양, 연속적 배양, 롤링 배취 배양, 웨이브 배양 등을 포함할 수 있다. 배양은 통상적인 교반-발효기, 버블 칼럼 발효기(배취 또는 연속 배양), 에어리프트 발효기, 웨이브 발효기 등을 이용하여 수행될 수 있다.

배양은 진탕을 포함하는 하나 이상의 다양한 방법에 의해 통풍된다. 선택적으로, 진탕은 약 100rpm 내지 약 1000rpm, 예를 들어, 약 350rpm 내지 약 600rpm 또는 약 100 내지 약 450rpm의 범위이다. 선택적으로, 배양은 바이오매스-생성기 동안 및 지질-생성기 동안 상이한 진탕 속도를 이용하여 통풍된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 진탕 속도는 배양 용기의 유형(예를 들어, 형상 또는 플라스크의 크기)에 따라서 다를 수 있다.

목적으로 하는 지질의 생산은 더 다량의 목적으로 하는 화합물을 얻기 위해 하나 이상의 배양 조건의 이동을 수반하는 방법에 따라 세포를 배양함으로써 향상될 수 있다. 선택적으로, 세포는 바이오매스를 최대화하는 조건에서 먼저 배양되고, 다음에 하나 이상의 조건이 지질 생산성에 유리한 조건으로의 이동한다. 이동되는 조건은 산소 농도, C:N 비, 온도, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 선택적으로, 바이오매스 생산(예를 들어, 고 산소 조건(예를 들어, 일반적으로 또는 제2 단계에 비해), 낮은 C:N 비 및 주위 온도를 이용)을 선호하는 제1 단계, 다음에 지질 생산(예를 들어, 제1 단계에 비해 산소가 감소되고, C:N 비가 증가되며, 온도는 감소됨)을 선호하는 제2 단계의, 2단계 배양이 수행된다. 앞서 기재한 방법과 대조적으로, 제공된 방법은 고수준의 오일 또는 지질 생산 조건 하에서 장기간의 시간 동안 배양을 유지하는 것을 허용한다.

저온 살균

선택적으로, 얻어진 바이오매스는 바이오매스에 존재하는 바람직하지 않은 물질을 비활성화시키기 위해 저온살균된다. 예를 들어, 바이오매스는 물질을 분해하는 화합물을 비활성화시키기 위해 저온살균될 수 있다. 바이오매스는 발효 배지에서 제공되거나 또는 저온살균 단계 동안 발효 배지로부터 단리될 수 있다. 저온살균 단계는 바이오매스 및/또는 발효 배지를 승온으로 가열함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스 및/또는 발효 배지는 약 50℃ 내지 약 95℃(예를 들어, 약 55℃ 내지 약 90℃ 또는 약 65℃ 내지 약 80℃)의 온도로 가열될 수 있다. 선택적으로, 바이오매스 및/또는 발효 배지는 약 30분 내지 약 120분(예를 들어, 약 45분 내지 약 90분, 또는 약 55분 내지 약 75분)으로 가열될 수 있다. 저온살균은 적합한 가열 수단을 이용하여, 예컨대 직접 스팀 주입에 의해 수행될 수 있다.

선택적으로, 저온살균 단계는 수행되지 않는다. 상이하게 언급된, 본 명세서에 교시된 방법은 선택적으로 저온살균 단계가 없다.

채취 및 세척

선택적으로, 바이오매스는 당업자에게 현재 공지된 것을 포함하는 다양한 방법에 따라 채취될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스는, 예를 들어, 원심분리(예를 들어, 간헐식 원심분리를 이용) 또는 여과(예를 들어, 직교류 여과)를 이용하여 발효 배지로부터 수집될 수 있다. 선택적으로, 채취 단계는 세포 바이오매스(예를 들어, 인산나트륨 또는 염화칼슘)의 가속화된 수집을 위한 침전제의 사용을 포함한다.

선택적으로, 바이오매스는 물로 세척된다. 선택적으로, 바이오매스는 약 20% 고체까지 농축될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스는 약 5% 내지 약 20% 고체, 약 7.5% 내지 약 15% 고체, 또는 약 고체 내지 약 20% 고체, 또는 인용된 범위 내의 임의의 백분율로 농축될 수 있다. 선택적으로, 바이오매스는 약 20% 이하의 고체, 약 19% 이하의 고체, 약 18% 이하의 고체, 약 17% 이하의 고체, 약 16% 이하의 고체, 약 15% 이하의 고체, 약 14% 이하의 고체, 약 13% 이하의 고체, 약 12% 이하의 고체, 약 11% 이하의 고체, 약 10% 이하의 고체, 약 9% 이하의 고체, 약 8% 이하의 고체, 약 7% 이하의 고체, 약 6% 이하의 고체, 약 5% 이하의 고체, 약 4% 이하의 고체, 약 3% 이하의 고체, 약 2% 이하의 고체 또는 약 1% 이하의 고체로 농축될 수 있다.

단리 및 추출

제공된 방법은 선택적으로 바이오매스 또는 미생물로부터 다불포화 지방산을 단리시키는 단계를 포함한다. 다불포화 지방산의 단리는 당업자에게 현재 공지된 것을 포함하는 하나 이상의 다양한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 다불포화 지방산을 단리시키는 방법은 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제8,163,515호에 기재되어 있다. 선택적으로, 배지는 다불포화 지방산의 단리 전에 멸균되지 않는다. 선택적으로, 멸균은 온도 증가를 포함한다. 선택적으로, 미생물에 의해 생산되고 제공된 방법으로부터 단리된 다불포화 지방산은 중간쇄 지방산이다. 선택적으로, 1종 이상의 다불포화 지방산은 알파 리놀렌산, 아라키돈산, 도코사헥사엔산, 도코사펜타엔산, 에이코사펜타엔산, 감마-리놀렌산, 리놀레산, 리놀렌산 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

생성물

본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 다불포화 지방산(PUFA) 및 기타 지질을 포함하는 오일은 그들의 생물학적, 영양학적 또는 화학적 특성을 활용하는 임의의 다양한 적용분야에서 이용될 수 있다. 따라서, 제공된 방법은 선택적으로 역치 용적의 채취된 부분으로부터 오일을 단리시키는 단계를 포함한다. 선택적으로, 오일은 연료, 예를 들어, 바이오 연료를 생산하기 위해 사용된다. 선택적으로, 오일은 약제, 식품 보충물, 동물 사료 첨가제, 화장품 등에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생산된 지질은 또한 다른 화합물의 생산에서 중간체로서 사용될 수 있다.

예로서, 제공된 방법을 이용하여 배양된 미생물에 의해 생산된 오일은 지방산을 포함할 수 있다. 선택적으로, 지방산은 알파 리놀렌산, 아라키돈산, 도코사헥사엔산, 도코사펜타엔산, 에이코사펜타엔산, 감마-리놀렌산, 리놀레산, 리놀렌산 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 오일은 트라이글리세라이드를 포함한다. 선택적으로, 오일은 팔미트산(C16:0), 미리스트산(C14:0), 팔미트올레산(C16:1(n-7)), 시스-바크센산(C18:1(n-7)), 도코사펜타엔산(C22:5(n-6)), 도코사헥사엔산(C22:6(n-3)) 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산을 포함한다.

선택적으로, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생산된 지질은 최종 제품(예를 들어, 식품 또는 식품 보충물, 영아용 조제식, 약제, 연료 등)에 혼입될 수 있다. 지질이 혼입될 수 있는 적합한 식품 또는 식품 보충물은 음료, 예컨대 우유, 물, 스포츠 음료, 에너지 드링크, 차 및 주스, 당과 제품, 예컨대, 사탕, 젤리 및 비스켓, 지방-함유 식품 및 음료, 예컨대 낙농 제품, 가공 식품, 예컨대 연질미(또는 오트밀); 영아용 조제식; 아침식사용 시리얼 등을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 생산된 지질은 낙농 보충물, 예를 들어, 비타민 또는 멀티비타민에 혼입될 수 있다. 선택적으로, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생산된 지질은 낙농 보충물에 포함될 수 있고, 선택적으로 식품 또는 먹이(예를 들어, 식품 보충물)의 성분에 직접적으로 혼입될 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 지질이 혼입될 수 있는 사료의 예는 애완동물 사료, 예컨대 고양이 사료, 개 사료 등, 수족관 어류용 사료, 양식 어류 또는 갑각류 등; 농장에서 키우는 동물용 사료(가축 및 양식으로 키우는 어류 및 갑각류를 포함)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생산된 지질이 혼입될 수 있는 식품 또는 사료 물질은 바람직하게는 의도된 수용자인 유기체의 입맛에 맞는다. 이 식품 또는 사료 물질은 식품 물질에 대해 현재 알려진 임의의 물리적 특성(예를 들어, 고체, 액체, 연질)을 가질 수 있다.

선택적으로, 하나 이상의 생산된 화합물(예를 들어, PUFA)은 기능 식품 또는 약제에 혼입될 수 있다. 이러한 기능 식품 또는 약제의 예는 다양한 유형의 정제, 캡슐, 음용 가능한 제제 등을 포함한다. 선택적으로, 기능 식품 또는 약제는 국소 용도에 적합하다. 제형은, 예를 들어, 캡슐, 오일, 과립, 과립 서브틸(subtilae), 풀베레스(pulveres), 타벨라(tabellae), 필룰라(pilulae), 트로키시(trochisci) 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법에 따라 생산된 오일 또는 지질은 임의의 다양한 다른 제제와 조합하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 제품에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 이러한 화합물은 1종 이상의 결합제 또는 충전제, 킬레이트제, 안료, 염, 계면활성제, 습윤제, 점도 개질제, 증점제, 완화제, 향료, 보존제 등 또는 이들의 임의의 조합물과 조합될 수 있다.

개시된 방법 및 조성물에 대해 사용될 수 있거나, 함께 사용될 수 있거나, 제조에 사용될 수 있거나 또는 제품인 물질, 조성물 및 성분이 개시된다. 이들 및 다른 물질은 본 명세서에 개시되며, 이들 물질의 조합물, 하위 집단, 상호작용, 그룹 등이 개시될 때, 이들 화합물의 각각의 다양한 개개 및 수집적 조합 및 순열의 구체적 참조는 명확하게 개시되지 않을 수도 있지만, 각각은 구체적으로 상정되며, 본 명세서에 기재된다는 것이 이해된다. 예를 들어, 방법이 개시되고 논의되며, 상기 방법을 포함하는 다수의 분자로 이루어질 수 있는 다수의 변형이 논의된다면, 상기 방법의 각각 및 모든 조합 및 순열, 및 가능한 변형은 달리 대조적으로 구체적으로 표시되지 않는 한, 구체적으로 상정된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 하위집단 또는 조합은 또한 구체적으로 상정되고 개시된다. 이 개념은 개시된 조성물을 이용하는 방법에서 단계들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 본 개시내용의 모든 양상에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계들이 있다면, 각각의 이들 추가적인 단계들은 임의의 구체적 방법 단계들 또는 개시된 방법의 조합에 의해 수행될 수 있다는 것과, 각각의 이러한 조합 또는 조합들의 하위집단은 구체적으로 상정되며, 고려되고 개시된다는 것이 이해되어야 한다.

전체적으로 사용되는 바와 같이, 주어진 값(예를 들어, 약 1 또는 약 10)에 대한 범위(예를 들어, 1 내지 10) 및 기준은 인용된 값 또는 값들(예를 들어, 1 및/또는 10)을 포함한다.

본 명세서에 인용된 간행물 및 그들이 인용하는 물질은 본 명세서에서 그들의 전문이 구체적으로 참고로 포함된다.

이하의 예는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 특정 양상을 추가로 예시하는 것으로 의도되며, 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

실시예 1. 바이오매스 및 오일의 생산을 위한 반복 유가 발효

미생물 오일 생산 분야에서, 종속 영양(암(dark)) 발효는 일반적으로 공정 효율 및 생산물 수율에 대해 자가 영양 미생물 배양보다 우수한 것으로 고려된다. 그러나, 이는 종종 더 높이 고정된 자본 비용에 의해 방해된다(용기 기반 발효 식물을 구성하는 비용은 일반적으로 개방 연못 및 수로식 양식장 유형 배양 시스템의 자본 비용보다 훨씬 더 높다). 반복 유가 생산 공정을 이용하여, 더 높은 전반적인 용적측정 생산성이 얻어질 수 있는 한편 작업 비용을 낮출 수 있다. 이는 생산 용기의 턴어라운드 시간을 최소화하고, 종자 트레인과 관련된 에너지 사용 및 생산 용기의 멸균을 최소화함으로써 달성된다. 이는 고정된 자본 투자의 더 나은 이용(발효기 및 관련 장비) 및 더 높은 연간 생산 용량을 의미한다. 또한 초기 종자 트레인만이 사용됨에 따라 감소된 자본 투자가 있다.

도 1은 30L 발효기에서 반복된 유가 발효 동안 시간에 걸쳐 용기 내 바이오매스 농도 및 오일 농도의 진행을 나타낸다. 이 실험을 위해, 탄소 공급원으로서 글루코스를 이용하여 10% 잔여 용적을 사용하였다. 도 2에서, 배취 대 배취 턴어라운드 시간 12시간을 사용하여 각각의 독립적 유가 작업의 생산성을 계산하고, 동일한 12시간 턴어라운드 시간을 사용하여 반복 유가 작업의 제1 배취를 계산하였다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 전형적 유가 공정의 바이오매스 및 오일 생산성은 시간에 따라 일정하게 남아 있는데, 각각의 후속적 유가 공정이 각각의 유가 공정 사이에 구성된 고정된 턴어라운드 시간에 의해 이전의 배취와 독립적으로 작동되기 때문이다. 반대로, 반복 유가 공정 평균 생산성의 제1 주기가 증가한 후에, 턴어라운드 시간이 필요하지 않기 때문에 유기 공정의 평균 생산성을 훨씬 초과하며, 주기 시간은 증가된 종자 밀도에 기인하여 감소된다.

도 3은 7L 발효기에서 반복된 유가 발효 동안 시간에 걸쳐 용기 내 바이오매스 농도 및 오일 농도의 진행을 나타낸다. 이 실험을 위해, 탄소 공급원으로서 글루코스를 이용하여 20% 잔여 용적을 사용하였다. 도 4에서, 배취 대 배취 턴어라운드 시간 12시간을 사용하여 각각의 독립적 유가 작업의 생산성을 계산하고, 동일한 12시간 턴어라운드 시간을 사용하여 반복 유가 작업의 제1 배취를 계산하였다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 전형적 유가 공정의 바이오매스 및 오일 생산성은 시간에 따라 일정하게 남아 있는데, 각각의 후속적 유가 공정이 사이에 구성된 고정된 턴어라운드 시간에 의해 이전의 배취와 독립적으로 작동되기 때문이다. 반대로, 반복 유가 공정 평균 생산성의 제1 주기가 증가한 후에, 턴어라운드 시간이 필요하지 않기 때문에 유기 공정의 평균 생산성을 훨씬 초과하며, 주기 시간은 증가된 종자 밀도에 기인하여 감소된다.

상이한 잔여 종자 용적, 즉, 20%, 30% 및 40%를 지니는 반복 유가 발효를 320시간의 기간에 걸쳐 수행하고, 각각은 총 6회 반복 작업에 도달되었다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 반복 유가 발효는 단일 유가 작업의 생산성에 비교할 때 더 높은 전체 평균 바이오매스 및 오일을 생산하였다. 잔여 종자 용적을 20%로부터 30%로 증가시키는 것은 평균 생산성의 상당한 증가를 초래한 반면, 30%로부터 40%로 잔여 종자 용적의 추가적인 증가는 추가 생산성 개선을 초래하지 않았다. 이는 비채취로 남아있는 바이오매스 사이의 교환(즉, 종자에 대한 잔여 용적으로서 사용됨) 및 후속 발효의 정체기에 소모된 감소된 시간을 나타내었다. 이들 조건 하에서, 최적의 교환 지점은 대략 30% 잔여 종자 용적이다.

SEQUENCE LISTING <110> Mara Renewables Corporation <120> Repeated Fed-Batch Culture Methods <130> 095523-0960120 (012WO1) <140> PCT/IB2015/057808 <141> 2015-10-12 <150> US 62/064,694 <151> 2014-10-16 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 gtagtcatac gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg taagtataag cgattatact 60 gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt tatgatttct tcggtatttt ctttatatgg 120 atacctgcag taattctgga attaatacat gctgagaggg cccgactgtt cgggagggcc 180 gcacttatta gagttgaagc caagtaagat ggtgagtcat gataattgag cagatcgctt 240 gtttggagcg atgaatcgtt tgagtttctg ccccatcagt tgtcgacggt agtgtattgg 300 actacggtga ctataacggg tgacggggag ttagggctcg actccggaga gggagcctga 360 gagacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgtaa attacccaat gtggactcca 420 cgaggtagtg acgagaaata tcaatgcggg gcgcttcgcg tcttgctatt ggaatgagag 480 caatgtaaaa ccctcatcga ggatcaactg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt 540 aattccagct ccagaagcgt atgctaaagt tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaatt 600 tctggggcgg gagccccggt ctttgcgcga ctgcgctctg tttgccgagc ggctcctctg 660 ccatcctcgc ctcttttttt agtggcgtcg ttcactgtaa ttaaagcaga gtgttccaag 720 caggtcgtat gacctggatg tttattatgg gatgatcaga tagggctcgg gtgctatttt 780 gttggtttgc acatctgagt aatgatgaat aggaacagtt gggggtattc gtatttagga 840 gctagaggtg aaattcttgg atttccgaaa gacgaactac agcgaaggca tttaccaagc 900 atgttttcat taatcaagaa cgaaagtctg gggatcgaag atgattagat accatcgtag 960 tctagaccgt aaacgatgcc gacttgcgat tgcggggtgt ttgtattgga ccctcgcagc 1020 agcacatgag aaatcaaagt ctttgggttc cggggggagt atggtcgcaa ggctgaaact 1080 taaaggaatt gacggaaggg caccaccagg agtggagcct gcggcttaat ttgactcaac 1140 acgggaaaac ttaccaggtc cagacatagg taggattgac agattgagag ctctttcttg 1200 attctatggg tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg agtgatttgt ctggttaatt 1260 ccgttaacga acgagacctc ggcctactaa atagcggtgg gtatggcgac atacttgcgt 1320 acgcttctta gagggacatg ttcggtatac gagcaggaag ttcgaggcaa taacaggtct 1380 gtgatgccct tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgatgggttc aacgggtggt 1440 catcgttgtt cgcagcgagg tgctttgccg gaaggcatgg caaatccttt caacgcccat 1500 cgtgctgggg ctagattttt gcaattatta atctccaacg aggaattcct agtaaacgca 1560 agtcatcagc ttgcattgaa tacgtccctg ccctttgtac acaccgcccg tcgcacctac 1620 cgattgaacg gtccgatgaa accatgggat gaccttttga gcgtttgttc gcgagggggg 1680 tcagaactcg ggtgaatctt attgtttaga ggaaggtgaa gtc 1723

Claims

(a) 1종 이상의 미생물 및 배지를 포함하는 용기를 제공하는 단계로서, 상기 미생물 및 배지는 시작 용적을 형성하는, 단계;
(b) 배양물(culture)이 역치 지표에 도달될 때까지 상기 배지 내 상기 미생물을 배양시키는 단계로서, 배양은 1종 이상의 탄소 공급원을 상기 배양물에 공급하는 것을 포함하고, 상기 역치 지표에 도달될 때 상기 배양물은 역치 용적에 있는, 단계;
(c) 상기 역치 용적의 일부분을 채취하여 상기 시작 용적의 40% 이하인 잔여 용적을 남기는 단계; 및
(d) 상기 배양물의 용적을 상기 시작 용적으로 되돌리는 양으로 상기 용기에 새로운 배지를 첨가하는 단계
를 포함하는, 미생물을 배양시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 잔여 용적은 상기 시작 용적의 1% 내지 40%인, 미생물을 배양시키는 방법.
제2항에 있어서,
상기 잔여 용적은 상기 시작 용적의 1% 내지 5%인, 미생물을 배양시키는 방법.
제2항에 있어서,
상기 잔여 용적은 상기 시작 용적의 5% 내지 10%인, 미생물을 배양시키는 방법.
제2항에 있어서,
상기 잔여 용적은 상기 시작 용적의 10% 내지 20%인, 미생물을 배양시키는 방법.
제2항에 있어서,
상기 잔여 용적은 상기 시작 용적의 20% 내지 40%인, 미생물을 배양시키는 방법.
제2항에 있어서,
상기 잔여 용적은 상기 시작 용적의 약 10% 이상인, 미생물을 배양시키는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 역치 지표는 배양물의 용적, 광학 밀도(OD), 용존 산소(DO), 세포 농도, 이산화탄소 생성 속도, pH, 시간, 배양 배지 내 영양소의 농도, 바이오매스 생산성, 오일 생산성 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 미생물을 배양시키는 방법.
제8항에 있어서,
상기 역치 지표는 배양 배지 내 영양소의 농도이되, 상기 영양소는 탄소 또는 질소인, 미생물을 배양시키는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 배양물이 역치 지표에 도달될 때까지 배지 내 미생물을 배양시키는 단계로서, 배양은 상기 배양물에 1종 이상의 탄소 공급원을 공급하는 것을 포함하고, 상기 역치 지표에 도달될 때 상기 배양물은 역치 용적에 있는, 단계; (ii) 상기 역치 용적의 일부분을 채취하여 시작 용적의 40% 이하인 잔여 용적을 남기는 단계; 및 (iii) 상기 배양물의 용적을 상기 시작 용적으로 되돌리는 양으로 상기 용기에 새로운 배지를 첨가하는 단계를 반복하는 단계를 포함하는, 미생물을 배양시키는 방법.
제10항에 있어서,
상기 단계들은 2회 이상 반복되는, 미생물을 배양시키는 방법.
제10항에 있어서,
상기 단계들은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 반복되는, 미생물을 배양시키는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 역치 용적의 채취된 부분으로부터 오일을 단리시키는 단계를 더 포함하는, 미생물을 배양시키는 방법.
제13항에 있어서,
상기 오일은 알파 리놀렌산, 아라키돈산, 도코사헥사엔산, 도코사펜타엔산, 에이코사펜타엔산, 감마-리놀렌산, 리놀레산, 리놀렌산 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산을 포함하는, 미생물을 배양시키는 방법.
제13항에 있어서,
상기 오일은 트라이글리세라이드를 포함하는, 미생물을 배양시키는 방법.
제13항에 있어서,
상기 오일은 팔미트산(C16:0), 미리스트산(C14:0), 팔미트올레산(C16:1(n-7)), 시스-바크센산(C18:1(n-7)), 도코사펜타엔산(C22:5(n-6)), 도코사헥사엔산(C22:6(n-3)) 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산을 포함하는, 미생물을 배양시키는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미생물은 스라우스토카이트리아세(Thraustochytriaceae)과에 속하는, 미생물을 배양시키는 방법.
제17항에 있어서,
상기 미생물은 스라우스토카이트리움(Thraustochytrium)속에 속하는, 미생물을 배양시키는 방법.
제18항에 있어서,
상기 미생물은 ONC-T18인, 미생물을 배양시키는 방법.