CN103436561B - 以棉纤维材料固定琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发公开了一种以棉纤维材料固定琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸的方法，属于发酵工程领域。将琥珀酸放线杆菌在装有棉纤维载体的发酵罐中培养、吸附固定，通过反复分批发酵、反复补料分批发酵、连续发酵或双罐循环连续发酵工艺，提高了发酵的细胞浓度，同时获得高产酸浓度、高生产强度和高转化率。转化率最高达90%，生产强度最高为4.27g/L/h，丁酸产量最高为98.7g/L。
Description
技术领域
本发明涉及以棉纤维材料固定琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸的方法，属发酵工程领域。
背景技术
丁二酸，又名琥珀酸(Succinic acid)，是一种重要的碳四平台化合物。目前主要是利用石油为原料经化学法合成法生产丁二酸。利用琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸，是从可再生的糖质原料出发，通过微生物的TCA还原途径固定CO2生产丁二酸，符合当今低碳经济发展要求，具有良好发展前景。但是，目前这种生产方法还受到生产成本偏高的制约。微生物发酵生产丁二酸还存在发酵过程菌体生物量不高、高底物浓度与高产物浓度对发酵的抑制，不能同时获得理想的生产强度与转化率的问题，因此，如何获得既有高的产物浓度又有高的生产强度和转化率成为用琥珀酸放线杆菌发酵法生产丁二酸的研究热点。
2004年美国Urbance等报道了用塑料复合基质作为固定化材料，安装在发酵罐搅拌浆上，连续发酵运行，产丁二酸的生产强度达到2.1g/L/h，转化率为0.72g/g，但丁二酸的浓度最大仅为10.4g/L；他们还尝试用生物膜循环发酵系统，在发酵罐内添加一个多孔网状材料用于富集菌体，转化率和丁二酸浓度提高到0.88g/g和34g/L，但生产强度仅为0.9g/L/h。2009年，韩国Kim等将细胞固定在生物膜系统中进行循环连续发酵，在稀释率为0.2/h条件下，获得最高的生产强度为6.63g/L/h，但丁二酸浓度仍仅为13.26g/L。2011年中科院过程所李强等，提出了一个发酵与提取偶联的装置，将发酵反应器与一个扩大的吸附床相偶联，发酵结束后发酵液中丁二酸被吸附到树脂上，同时新鲜培养基重新添加到发酵罐中进行发酵，当吸附床中树脂吸附饱和后，结束整个发酵周期，可以明显提高丁二酸的浓度（达到145.2g/L），但发酵时间从48h延长到126h，生产强度为1.3g/L/h，平均转化率仅为0.52g/g。2012年南非Van Heerden与Nicol以珍珠岩作为固定细胞材料，珍珠岩填充在反应器内作为吸附材料进行连续发酵，在稀释率为0.56/h时，反应器的生产强度达到6.35g/L/h，但转化率仅为0.65g/g。尽管以上的方法有的有效的提高丁二酸的生产强度，有的提高了产物浓度，但是同时获得高产酸浓度、高转化率和高生产强度的方法很少。
本发明提供了利用被吸附固定的琥珀酸放线杆菌在发酵罐中反复生产丁二酸的多种工艺。该方法操作简单，有效提高了发酵生产丁二酸过程中，琥珀酸放线杆菌的生物量，并能够同时获得高丁二酸的浓度，高转化率以及高生产强度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种固定化发酵生产丁二酸的方法，利用纤维床反应器固定化琥珀酸放线杆菌，获得高的细胞浓度，提高丁二酸的产量、转化率以及生产强度。具体地，是将琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）吸附固定于带纤维材料的发酵罐装置（即纤维床反应器）中，通过反复分批发酵、反复补料分批发酵、连续发酵或双罐循环连续发酵工艺实现丁二酸的高效生产。
所述含纤维材料的发酵罐装置，即纤维床反应器，是以100%棉纤维材料为固定化载体，棉纤维织物厚度为0.5-2mm，孔隙率>90%，发酵罐中发酵液体积与棉纤维织物面积的比为3-6cm3/cm2，将棉纤维围绕在圆桶状铁丝网外表面，每层棉纤维之间空隙为0.5-2mm，通过铁丝网固定在发酵罐搅拌器上，使固定好的纤维床能够跟随搅拌转轴同时转动。本发明中，纤维床装置内径为5-10cm、高为10-20cm，发酵罐中发酵液体积与棉纤维织物面积的比为3-6cm3/cm2；具体地，是将6*60cm2的棉纤维围绕发酵罐转轴卷成5层，每层之间空隙为1mm，并用铁丝网固定，纤维床装置内径为8cm，高为12cm，并且固定好的纤维床反应器能够随着搅拌转轴一同转动。
所述棉纤维的长宽比、使用面积等，可根据所用发酵罐的具体高径比进行调整。所述棉纤维还可以缠绕固定在发酵罐挡板上，控制发酵罐中发酵液体积与棉纤维织物面积的比为3-6cm3/cm2。非搅拌状态发酵时，棉纤维织物可以卷成若干个桶装小卷悬浮于发酵液中，控制发酵罐中发酵液体积与棉纤维织物总面积的比为3-6cm3/cm2。
所述琥珀酸放线杆菌的吸附培养是将摇瓶种子在厌氧培养箱中静置培养10-14h，培养温度为35-40℃。将种子培养基（培养基装液量为2L，使纤维床浸没在种子培养基中，能够大量吸附菌体）装入纤维床反应器中，按0.5-10%（v/v）的接种量接入琥珀酸放线杆菌摇瓶种子，并于35-40℃，在通N2或CO2的厌氧条件下，培养吸附6-10h，搅拌转速70-120rpm/min。种子培养基组成为：葡萄糖5-15g/L,酵母膏10-20g/L（或玉米浆15-30g/L），K2HPO415-20g/L,NaH2PO45-10g/L，pH自然，115-121℃灭菌20-30min。
所述利用固定化琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸：
琥珀酸放线杆菌在纤维床反应器中培养吸附后，将反应器中种子培养液由蠕动泵抽出，并更换为新鲜的1.6L发酵培养基。通入N2或CO2维持厌氧环境，控制发酵温度35-40℃，搅拌转速150-200rpm/min，用碳酸盐控制pH在5.8-7.2。所用的碳酸盐为10-50%（w/v）的碳酸钠或碳酸氢钠或10-40%（w/v）的碳酸镁。
所述发酵培养基的配方为：葡萄糖30-150g/L，玉米浆15-35g/L，K2HPO41.5-3g/L，NaH2PO41.5-3g/L，谷氨酸钠0.05-2g/L，蛋氨酸0.01-0.5g/L，Na2S0.01-1g/L，pH调至6.0-6.5，115-121℃灭菌，20-30min。
所述利用固定化琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸可采用反复分批发酵、反复补料分批发酵、连续发酵或纤维床反应器-双罐循环连续发酵。
所述用纤维床反应器反复分批发酵时，发酵培养基的葡萄糖浓度为50-100g/L,发酵时间10-32h，当发酵液中葡萄糖浓度低于1-5g/L时，放料并更换新鲜发酵培养基，重复进行下一批次发酵，反复发酵批次8-15次，总运行时间100-200h，期间保证无菌操作。
所述用纤维床反应器反复补料分批发酵时，发酵培养基初始糖浓度为30-50g/L，发酵8-20h，当发酵液中葡萄糖浓度在5-15g/L以下时，用蠕动泵一次性补加葡萄糖40-60g/L，当发酵液中葡萄糖浓度再次降为1-5g/L以下时，放料更换新鲜发酵培养基。重复上述过程，进行下一批次发酵。总运行时间200-300h，期间保证无菌操作。
所述用纤维床反应器进行连续发酵时，发酵培养基初始糖浓度为60-90g/L，在发酵液葡萄糖浓度降低为5-10g/L时，以稀释速率0.01-0.3/h开始连续发酵。
所述纤维床反应器-双罐循环连续发酵，循环连续发酵装置由纤维床反应器、循环罐、蠕动泵及橡胶软管组成，循环罐的体积为纤维床反应器体积的0.5-5倍。当用等体积的循环罐进行纤维床反应器-双罐循环连续发酵时，琥珀酸放线杆菌先吸附固定在纤维床反应器中，发酵开始时，利用蠕动泵60-100mL/min的速率在两罐之间循环发酵培养基，进行发酵。循环罐的装液量与纤维床反应器的发酵培养基装液量均为1.6L，循环罐的搅拌转速为200rmp/min，纤维床反应器的搅拌转速为120rmp/min，其余条件二者均相同。发酵培养基初始糖浓度为80-100g/L，当发酵液糖浓度降为5-15g/L时，开始连续发酵，新鲜培养基以0.05-0.6/h的稀释率由蠕动泵泵入纤维床反应器，发酵液从循环罐中流出。
利用纤维床反应器固定化发酵生产丁二酸的菌株包括了已报道的产丁二酸的琥珀酸放线杆菌及其突变株，如Actinobacillus succinogenes130Z、Actinobacillus succinogenesCGMCC1593、Actinobacillus succinogenes CGMCC2650、Actinobacillus succinogenesCGMCC2653、Actinobacillus succinogenes CCTCC NO:M2012036等。
本发明以棉纤维材料为固定化载体，固定琥珀酸放线杆菌用于生产丁二酸，固定化的微生物可反复多次用于生产丁二酸，结合反复分批发酵、反复补料分批发酵、连续发酵或双罐循环连续发酵的工艺，真正实现了丁二酸生产的高转化率、高生产强度和高产酸率。转化率最高达90%，生产强度最高为4.27g/L/h，丁酸产量最高为98.7g/L。
附图说明
图1纤维床反应器双罐循环连续发酵装置图；1，纤维床反应器；2，循环罐；3，蠕动泵；4，蠕动泵；5，蠕动泵；6，蠕动泵；7，pH电极；8，pH控制器；9，蠕动泵；10，0.22μm气体滤膜；11，pH调节剂储罐；12，产物收集瓶；13，培养基补料瓶；14，CO2/N2混合气瓶。
具体实施方式
以下是说明本发明的实例，但不局限于这些实例。
产物分析方法：采用HPLC分析发酵液中产物的成分，如用使用美国Waters高效液相色谱仪（Empower2色谱工作站、Waters2707自动进样器、Waters1525泵以及Waters2414RI检测器），Bio-Rad Aminex HPX-87H离子色谱柱，柱温55℃，流动相为3mM稀硫酸，流速0.5mL/min，RI检测器温度35℃，进样量为10mL。
实施例1分批发酵
在3L发酵罐纤维床反应器装置：取纤维床载体（织物的厚度在1mm，孔隙率>95%），表面积为60×6cm2，将其缠绕到发酵罐的搅拌转轴上，顶部用搅拌浆固定，用不锈钢铁丝网固定，铁丝网孔径约为2.5×2.5cm2，并且不影响搅拌。纤维床的直径约为11cm，高为16cm，115-121℃空消20min，过夜后再121℃空消20min；
A.succinogenes CCTCC NO:M2012036摇瓶种子在厌氧培养箱中静置培养12h，培养温度为38℃。将种子培养基装入纤维床反应器中，按2.5%的接种量接入琥珀酸放线杆菌摇瓶种子，并于38℃，在通N2与CO2混合气体的厌氧条件下，培养吸附6h，搅拌转速70rpm/min。种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，K2HPO420g/L，NaH2PO410g/L，pH自然，121℃灭菌20min。
培养吸附后，反应器中种子培养液由蠕动泵抽出，并更换为新鲜的发酵培养基。发酵培养基：葡萄糖分别为34、55、85g/L，玉米浆25g/L，K2HPO42.5g/L，NaH2PO42.5g/L，谷氨酸钠2g/L，蛋氨酸0.01g/L，Na2S2g/L，pH调至6.2，121℃灭菌，20min。通入N2或CO2维持厌氧环境，控制发酵温度38℃，搅拌转速150rpm/min，用碳酸盐控制pH在5.8-6.2，每次加入碳酸盐为15g/L的固体碳酸镁。
表1不同初糖浓度下固定化纤维床反应器生产丁二酸
实施例2反复分批发酵
参照实施例1的方法，在3L纤维床反应器中培养吸附琥珀酸放线杆菌，进行反复分批发酵。发酵培养基的初始糖浓度为50g/L葡萄糖，每隔3-4h取样测定产酸情况，平均发酵12h，葡萄糖浓度降为3g/L。更换新鲜培养基，反复分批发酵10个批次，结果见表2，第10个批次结束后，没有发现细胞生长停止，该结果说明该纤维床反应器还可以用。
表2纤维床反应器固定化反复分批发酵生产丁二酸
实施例3补料分批发酵
参照实施例1的方法，在3L纤维床反应器纤维床反应器中培养吸附琥珀酸放线杆菌，为获得高的丁二酸浓度，进行补料分批发酵。发酵培养基初始葡萄糖60g/L，发酵过程在前12h残糖降低为12.4g/L时，补加葡萄糖浓度至67g/L；在38h发酵残糖降低为5g/L，丁二酸浓度为87g/L，转化率为0.83g/g，生产强度为2.38g/L/h。
实施例4反复补料分批发酵
参照实施例1的方法，在3L纤维床反应器中培养吸附琥珀酸放线杆菌，进行反复补料分批发酵。发酵初始葡萄糖为55g/L，每隔3-4h取样测定产酸情况，平均发酵12h，葡萄糖浓度降为8.2g/L，一次性再补加葡萄糖50g/L，平均发酵40h后，当葡萄糖降低至平均5g/L时，放料更换新鲜发酵培养基。重复上述过程，进行下一批次发酵。反复补料分批发酵4个批次，共运行200h，结果见表3。
表3纤维床反应器固定化反复补料分批发酵
实施例5连续发酵
参照实施例1的方法，在3L纤维床反应器中培养吸附琥珀酸放线杆菌。发酵培养基中葡萄糖浓度为80g/L，连续发酵运转之前，先进行分批发酵，直到发酵液中的葡萄糖浓度降低至5g/L时，连续发酵运行开始。新鲜发酵培养基分别以不同的稀释率，由蠕动泵泵入反应器中，运行140h后，结果如表3。
表4纤维床反应器固定化连续发酵生产丁二酸
实施例6双罐循环连续发酵
用两个3L发酵罐，其中一个为纤维床反应器，另一个作为循环反应器，两罐以蠕动泵以及橡胶软管相链接，参照实施例1的方法，在3L纤维床反应器中培养吸附琥珀酸放线杆菌。发酵过程开始时，循环罐中的发酵培养基装液量为1.6L，用蠕动泵以80mL/min向纤维床反应器循环发酵液，每隔4-6h由循环罐取样测定葡萄糖与发酵液中的生物量，在发酵液中葡萄糖降低为10g/L时，连续发酵开始，新鲜培养基以0.05/h稀释率泵入纤维床反应器，发酵液从循环罐中泵出，连续运行50h后，流出的发酵液中丁二酸浓度稳定在60g/L，残糖浓度为8.3g/L，转化率0.84g/g，生产强度为3.0g/L/h。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.以棉纤维材料固定琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)发酵生产丁二酸的方法，是将琥珀酸放线杆菌吸附固定于纤维床反应器中，通过反复分批发酵、反复补料分批发酵、连续发酵或双罐循环连续发酵工艺实现丁二酸的高效生产；所述纤维床反应器是带有纤维材料的发酵罐装置，是以100％棉纤维材料为固定化载体，棉纤维织物厚度为0.5-2mm，孔隙率>90％，发酵液体积与棉纤维织物面积的比为3-6cm3/cm2，将棉纤维围绕在圆桶状铁丝网外表面，每层棉纤维之间空隙为0.5-2mm，然后通过铁丝网固定在发酵罐搅拌器上，使固定好的纤维床能够跟随搅拌转轴同时转动。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述棉纤维的长宽比、使用面积，可根据所用发酵罐的高径比进行调整；所述棉纤维还可以缠绕固定在发酵罐挡板上，控制发酵液体积与棉纤维织物面积的比为3-6cm3/cm2；非搅拌状态发酵时，棉纤维织物可以卷成若干个桶装小卷悬浮于发酵液中，控制发酵液体积与棉纤维织物总面积的比为3-6cm3/cm2。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述吸附固定琥珀酸放线杆菌是在纤维床反应器中装入种子培养基，按0.5-10％的接种量接入琥珀酸放线杆菌摇瓶种子，并于35-40℃，在通N2或CO2的厌氧条件下，培养吸附6-10h，搅拌转速70-120rpm/min；所述种子培养基含葡萄糖5-15g/L，酵母膏10-20g/L，K2HPO415-20g/L，NaH2PO45-10g/L，pH自然，115-121℃灭菌20-30min；所述酵母膏10-20g/L可用玉米浆15-30g/L代替。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述用固定化琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸是在固定了琥珀酸放线杆菌的纤维床反应器中，更换新鲜发酵培养基，通N2或CO2维持厌氧环境，发酵温度35-40℃，搅拌转速150-200rpm，用碳酸盐控制pH5.8-7.2，以反复分批或反复补料分批、连续发酵或纤维床反应器-双罐循环连续发酵的方式进行发酵产酸。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡萄糖30-150g/L，玉米浆15-35g/L，K2HPO41.5-3g/L，NaH2PO41.5-3g/L，谷氨酸钠0.05-2g/L，蛋氨酸0.01-0.5g/L，Na2S0.01-2g/L，pH调至6.0-6.5，115-121℃灭菌，20-30min。
6.根据权利要求1或4的方法，其特征在于，所述反复分批发酵的发酵培养基的葡萄糖浓度为50-100g/L，发酵时间10-32h，当发酵液中葡萄糖浓度低于1-5g/L时，放料并更换新鲜发酵培养基，重复进行下一批次分批发酵。
7.根据权利要求1或4的方法，其特征在于，所述反复补料分批发酵的发酵培养基初始糖浓度为30-50g/L，当发酵液中葡萄糖浓度降至5-15g/L以下时，用蠕动泵一次性补加葡萄糖40-60g/L，当发酵液中葡萄糖浓度再降为1-5g/L以下时，更换新鲜培养基，重复进行下一批次补料分批发酵。
8.根据权利要求1或4的方法，其特征在于，所述连续发酵的发酵培养基初始糖浓度为60-90g/L，在发酵液葡萄糖浓度降低为5-10g/L时，以稀释速率0.01-0.3/h开始连续发酵。
9.根据权利要求1或4的方法，其特征在于，所述双罐循环连续发酵是将琥珀酸放线杆菌先吸附固定于纤维床反应器中，发酵培养基用蠕动泵以60-100mL/min的速率在两罐之间循环，发酵培养基葡萄糖初始浓度为80-100g/L；当发酵液糖浓度降为5-15g/L时，新鲜培养基以0.05-0.6/h的稀释率由蠕动泵泵入纤维床反应器，开始连续发酵，发酵液从循环罐中流出。
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