WO2014089812A1 - 一种固定化床发酵和分离相耦合的生产乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种将微生物固定化床发酵和分离耦合的生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：（1）将酵母细胞固定于生物反应器中的纤维材料；（2）加入发酵培养基进行乙醇循环发酵；（3）采用渗透汽化膜分离发酵液，膜截留液返回生物反应器内，渗透液经树脂柱吸附后再返回生物反应器内；（4）从树脂柱分离吸附的乙醇。在利用纤维材料对酵母细胞进行固定化发酵生产乙醇的基础上，通过安装膜分离装置及树脂分离装置，达到边发酵边分离的目的。该方法不仅因其固定化载体稳定，无毒性，吸附效果好，提高耐乙醇特性；而且这种树脂分离方法生产乙醇能耗低，分离效果好，大幅提高了乙醇产率。

Description

一种固定化床发酵和分离相耦合的生产乙醇的方法 技术领域
本发明属于工业生物技术领域， 具体涉及一种固定化床发酵和分离相 耦合的生产乙醇的方法。 背景技术
乙醇作为一种可再生的洁净能源， 已成为工业生物技术领域的研究热 点。 传统的乙醇发酵工艺采用游离细胞发酵， 酵母随发酵醪不断流走， 造 成发酵罐中酵母细胞浓度不够大， 导致酒精发酵速度慢， 发酵时间较长。
近年来， 固定化酵母在燃料乙醇发酵生产上得到了越来越广泛的关注 和应用。 固定化细胞具有生产时间短、 产量稳定、 耐受高糖及高乙醇浓度 等优点， 能够有效提高乙醇生产效率。 传统的固定化方法主要采用凝胶包 埋技术， 即用角叉莱胶、 卡拉胶、 海藻酸钙、 海藻酸钠等对细胞进行固定 发酵。 虽然此类包埋载体具有成型方便及固定化密度高等优点， 但其机械 强度低， 传质弱， 抗微生物分解能力较差； 同时因传质限制， 难以实现细 胞自我更新。
另外， 代谢终产物 （高浓度乙醇）对菌体有明显的抑制和毒害作用。 微生物对乙醇的耐受力依菌种、 温度等条件而改变， 但通常乙醇的质量分 数达到 5 ~ 8%时， 就会对微生物产生明显的抑制作用。 虽然可以通过稀释 料液来减少高浓度产物对发酵的抑制作用， 但过低的乙醇浓度会使下游分 离提取的效率更低； 同时由于稀释需要消耗大量用水，也会造成成本增加。 发明内容
针对现有技术的不足之处， 本发明的目的在于提供一种采用微生物发 酵生产乙醇的方法，该方法不仅能有效保证乙醇稳定发酵、高效连续生产， 而且可以减小乙醇分离过程的能耗。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种固定化床发酵和分离相耦合的生产乙醇的方法， 该方法包括以下 步骤：
( 1 )将酵母细胞固定于生物反应器中的纤维材料； ( 2 )加入发酵培养基进行乙醇循环发酵；
( 3 ) 采用渗透汽化膜分离发酵液， 膜截留液返回生物反应器内， 渗 透液经树脂吸附后再返回生物反应器内；
( 4 )从树脂分离吸附的乙醇。
在上述方法中， 优选地， 所述步骤（ 1 ) 包括先将酵母细胞在种子生 长培养基中培养至对数生长期获得种子液， 再将种子液循环经过生物反应 器中的纤维材料， 使得酵母细胞固定于纤维材料。
在上述方法中， 更优选地， 所述步骤 （ 1 ) 包括先将酵母细胞在种子 生长培养基中培养至对数生长期获得种子液， 再在 30-40 °C下将种子液循 环经过生物反应器中的纤维材料， 使得酵母细胞固定于纤维材料； 其中， 所述种子液的流速 0.5-50 L/小时。
在上述方法中， 所述种子生长培养基包含葡萄糖 10-100 g/L, 蛋白胨 10-100 g/L, 酵母膏 10-100 g/L, 无水硫酸镁 0.1-5 g/L, 硫酸铵 0.1-10 g/L, 磷酸盐 1-10 g/L, pH为 4-6。
在上述方法中， 所述纤维材料选自植物纤维、 动物纤维和合成纤维中 的一种或多种； 优选地， 所述纤维材料的装填量为 10-150 g/L。
在上述方法中， 所述的生物反应器的高径比为 2-10。
在上述方法中， 优选地， 所述步骤（2 ) 包括当生物反应器中的溶液 的 OD值緩慢下降或小于 1时， 排出溶液， 加入发酵培养基在 30-40°C下 进行乙醇循环发酵。
在上述方法中， 所述发酵培养基包含葡萄糖 100-400 g/L, 蛋白胨 1-20 g/L, 酵母膏 1-20 g/L, 硫酸铵 0.1-10 g/L, 磷酸盐 1-10 g/L, 七水合硫酸亚 铁 0.05-0.5 g/L, 七水合硫酸锌 0.05-0.5 g/L, pH为 4-6.5; 或者所述发酵培 养基为包含葡萄糖 350 g/L, 硫酸铵 0.2 g/L, 硫酸镁 0.2 g/L的玉米水解液， pH为 4-6.5。
在上述方法中， 优选地， 所述发酵液的循环流速为 0.5-50 L/小时。 在上述方法中， 优选地， 所述步骤（3 ) 包括当发酵液中的乙醇浓度 达 50-90g/L时，以流速为 0.5-3柱床层体积 /小时将发酵液泵至渗透汽化膜， 采用渗透汽化膜分离发酵液， 膜截留液返回生物反应器内， 渗透液经树脂 柱吸附 10-60分钟后再返回生物反应器内； 其中， 所述渗透汽化膜为硅橡 胶膜、 聚碳酸酯膜、 聚丙烯膜、 聚砜膜、 聚丙烯腈膜、 聚丁二烯膜、 聚四 氟乙烯膜或丁苯橡胶膜， 或其两种或两种以上的复合膜； 其中， 所述膜可 以为管式、 平板或中空纤维膜形式； 其中， 所述树脂为以交联聚苯乙烯- 二乙烯基苯为骨架， 带有磺酸基团的极性树脂； 优选地， 所述树脂柱为两 才艮以上。
在上述方法中， 优选地， 所述步骤（4 ) 包括由树脂柱采用真空抽提 分离吸附的乙醇或由树脂柱采用曱酸洗脱分离吸附的乙醇。
在上述方法中，优选地，所述步骤（4 )包括从树脂柱采用在 -60到 -100 KPa的真空压力下抽提 5-60分钟分离吸附的乙醇，并在 - 10到 15 °C下冷却； 或从树脂柱采用曱酸洗脱 10-90分钟分离吸附的乙醇， 其中洗脱液流速为 0.2-2柱床层体积 /小时。
本发明根据将产物发酵与分离过程相耦合的可行思路， 提出了一种乙 醇发酵偶联分离的新型生产技术， 该技术通过在线分离不仅解除或大幅降 低了产物生产受抑制的不利影响， 而且还筒化了后期的提纯步骤。 即在利 用纤维材料对酵母细胞进行固定化发酵高产乙醇的基础上， 通过安装膜分 离装置及树脂分离装置， 达到边发酵边分离的目的。 该方法所用的固定化 载体不仅能高效吸附菌体， 而且能吸附少量杂质， 减轻了超滤膜的污染， 延长了其使用寿命； 同时， 联用易操作、 低能耗、 高吸附、 易脱附效果的 树脂进行产物分离， 可以进一步提高乙醇产率。
相对于现有技术， 本发明取得了以下有益效果：
1、 本发明采用的固定化技术所用材料成本低、 无毒性、 机械强度高、 吸附效果好； 而且， 死细胞可自行脱落， 活细胞能够实现自身增殖， 始终 维持很高的生产效率；
2、 采用与发酵单元耦合的膜及树脂进行在线分离， 及时降低了产物 的抑制效应， 促进了产物形成； 同时有利于提高底物浓度， 从而进一步提 高了乙醇产率。
3、 本发明的方法还可以减少设备体积， 提高设备利用率， 同时大幅 减少能耗， 降低生产成本。 附图说明
以下， 结合附图来详细说明本发明的实施方案， 其中：
图 1 为本发明固定化床发酵和分离相耦合的生产乙醇的方法的示意 图。 其中， 1-1、 1-2、 1-3表示罐； 2-1、 2-2、 2-3、 2-4、 2-5、 2-6、 2-7表 示阀门； 3-1、 3-2、 3-3、 3-4表示泵； 4表示生物反应器； 5表示汽化渗透 膜； 6表示树脂柱； 7表示真空循环泵； 8表示冷凝管； 9表示冷凝液收集 器； 10表示冷却器。 实施发明的最佳方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。 本领域技术人员能够理解， 这些 实施例仅用于说明本发明， 其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施 例中所用的原料、 试剂材料等， 如无特殊说明， 均为市售购买产品。
实施例一 以葡萄糖为原料进行发酵、 分离耦合制备乙醇
发酵培养基成分： 葡萄糖 250 g/L, 蛋白胨 7 g/L, 酵母膏 4 g/L, 硫酸铵 4 g/L, 磷酸盐 4 g/L, 七水合硫酸亚铁 0.1g/L, 七水合硫酸辞 0.1 g/L。
生产装置参见图 1。
首先， 以不锈钢网片为支撑骨架， 并将其制成两个直径不一样的筒状； 然后将活性炭纤维（填充量为 75 g/L )缠绕其上， 并使直径小的套入直径大 的圓筒中， 一并放于高径比为 4的反应器 4中。
然后， 将培养好的菌种（对数期）加到进料罐 1-1 中， 打开阀门 2-1、 2-3 , 关闭阀门 2-2、 2-4, 种子液通过泵 3-1从生物反应器 4底部以 15 L/h 的流速流进， 待种子液充满反应器， 关闭阀门 6-1 ; 循环固定若干时间， 直 至反应器 4中的溶液菌体浓度 ^艮小， 降低不明显。 然后打开阀门 2-4, 排出 废液。 然后加入新鲜发酵培养基， 依旧从生物反应器 4底部流进， 待发酵液 充满生物反应器 4后， 进行循环发酵。 其中， 发酵温度为 32°C , 发酵液 pH 为 5,液体流速为 15 L/h。待反应器内乙醇浓度达到 70 g/L左右，关闭泵 3-1 , 同时打开阀门 2-5、 2-6, 并打开泵 3-2,进行聚碳酸酯平板膜过滤及树脂（以 交联聚苯乙烯-二乙烯基苯为骨架， 带有磺酸基团的极性树脂）分离。 膜截 留液及经过树脂吸附后的液体重新流回生物反应器。 吸附 30 min后， 停止 膜过滤及树脂分离， 再次循环发酵； 同时打开真空循环泵 7及真空抽提冷凝 (其中真空度为 -60KPa, 冷凝稳定为 0°C ), 结束后关闭真空抽提及冷却装 置。 实验结果发现， 由于纤维床吸附能力强， 溶液中菌体量极低， 避免了膜 污染； 并且反应进行到 6 h, 乙醇浓度可达 72 g/L, 反应 10 h后残糖为 0, 产品收集罐内乙醇浓度达 550 g/L左右。 发酵 30批次， 乙醇产量稳定， 平均 反应时间相比单纯游离发酵缩短 2-4倍。 实施例二 以葡萄糖为原料进行发酵、 分离耦合制备乙醇
发酵培养基成分： 葡萄糖 300 g/L, 蛋白胨 3 g/L, 酵母膏 2 g/L, 硫酸铵 2 g/L, 磷酸盐 2 g/L, 7水合硫酸亚铁 0.05 g/L, 7水合硫酸辞 0.05 g/L。
生产装置参见图 1。
首先将棉纤维进行以下方式处理：
1 )将纤维材料在沸水中煮沸后烘干；
2 )将纤维材料置于浓度为 20 g/L的表面改性剂一聚醚酰亚胺水溶液 中浸泡， 并用 2mol/L的盐酸调节溶液的 pH至 7.0, 再将纤维材料置于去 离子水中充分漂洗后 60°C烘干；
3 )将纤维材料置于浓度为 10 g/L的交联剂一戊二醛水溶液中浸泡， 再将纤维材料置于去离子水中充分漂洗， 60°C烘干。
然后同样先以不锈钢网片为支撑骨架，并将其制成两个直径不一样的筒 状； 然后将经处理过的棉纤维（填充量为 60 g/L )缠绕其上， 并使直径小的 套入直径大的圓筒中， 一并放于高径比为 6的反应器 4中。
然后将对数期的菌种加到进料罐 1—1中， 打开阀门 2-1、 2-3 , 关闭阀门
2- 2、 2-4, 种子液通过泵 3-1从生物反应器 4底部以 20 L/h的流速流进， 待 种子液充满反应器， 关闭阀门 6-1 ; 循环固定若干时间， 直至反应器 4中的 溶液中的菌体浓度降低至 1 , 排出废液。 然后加入新鲜发酵培养基， 待发酵 液充满生物反应器 4后， 进行循环发酵。 其中， 发酵温度为 37°C , 发酵液 pH为 6, 液体流速为 10 L/h。 待反应器内乙醇浓度达到 60 g/L左右， 关闭泵
3- 1 , 同时打开阀门 2-5, 2-6, 并打开泵 3-2, 进行聚砜中空纤维膜过滤及树 脂（以交联聚苯乙烯-二乙烯基苯为骨架，带有磺酸基团的极性树脂）分离。 膜截留液及经过树脂吸附后的液体重新流回生物反应器。 吸附 40 min后， 关闭泵 3-2及阀门 2-6, 再进行循环发酵。 同时打开泵 3-4, 用罐 1-3中的曱 酸洗脱树脂柱中吸附的乙醇， 洗脱完后， 关闭分离系统。 实验结果发现， 反 应进行到 5.5 h, 乙醇浓度可达 64 g/L, 反应 15 h后残糖为 0, 产品收集罐内 乙醇浓度达 400 g/L左右； 发酵 30天， 平均产率为 10 gL"1^1; 并且用此法 进一步节约了能耗。 实施例三 以玉米水解液为原料进行发酵、 分离耦合制备乙醇
发酵培养基成分： 玉米水解液（含葡萄糖 350g/L左右 ) ,硫酸铵 0.2 g/L, 硫酸镁 0.2 g/L。 同样以不锈钢网片为支撑骨架， 并将其制成两个直径不一样的筒状； 然 后将涤纶（填充量为 40 g/L )缠绕其上， 并使直径小的套入直径大的圓筒中， 一并放于高径比为 5的反应器 4中。
然后采用实施例一的固定化方法， 循环固定若干时间， 直至反应器 4中 溶液菌体浓度降低不明显， 排出废液。 加入玉米水解液发酵培养基， 待发酵 液充满生物反应器 4后， 进行循环发酵。 其中， 发酵温度为 36°C , 发酵液 pH为 4.5 , 液体流速为 25 L/h。 待反应器内乙醇浓度达到 80 g/L左右， 关闭 泵 3-1 , 同时打开阀门 2-5, 2-6, 并打开泵 3-2, 进行聚丙烯腈管式膜过滤及 树脂（以交联聚苯乙烯-二乙烯基苯为骨架， 带有磺酸基团的极性树脂 )分 离。 膜截留液及经过树脂吸附后的液体重新流回生物反应器。 吸附 60 min 后， 停止膜过滤及树脂分离， 再次循环发酵； 同时打开真空循环泵 7及真空 抽提冷凝（其中真空度为 -70KPa, 冷凝稳定为 5°C ), 结束后关闭真空抽提 及冷却装置。 实验结果发现， 反应 18 h后残糖为 0, 产品收集罐内乙醇浓度 可达 450 g/L左右。 发酵 20批次， 平均产率为 6 g/L, 平均得率为 0.47, 未 发现染菌现象。

Claims

权 利 要 求
1. 一种固定化床发酵和分离相耦合的生产乙醇的方法，该方法包括以 下步骤：
( 1 )将酵母细胞固定于生物反应器中的纤维材料；
( 2 )加入发酵培养基进行乙醇循环发酵；
( 3 ) 采用渗透汽化膜分离发酵液， 膜截留液返回生物反应器内， 渗 透液经树脂柱吸附后再返回生物反应器内；
( 4 )从树脂柱分离吸附的乙醇。
2. 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤（1 ) 包括先 将酵母细胞在种子生长培养基中培养至对数生长期获得种子液， 再将种子 液循环经过生物反应器中的纤维材料， 使得酵母细胞固定于纤维材料； 优选地， 所述步骤 （ 1 ) 包括先将酵母细胞在种子生长培养基中培养 至对数生长期获得种子液， 再在 30-40 °C下使种子液循环经过生物反应器 中的纤维材料， 使得酵母细胞固定于纤维材料； 其中， 所述种子液的流速 0.5-50 L/小时。
3. 根据权利要求 2所述的方法， 其特征在于， 所述种子生长培养基包 含葡萄糖 10-100 g/L, 蛋白胨 10-100 g/L, 酵母膏 10-100 g/L, 无水硫酸镁 0.1-5 g/L, 硫酸铵 0.1-10 g/L, 磷酸盐 1-10 g/L, pH为 4-6。
4. 根据权利要求 1至 3中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述纤维 材料选自植物纤维、 动物纤维和合成纤维中的一种或多种；
优选地， 所述纤维材料的装填量为 10-150 g/L。
5. 根据权利要求 1至 4中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述的生 物反应器的高径比为 2-10。
6. 根据权利要求 1至 5中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 ( 2 ) 包括当生物反应器中的溶液的 OD值緩慢下降或小于 1时排出溶液， 加入发酵培养基在 30-40 °C下进行乙醇循环发酵。
7. 根据权利要求 6所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养基包含葡 萄糖 100-400 g/L, 蛋白胨 1-20 g/L, 酵母膏 1-20 g/L, 硫酸铵 0.1-10 g/L, 磷酸盐 1-10 g/L,七水合硫酸亚铁 0.05-0.5 g/L,七水合硫酸辞 0.05-0.5 g/L, pH为 4-6.5; 或者所述发酵培养基为包含葡萄糖 350 g/L, 硫酸铵 0.2 g/L, 硫酸镁 0.2 g/L的玉米水解液， pH为 4-6.5;
优选地， 所述发酵液的循环流速为 0.5-50 L/小时。
8. 根据权利要求 1至 7中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 ( 3 ) 包括当发酵液的乙醇浓度达 50-90 g/L时， 以流速为 0.5-3柱床层体 积 /小时将发酵液泵至渗透汽化膜， 采用渗透汽化膜分离发酵液，膜截留液 返回生物反应器内， 渗透液经树脂柱吸附 10-60 分钟后再返回生物反应器 内。
9. 根据权利要求 1至 8中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述渗透 汽化膜为硅橡胶膜、 聚碳酸酯膜、 聚丙烯膜、 聚砜膜、 聚丙烯腈膜、 聚丁 二烯膜、 聚四氟乙烯膜或丁苯橡胶膜， 或其两种或两种以上的复合膜； 优 选地， 所述膜为管式、 平板或中空纤维膜形式；
所述树脂为以交联聚苯乙烯-二乙烯基苯为骨架，带有磺酸基团的极性 树脂； 优选地， 所述树脂柱为两根以上。
10. 根据权利要求 1至 9中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述步 骤（4 ) 包括从树脂柱采用真空抽提分离吸附的乙醇或从树脂柱采用曱酸 洗脱分离吸附的乙醇；
优选地， 所述步骤（4 ) 包括从树脂柱采用在 -60到 -100 KPa的真空压 力下抽提 5-60min分离吸附的乙醇， 并在 -10到 15 °C下冷却； 或从树脂柱 采用曱酸洗脱 10-90 min分离吸附的乙醇，其中洗脱液流速为 0.2-2柱床层 体积 /小时。
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