CN101979615B

CN101979615B - 一种固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法

Info

Publication number: CN101979615B
Application number: CN201010559493.4A
Authority: CN
Inventors: 奚永兰; 吴昊; 姜岷; 陈啸鹏; 郭亭; 李志钢; 贺爱永; 汤艳
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2010-11-25
Filing date: 2010-11-25
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2030-11-25
Also published as: CN101979615A

Abstract

本发明公开了一种固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法，将改性固定化介质填充于固定床，与生物反应器循环串联；将丁醇生产菌接种至生物反应器中，在发酵培养基中培养，发酵液在固定床与生物反应器之间循环，将游离菌体细胞逐步吸附于固定床中；当生物反应器中丁醇浓度达到3～7g/L时，将发酵液泵入渗透汽化膜组件进行分离，收集渗透液，而膜截留液返回生物反应器内继续利用；同时，向生物反应器中流加发酵培养基，连续发酵生产丁醇。本发明显著削弱了原位分离耦合过程中存在的渗透汽化膜污染，延长了膜操作时间与寿命；解除了发酵过程中的丁醇产物抑制，实现了生物丁醇的高效连续生产。

Description

一种固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法。

背景技术

丁醇，又称正丁醇，是重要的有机化工原料，可用作油漆和表面涂料的溶剂，也用于生产邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)等增塑剂，2006年全球的丁醇需求量达300万吨。目前丁醇作为一种极具潜力的新型燃料已经引起国内外的高度重视，与乙醇相比，丁醇有能量密度大、对水的稳定性高、可直接用于内燃机、运输方便等优点。丁醇的生产方法主要有丙烯羰基合成法和发酵法，由于发酵法生产丁醇具有原料可再生、不依赖石油等特点，发酵法制备丁醇逐渐成为生物能源的研究热点之一。近年来生物丁醇生产装置逐年增加，我国相关企业的生物丁醇总生产能力已超过20万吨/年，但目前生物丁醇的发酵存在严重的产物抑制现象，当丁醇浓度达到5～11g/L时，丁醇生产菌株的生长与代谢即会发生显著毒害甚至死亡，目前采用间歇分批发酵，丁醇发酵生产的丁醇、丙酮、乙醇的总溶剂浓度(以下简称为ABE)＜30g/L，ABE生产速率＜0.3g/L·h，导致生产成本居高不下，缺乏与石化丁醇竞争的经济优势，部分生产装置处于停工半停工状态。因此提高丁醇的生产效率并降低分离成本是推动生物丁醇产业发展的必由之路。

近年来已有相关专利涉及生物丁醇的高效制备技术。专利87103534公开了一种利用处于指数生长期的产丁醇梭菌菌液，通过瓷环吸附制成固定化细胞；专利200910183152公开了一种利用处于指数生长期的产丁醇梭菌菌液，通过秸秆吸附制成固定化细胞的方法，这些专利方法虽然缩短了发酵延滞期，但无法解决产物丁醇对细胞的毒害，只能进行低产物浓度的连续生产。专利200610114241.4公开了一种利用膜反应器进行汽爆秸秆循环酶解并耦合丙酮丁醇连续发酵的方法，虽然降低了原料成本，但仍然无法避免产物抑制。专利201010122897公开了一种连续萃取发酵生产生物丁醇的方法，在发酵液中加入萃取剂混合进行萃取丁醇，将含有丁醇的萃取剂分离后的发酵液送入下一发酵罐继续进行发酵，可减少丁醇产物抑制并实现其连续发酵，虽然该法使用的萃取剂油醇具有较好的生物相容性，但直接与细胞接触仍会影响菌株的生长与代谢活力，同时在回收昂贵的萃取剂时将消耗大量能量。渗透汽化是近年来出现的一种选择性分离有机溶剂的膜分离手段，具有能耗低、效率高的优点，专利201010136813和专利201010162856均公开了利用渗透汽化分离与丁醇发酵过程耦合的方法，这些方法可解除丁醇的产物抑制，便于进行高效的连续发酵，但根据实践与文献报道，渗透汽化膜长期直接分离含有活细胞的丁醇发酵液，将不可避免地产生膜污染，膜的渗透分离通量和分离选择性迅速下降，丁醇在发酵体系中逐渐积累，导致产物抑制，生产速率迅速降低，不利于长期连续发酵并缩短了渗透汽化膜的操作寿命，虽然文献报道可通过微滤、超滤等手段避免渗透汽化膜与活细胞直接接触，但增加了系统的复杂性和成本，不利于放大。因此避免发酵耦合过程中渗透汽化膜分离性能的下降是实施高效连续发酵制备生物丁醇的关键技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法，以解决产物抑制导致的生物丁醇生产效率低下的难题。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将对丁醇生产菌具有电荷吸附效应的改性固定化介质填充于固定床，与生物反应器循环串联；

(2)将丁醇生产菌接种至生物反应器中，在发酵培养基中培养至指数期，发酵液在固定床与生物反应器之间循环，将处于指数期的游离菌体细胞逐步吸附于固定床中；

(3)当生物反应器中丁醇浓度达到3～7g/L时，将发酵液泵入渗透汽化膜组件进行原位分离，收集丁醇渗透液，而膜截留液同步返回生物反应器内继续利用；

(4)在步骤(3)操作同时，向生物反应器中流加发酵培养基，连续发酵生产丁醇；

步骤(1)中，所述的固定化介质包括：经过改性处理的农业秸秆、甘蔗渣、玉米芯、棉纤维、麻纤维、活性炭纤维、聚乙烯醇纤维、聚砜纤维、颗粒炭、多孔陶瓷滤料、沸石滤料、火山岩滤料和页岩滤料中的任意一种。所述的改性，是指增加固定化介质上的酸性含氧官能团或在固定化介质上负载金属离子使其表面负载正电荷。具体方法为利用浓硝酸、浓盐酸、浓硫酸或浓磷酸对固定化介质进行表面酸改性处理，或者，利用生物相容性较好的氯化铁、硫酸镁或氯化钙对固定化介质进行表面改性处理，使其表面负载正电荷。

细胞固定化技术可实现对游离细胞的负载并改善其生长和代谢性能，固定床吸附与传统的细胞包埋法相比，材料空隙发达，具有较小的空间位阻和良好的传质性能，可重复使用，有利于丁醇生产菌在材料表面及内部的富集增殖，但传统的吸附法采用物理吸附固定细胞时，附着力较差，细胞容易脱落，影响其在固定化中的应用。丁醇生产菌可在pH4.5～5.5的弱酸性环境下生长，并代谢出乙酸、丁酸等中间产物，发酵液逐渐形成弱酸性环境，在此条件下其菌体细胞表面带有负电荷，而固定化介质表面具有的含氧官能团(-CHO、-OH、-COOH、-C＝O等四种形式存在)在酸性条件下会成为带电中心，使介质的表面有正电荷区域存在。而通过向介质表面负载生物相容性好的高价金属阳离子，也可使其表面携带正电荷。根据电荷效应及共价吸附作用，载体表面的正电位越高，则菌体越易在载体上附着生长，因此其结合力显著增强，细胞不易脱落。

步骤(1)中，改性固定化介质填充于固定床之后，一般需经过消毒处理，例如高温蒸汽灭菌、强碱化学灭菌。

步骤(2)中，所述的丁醇生产菌为梭状芽孢杆菌(Clostridium)，该菌株培养温度为35～38℃，发酵过程中不需要调控发酵液pH值。

步骤(2)和(4)中，所述的发酵培养基为初始pH 4.5～6.5的含有碳源、氮源、无机盐及生长因子的液体培养基。

其中，所述的碳源为葡萄糖、糖蜜、废乳清、玉米粉糖化液、木薯粉糖化液及农林业木质纤维素水解糖液中的任意一种或几种，其中，农林业木质纤维素包括农业秸秆、玉米皮、谷糠、玉米芯、甘蔗渣和锯木粉中的任意一种或几种。步骤(2)中，培养基中的总糖浓度为30～100g/L，步骤(4)中培养基中的总糖浓度为50～100g/L。

其中，所述的氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和硫酸铵中的任意一种或几种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、酵母粉、玉米浆和尿素中的任意一种或几种，培养基中氮源浓度为0.5～3g/L。

其中，所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、锰盐和铁盐中的任意一种或几种，培养基中无机盐浓度为0.01～3g/L.

其中，所述的生长因子为生物素、硫胺素和对氨苯甲酸中的任意一种或几种，培养基中生长因子浓度为0.01～10mg/L。

步骤(3)中，所述的渗透汽化膜是由对丁醇、丙酮和乙醇具有亲和力的以下至少一种膜材料组成，包括硅橡胶、聚三甲基硅丙炔、聚丙烯、聚丁二烯、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯或其衍生物、丁苯橡胶、丁腈橡胶、乙丙二烯橡胶、聚醚酰胺嵌段共聚物、全硅分子筛；渗透汽化膜组件为由一个或一个以上的单元渗透汽化膜组成，各单元渗透汽化膜的渗透侧通过管路并联于真空泵总管，单元渗透汽化膜为管式、平板或中空纤维膜等形式。当反应器中的丁醇浓度达3～7g/L时，渗透汽化膜在发酵温度下直接与发酵液接触进行分离，渗透汽化膜的渗透侧的丁醇、丙酮、乙醇三者的总浓度达100～300g/L，其中丁醇浓度不低于60g/L。

步骤(4)中，调控发酵培养基的流加速率以维持生物反应器内发酵液总体积不变。

有益效果：本发明方法显著削弱了原位分离耦合过程中存在的渗透汽化膜污染，延长了膜操作时间与寿命；解除了发酵过程中的丁醇产物抑制，实现了生物丁醇的高效连续生产，在提高溶剂生产速率的同时达到分离与产物富集同步，可降低提取能耗，有助于降低生物丁醇的生产成本。

附图说明

图1为本发明的以固定床反应器与渗透汽化分离耦合连续发酵制备生物丁醇的工艺流程图。其中，1：固定床，2：循环泵，3：反应器，4：循环泵，5：渗透汽化膜组件，6：补料装置，7：冷凝器，8：真空泵。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

以葡萄糖为原料发酵制备丁醇，发酵培养基组成：葡萄糖60g/L，玉米浆1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，一水硫酸锰0.01g/L，氯化钠0.01g/L，七水硫酸镁0.2g/L，乙酸胺2g/L，硫胺素1mg/L，初始pH6.0。

粉碎至2-3cm长的甘蔗渣经过68％(w/w)浓硝酸处理4h后，作为固定化介质填充于固定床1中，经过蒸汽灭菌后备用。

发酵培养基蒸汽灭菌冷却后，将生物反应器3与固定床1连接，通过泵2将培养基通入固定床1并循环回生物反应器3，通无菌氮气30min后停止循环，接种丁醇生产菌株Clostridium acetobutylicum 1.134(http://www.cgmcc.net/index.php/Contents/show/id/100)，厌氧条件下，发酵温度为35℃，发酵至12h，菌体处于指数期，将发酵液泵至固定床1形成循环，发酵至24h，体系中丁醇浓度达3g/L，此时打开进料泵4和真空泵8，将发酵液以12L/h的进料速度泵入渗透汽化膜组件5，进行耦合分离，渗透侧的真空度维持在3毫米汞柱，渗透汽化膜组件由一个管式硅橡胶/陶瓷复合膜构成，发酵产生的丙酮、丁醇及乙醇(以下简称为ABE)被连续地移出反应体系，透过渗透汽化膜并汽化进入冷凝器7被收集，未透过的料液返回生物反应器3中。经过耦合分离12h后，通过补料装置6向反应器3中流加与渗透汽化膜分离获得的渗透液体积相同的发酵培养基(其中，葡萄糖200g/L，其它成分同发酵培养基，经过灭菌处理)并暂停耦合分离，继续发酵4h，反应器内丁醇浓度达到3g/L时，再次耦合分离12h，从冷凝器7中收集渗透液，停止耦合后再次补入发酵培养基(其中，葡萄糖200g/L，经过灭菌处理)，如此重复5次至发酵结束。合计耦合发酵100h。与间歇发酵相比，经冷凝器收集的渗透液中被浓缩的ABE达150g/L，其中丁醇浓度达80g/L，比分批发酵提高了7倍，丁醇的生产强度达到0.285g/L·h，比间歇发酵提高了1.5倍。反应器内的游离细胞浓度仅为分批发酵的20％，而渗透汽化膜的渗透通量在整个耦合分离过程中仅降低了10％。

实施例2：

以玉米粉为原料发酵制备丁醇，发酵培养基组成为：玉米粉糖化液浓度为40g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，对氨基苯甲酸0.005g/L，初始pH5.5。

以直径为0.5～1cm的沸石滤料经过0.1mol/L的氯化铁处理5h后，作为固定化介质填充于固定床1中，经过蒸汽灭菌后备用。

发酵培养基蒸汽灭菌冷却后，将生物反应器3与固定床1连接，通过泵2将培养基通入固定床1并循环回生物反应器3，通无菌氮气20min后停止循环，接种丁醇生产菌株Clostridium acetobutylicum ATCC 824，厌氧条件下，发酵温度为36℃，发酵至8h，菌体处于指数期，将发酵液泵至固定床1形成循环，发酵至32h，体系中丁醇浓度达5g/L，此时打开进料泵4和真空泵8，将发酵液以24L/h的进料速度泵入渗透汽化膜组件5，进行耦合分离，渗透侧的真空度维持在3毫米汞柱，渗透汽化膜组件由一个管式填充全硅分子筛的硅橡胶/陶瓷复合膜构成，发酵产生的ABE溶剂被连续地移出反应体系，透过渗透汽化膜并汽化进入冷凝器7被收集，未透过的料液返回生物反应器3中，同时以通过补料装置6向生物反应器3中连续流加培养基(其中，玉米粉糖化液100g/L，其它成分同发酵培养基，经过灭菌处理)以维持生物反应器内发酵液总体积不变，连续耦合发酵200h。与间歇发酵相比，经冷凝器收集的渗透液中被浓缩的ABE达120g/L，其中丁醇浓度达65g/L，比分批发酵提高了8倍，丁醇的生产强度达到0.35g/L·h，比间歇发酵提高了2倍。反应器内的游离细胞浓度仅为分批发酵的30％，而渗透汽化膜的渗透通量在整个耦合分离过程中仅降低了23％。

实施例3：

以稀酸水解的玉米芯多组分糖液为原料发酵制备丁醇，发酵培养基组成为：总还原糖浓度为40g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，一水硫酸锰0.01g/L，生物素0.1mg/L，初始pH5.8。

活性炭纤维经过80％(w/w)的浓硫酸处理3h后，再用0.1mol/L的氯化铁处理6h，作为固定化介质填充于固定床1中，经过1mol/L氢氧化钠溶液化学消毒后备用。

发酵培养基蒸汽灭菌冷却后，将生物反应器3与固定床1连接，通过泵2将培养基通入固定床1并循环回生物反应器3，通无菌氮气30min后停止循环，接种丁醇生产菌株Clostridium beijerinckii ATCC 51743，厌氧条件下，发酵温度为37℃，发酵至12h，菌体处于指数期，将发酵液泵至固定床1形成循环，发酵至30h，体系中丁醇浓度达7g/L，此时打开进料泵4和真空泵8，将发酵液以48L/h的进料速度泵入渗透汽化分离器5，进行耦合分离，渗透侧的真空度维持在3毫米汞柱，渗透汽化膜组件由一个中空纤维式的硅橡胶/陶瓷复合膜构成，发酵产生的ABE溶剂被连续地移出反应体系，透过渗透汽化膜并汽化进入冷凝器7被收集，未透过的料液返回生物反应器3中，经过耦合分离12h后，通过补料装置6向生物反应器3中连续流加培养基(玉米芯多组分糖液，总糖浓度150g/L，其它成分同发酵培养基，经过灭菌处理)以维持生物反应器内发酵液总体积不变，连续耦合发酵170h。与间歇发酵相比，经冷凝器收集的渗透液中被浓缩的ABE达200g/L，其中丁醇浓度达120g/L，比分批发酵提高了12倍，丁醇的生产强度达到0.5g/L·h，比间歇发酵提高了3倍。反应器内的游离细胞浓度仅为分批发酵的17％，而渗透汽化膜的渗透通量在整个耦合分离过程中仅降低了15％。

实施例4：

以甘蔗糖蜜为原料发酵制备丁醇，发酵培养基组成为：总还原糖浓度为70g/L，过磷酸钙1.5g/L，乙酸胺2g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，一水硫酸锰0.01g/L，对氨基苯甲酸0.001g/L，生物素0.01mg/L，硫胺素0.001g/L，初始pH6.5。

聚乙烯醇纤维经过65％(w/w)的浓硝酸处理3h后，再用0.5mol/L的氯化钙处理3h，作为固定化介质填充于固定床1中，经过蒸汽灭菌后备用。

发酵培养基蒸汽灭菌冷却后，将生物反应器3与固定床1连接，通过泵2将培养基通入固定床1并循环回生物反应器3，通无菌氮气60min后停止循环，接种丁醇生产菌株Clostridium acetobutylicum XY16(CCTCC：M 2010011)，厌氧条件下，发酵温度为38℃，发酵至24h，菌体处于指数期，将发酵液泵至固定床1形成循环，发酵至32h，体系中丁醇浓度达4g/L，此时打开进料泵4和真空泵8，将发酵液以8L/h的进料速度泵入渗透汽化分离器5，进行耦合分离，渗透侧的真空度维持在3毫米汞柱，渗透汽化膜组件由一个管式的硅橡胶/陶瓷复合膜构成，发酵产生的ABE溶剂被连续地移出反应体系，透过渗透汽化膜并汽化进入冷凝器7被收集，未透过的料液返回生物反应器3中，经过耦合分离10h后，通过补料装置6向生物反应器3中连续流加培养基(甘蔗糖蜜，总还原糖浓度500g/L，其它成分同发酵培养基，经过灭菌处理)以维持生物反应器内发酵液总体积不变，连续耦合发酵280h。与间歇发酵相比，经冷凝器收集的渗透液中被浓缩的ABE达184g/L，其中丁醇浓度达112g/L，比分批发酵提高了9倍，丁醇的生产强度达到0.6g/L·h，比间歇发酵提高了4倍。反应器内的游离细胞浓度仅为分批发酵的11％，而渗透汽化膜的渗透通量在整个耦合分离过程中仅降低了10％。

对比例1：

在无菌工作台上用经过蒸汽灭菌的40g/L的海藻酸钠溶液与含有Clostridiumacetobutylicum XY16(CCTCC：M 2010011)的种子液按照1∶1的体积混合均匀，通过蠕动泵滴入60g/L的氯化钙溶液，搅拌，固化20min后，制得直径为3-5毫米的含有活细胞的固定化胶珠，填充于固定化介质填充于经过蒸汽灭菌的固定床1中。

发酵培养基蒸汽灭菌冷却后，将生物反应器3与固定床1连接，通过泵2将培养基通入固定床1并循环回生物反应器3，通无菌氮气30min，厌氧条件下，发酵温度为38℃，发酵至32h，体系中丁醇浓度达4g/L，此时打开进料泵4和真空泵8，将发酵液以8L/h的进料速度泵入渗透汽化分离器5，进行耦合分离，渗透侧的真空度维持在3毫米汞柱，渗透汽化膜组件由一个管式的硅橡胶/陶瓷复合膜构成，发酵产生的ABE溶剂被连续地移出反应体系，透过渗透汽化膜并汽化进入冷凝器7被收集，未透过的料液返回生物反应器3中，经过耦合分离10h后，通过补料装置6向生物反应器3中连续流加培养基(甘蔗糖蜜，总还原糖浓度500g/L，其它成分同发酵培养基，经过灭菌处理)以维持生物反应器内发酵液总体积不变，连续耦合发酵120h。与间歇发酵相比，经冷凝器收集的渗透液中被浓缩的ABE达110g/L，其中丁醇浓度达62g/L，比分批发酵提高了5倍，丁醇的生产强度为0.19g/L·h，仅比间歇发酵提高了26.7％，远低于相同条件下固定床反应器耦合发酵下的丁醇生产速率。耦合发酵至78h时，少数胶粒开始破裂，膜的渗透通量迅速下降，至耦合发酵结束，70％的胶粒发生破碎，渗透汽化膜的渗透通量在整个耦合分离过程中降低了50％，比相同条件下固定床反应器耦合发酵的最终渗透通量减少了44％。

Claims

1.一种固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

（1）将对丁醇生产菌具有电荷吸附效应的改性固定化介质填充于固定床，与生物反应器循环串联；

（2）将丁醇生产菌接种至生物反应器中，在发酵培养基中培养至指数期，发酵液在固定床与生物反应器之间循环，将处于指数期的游离菌体细胞逐步吸附于固定床中；

（3）当生物反应器中丁醇浓度达到3～7g/L时，将发酵液泵入渗透汽化膜组件进行原位分离，收集丁醇渗透液，而膜截留液同步返回生物反应器内继续利用；

（4）在步骤（3）操作同时，向生物反应器中流加发酵培养基，连续发酵生产丁醇；

步骤（1）中，所述的固定化介质包括：经过改性处理的农业秸秆、甘蔗渣、玉米芯、棉纤维、麻纤维、活性炭纤维、聚乙烯醇纤维、聚砜纤维、颗粒炭、多孔陶瓷滤料、沸石滤料、火山岩滤料和页岩滤料中的任意一种；所述的改性，方法为利用浓硝酸、浓盐酸、浓硫酸或浓磷酸对固定化介质进行表面酸改性处理，或者，利用氯化铁、硫酸镁或氯化钙对固定化介质进行表面改性处理；

步骤（3）中，所述的渗透汽化膜组件为由硅橡胶/陶瓷复合膜构成。

2.根据权利要求1所述的固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法，其特征在于步骤（2）中，所述的丁醇生产菌为梭状芽孢杆菌（Clostridium）。

3.根据权利要求1所述的固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法，其特征在于步骤（2）和（4）中，所述的发酵培养基为初始pH 4.5～6.5的含有碳源、氮源、无机盐及生长因子的液体培养基。

4.根据权利要求3所述的固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法，其特征在于所述的碳源为葡萄糖、糖蜜、废乳清、玉米粉糖化液、木薯粉糖化液及农林业木质纤维素水解糖液中的任意一种或几种，步骤（2）中，培养基中的总糖浓度为30～100g/L，步骤（4）中培养基中的总糖浓度为50～100g/L。

5.根据权利要求3所述的固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法，其特征在于所述的氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和硫酸铵中的任意一种或几种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、酵母粉、玉米浆和尿素中的任意一种或几种，培养基中氮源浓度为0.5～3g/L。

6.根据权利要求3所述的固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法，其特征在于所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、锰盐和铁盐中的任意一种或几种，培养基中无机盐浓度为0.01～3g/L。

7.根据权利要求3所述的固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法，其特征在于所述的生长因子为生物素、硫胺素和对氨苯甲酸中的任意一种或几种，培养基中生长因子浓度为0.01～10mg/L。

8.根据权利要求1所述的固定床发酵分离耦合连续生产生物丁醇的方法，其特征在于步骤（4）中，调控发酵培养基的流加速率以维持生物反应器内发酵液总体积不变。