CN101255446B

CN101255446B - 一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法

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Publication number: CN101255446B
Application number: CN200710159081XA
Authority: CN
Inventors: 刘天庆; 隋东宇; 李香琴; 孙相彧; 姜秀美
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2007-12-18
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2027-12-18
Also published as: CN101255446A

Abstract

一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法，属于微生物发酵工程领域，特别涉及一种连续发酵葡萄糖木糖生产乙醇的方法。其特征是利用海藻酸钙胶珠把普通酿酒酵母细胞和嗜鞣管囊酵母细胞固定后，分别接种于两个串联的发酵罐内，并与硅橡胶渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖混合液。本发明的效果和益处是，通过海藻酸钙胶珠固定酵母细胞不但使细胞浓度增高，而且减少了由于细胞的粘附所造成的渗透蒸发膜的污染及阻力；通过渗透蒸发作用减少了产物乙醇对酵母细胞的抑制作用；能够同时发酵葡萄糖和木糖；取材于植物秸秆，不采用粮食，既节省资源又减少因焚烧秸秆而造成的环境污染。

Description

一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，特别涉及海藻酸钙胶珠固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵木糖和葡萄糖的方法。

背景技术

20世纪以来，作为主要能源之一的石油为人类的发展做出了巨大贡献，但是石油资源已经面临枯竭，酒精则成为最具潜力的替代品(Su T M et al，AIChE Symposium Series，1978，74(181)：75-78；Wyman C E et al，Proceedingsof the Intersociety Energy Conversion Engineering Conferenc，1994，3：1090-1095.)，因而利用植物纤维发酵生产酒精的研究，具有十分重要的意义。植物纤维原料包括纤维素、半纤维素和木质素，其水解液主要是葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等多种单糖和寡糖的混合物，是地球上最丰富的生物可再生资源，利用其作为廉价的糖源发酵生产燃料乙醇是解决世界能源危机的最有效途径(Lin Y et al，Applied microbiology and biotechnology，2006，69(6)：627-642；Janusz S et al，Biomass and Bioenergy，1996，10(5-6)：367-375.)。

在传统的发酵工艺中，主要采用间歇式发酵，这种方法乙醇转化率和生产能力都比较低，满足不了工业生产的要求(Gray K A et al，Current option inchemical biology，2006，10(2)：141-146.)。这主要是因为：细胞处于游离状态导致细胞数量低，而且细胞不能循环利用；发酵法生产燃料乙醇是一个产品抑制过程，随着发酵液中乙醇产物浓度的上升，酵母细胞的生长会受到抑制。一般来说，当酒精浓度达到90g·L^-1以上时，酵母细胞就会完全停止生长，发酵会处于停滞状态(伍勇，四川大学博士论文，2004.)。为了克服上述缺陷，必须使乙醇发酵连续化，其中首要问题就是要提高细胞浓度并不断把产物乙醇分离出去。

通过固定细胞，既可以达到提高细胞浓度的目的，还能够便于细胞的重复利用。目前关于细胞的固定方式主要有：表面吸附、包埋、微胶囊和细胞自身固定等(Verbelen P J et al，Biotechnol Letters，2006，28(19)：1515-1525.)。Bekers等人(Bekers M et al，Process Biochemistry，2000，35(5)：523-530.)把酵母细胞固定于表面经过氨处理过的铁丝球上进行发酵，装置的生产能力达到0.92～1.25g·L^-1·h^-1，并且铁丝球可以在间歇发酵中重复使用；Plessas等人(Plessas S，Bioresource Technology，2007，98(4)：860-865.)把酵母固定于橘子皮上，装置生产能力达到150.6g·L^-1·d^-1；Najafpour等人(Najafpour G，Bioresource Technology，2004，92(3)：251-260.)利用海藻酸钙固定普通酿酒酵母连续发酵葡萄糖制乙醇，生产能力达到2.8g·L^-1·h^-1；邓旭等人(邓旭等，食品与发酵工业，1995，6.)也使用海藻酸钙固定普通酿酒酵母和毕赤氏酵母连续发酵木糖、葡萄糖混合液，生产能力为6.47g·L^-1·h^-1；Talebnia等人(Talebnia F，Biotechnology and bioengineering，2005，90(3)：345-353.)用海藻酸钙制得微胶囊将普通酿酒酵母包裹其中间歇发酵乙醇，生产能力为5.15g·L^-1·h^-1；Peinado等人(Peinado R A et al，Biotechnology Letters，2005，27(18)：1421-1424.)利用青霉菌制成微胶囊固定普通酿酒细胞间歇发酵葡萄汁，生产能力是游离发酵的2倍；徐铁军等人(Xu T J et al，Enzyme and MicrobialTechnology，2005，37(6)：634-640.)使用自絮凝酵母连续发酵葡萄糖，生产能力为3.44g·L^-1·h^-1。前人的这些固定方法虽然能提高酵母浓度，但是提高的程度都不大。这主要是因为产物乙醇的抑制作用。国内外学者已经提出了许多与发酵耦合的乙醇原位分离技术，包括真空蒸馏、溶剂萃取、膜蒸馏、膜过滤、膜渗透蒸发和CO₂气提等方法(Zhangwen Wu et al，Applied Biochemistryand Biotechnonogy，1998(70-72)：479-492；杨斌等，生物工程学报，1997，13(4)：380～384；Ho N W V et al，Applied and Environmental Microbiology，1998，64(5)：1852～1859.)，以实现乙醇的发酵分离一体化。与其它技术相比，使用渗透蒸发膜进行乙醇连续发酵具有过程及设备简单、能耗小、能通过分级冷凝直接得到指定浓度产品等优点。Shabtai、张卫等人(Shabtai Y et al，Biotechnology and Bioengineering，1991，38(8)：869-876；张卫等，膜科学与技术，1997，17(3).)将硅橡胶/聚砜复合管式膜应用于乙醇分离，存在膜分离性能下降的现象，并分析这是由于死亡细胞等造成膜污染和浓差极化所致；钟月华等人(钟月华，膜科学与技术，2005，25(5).)将硅橡胶膜应用于连续发酵，虽然达到了分离乙醇减少抑制的目的，但是80小时后由于游离酵母细胞的存在使得膜污染现象非常严重。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法。

本发明的技术方案包括以下步骤：

1.普通酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母细胞的活化培养：用两个三角瓶分别配置200ml细胞活化培养基，其中含葡萄糖50g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 2g·L^-1，KH₂PO₄ 2g·L^-1，酵母粉5g·L^-1，蛋白胨5g·L^-1。115℃下灭菌25min，冷却至室温。在无菌操作台上将保存于斜面培养基上的两种酵母细胞分别刮下少许，放入各自的活化培养基中，30℃、150转/分条件下摇床培养48小时；

2.海藻酸钙胶珠包埋酵母细胞：将浓度为40g·L^-1的海藻酸钠溶液400mL平均分为两份，分别与活化后的普通酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母细胞混合均匀，通过蠕动泵以7.6mL·min^-1的速率分别滴入浓度为60g·L^-1的CaCl₂溶液中，以150～200转/分不断搅拌，固化20分钟，制得直径为4～6mm的分别包埋普通酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母的固定化胶珠；

3.配置细胞增殖培养基及发酵培养基：细胞增殖培养基包含葡萄糖50g·L^-1，酵母膏2g·L^-1，KH₂PO₄ 2g·L^-1，MgSO₄ 0.2g·L^-1，CaCl₂ 0.2g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 2g·L^-1；发酵培养基包含葡萄糖50g·L^-1，木糖25g·L^-1，酵母膏2g·L^-1，KH₂PO₄ 2g·L^-1，MgSO₄ 0.2g·L^-1，CaCl₂ 0.2g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 2g·L^-1。115℃下灭菌25min，冷却至室温，待用；

4.发酵罐内酵母细胞的扩增：用洗涤剂及软刷清洗发酵罐、缓冲罐、硅胶管、铁管、胶塞等，超纯水冲洗三遍并用牛皮纸包好，121℃下灭菌25min，烘干。把两个发酵罐固定于实验架上，将包埋酵母细胞的胶珠分别装入两个发酵罐中，使每个罐中胶珠总体积占整个发酵罐体积的70～80％，超纯水冲洗掉胶珠表面残留的CaCl₂。串联两个发酵罐，35℃下循环发酵罐中的细胞增殖培养基，使酵母细胞适应新环境并增殖，直至葡萄糖浓度降至1g·L^-1以下；

5.与渗透蒸发膜耦合，连续发酵葡萄糖木糖混合液：把细胞增殖培养基换为发酵培养基，分别于两个串连的发酵罐之间及后一个发酵罐与回收罐之间联入渗透蒸发膜组件，进行循环发酵；

6.分离乙醇：32小时后，循环发酵过程进入稳定状态，启动真空泵，进行渗透蒸发分离乙醇，分离出的乙醇蒸汽用冷阱冷凝收集于产品罐中。

本发明的效果和益处是：

(1)将酵母细胞固定后提高了发酵细胞的浓度，增加了发酵速度；

(2)用渗透蒸发膜分离乙醇有效降低了乙醇对细胞发酵的抑制作用，改善了固定化细胞的生长环境，从而提高了细胞活性并进一步增加了固定化细胞的浓度；

(3)海藻酸钙胶珠固定酵母细胞与渗透蒸发膜相耦合，明显降低了膜分离乙醇过程的膜污染与阻力；

(4)以发酵植物秸秆而不是粮食为应用背景，既节省资源又减少因焚烧秸秆而造成的环境污染。

附图说明

图1是本发明所述的一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法操作流程图。

图2是本发明所述的一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法装置流程图。

图3是本发明所述的一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法所用膜组件的正视图(图3(A))和侧视图(图3(B))。

图4是本发明所述的一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法制备海藻酸钙胶珠(直径为4～6mm)流程示意图；

图5是本发明所述的一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法制备的海藻酸钙胶珠(直径为4～6mm)内部孔道的显微照片。

图6是本发明所述的一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法海藻酸钙胶珠(直径为4～6mm)包埋普通酿酒酵母细胞的显微照片(80hr)。

图7是本发明所述的一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法海藻酸钙胶珠(直径为4～6mm)包埋嗜鞣管囊酵母细胞的显微照片(80hr)。

图中：1发酵液储藏罐；2蠕动泵；3缓冲罐；4发酵罐；5渗透蒸发膜组件；6回收罐；7空气泵；8膜过滤器；9气体转子流量计；10产品罐；11真空泵；12膜组件俯视图；13膜组件侧视图；14酵母-海藻酸钠混合液；15磁力搅拌子；16CaCl₂溶液；17包埋酵母细胞的海藻酸钙胶珠。

具体实施方式

以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。

实施例1：

本实施例为用海藻酸钙包埋普通酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母细胞。

分别用两个三角瓶各配置200ml细胞活化培养基，其中含葡萄糖50g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 2g·L^-1，KH₂PO₄ 2g·L^-1，酵母粉5g·L^-1，蛋白胨5g·L^-1。115℃下灭菌25min，冷却至室温，待用。在无菌操作台上将保存于斜面培养基上的两种酵母细胞分别刮下少许，放入各自的活化培养基中，30℃、150转/分条件下摇床活化培养48小时。

配置200ml，60g·L^-1的CaCl₂溶液两瓶；400ml，40g·L^-1的海藻酸钠溶液一瓶。121℃下灭菌25min，冷却至室温，待用。将海藻酸钠溶液平分为两份，分别与活化后的普通酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母细胞混合均匀，制得海藻酸钠-酵母细胞混合液，通过蠕动泵以7.6ml·min^-1的速率滴入60g·L^-1的CaCl₂溶液中，CaCl₂溶液通过磁力搅拌器以150～200转/分不断搅拌，固化20分钟后，制得直径为4～6mm的分别包埋普通酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母细胞的固定化胶珠。

实验结果：两种酵母细胞活化培养48hr后，细胞浓度明显增加；包埋细胞的海藻酸钙固定化胶珠体积均匀，机械强度好。

此实施例说明：该活化方法适合普通酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母细胞的培养与增殖；制备固定化胶珠的方法可靠，制得的胶珠适于发酵罐内使用。

实施例2：

本实施例为发酵罐内酵母细胞的增殖培养。

细胞增殖培养基包含葡萄糖50g·L^-1，酵母膏2g·L^-1，KH₂PO₄ 2g·L^-1，MgSO₄ 0.2g·L^-1，CaCl₂ 0.2g·L^-1，(NH₄)₂5O₄ 2g·L^-1；发酵培养基包含葡萄糖50g·L^-1，木糖25g·L^-1，酵母膏2g·L^-1，KH₂PO₄ 2g·L^-1，MgSO₄ 0.2g·L^-1，CaCl₂0.2g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 2g·L^-1。115℃下灭菌25min，冷却至室温，待用。

用清洗剂及软刷清洗发酵罐、缓冲罐、硅胶管、铁管、胶塞等，超纯水冲洗三遍并用牛皮纸包好，121℃下灭菌25min，烘干；把两个发酵罐固定于实验架上，将包埋酵母细胞的胶珠分别装入两个发酵罐中，使每个罐中胶珠总体积占整个发酵罐体积的70～80％，超纯水冲洗掉胶珠表面残留的CaCl₂。将两个发酵罐串联，35℃下使细胞增殖培养基在串联的两个发酵罐中循环，直至细胞增殖培养基中葡萄糖浓度降到1g·L^-1以下。

实验结果：细胞增殖培养基在串联的两个发酵罐中循环约48小时后，培养基中葡萄糖浓度可降至1g·L^-1以下，此时普通酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母细胞浓度可达10⁷cells·gel^-1以上。

此实施例说明：通过细胞增殖培养基在串联的两个发酵罐中循环，能够增加胶珠内细胞浓度，为下一步实验提供了条件。

实施例3：

本实施例为耦合渗透蒸发膜，连续发酵葡萄糖木糖混合液，分离乙醇。

配置发酵培养基，包含葡萄糖50g·L^-1，木糖25g·L^-1，酵母膏2g·L^-1，KH₂PO₄ 2g·L^-1，MgSO₄ 0.2g·L^-1，CaCl₂ 0.2g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 2g·L^-1。115℃下灭菌25min，冷却至室温，待用。

以细胞发酵培养基替换增殖培养基，分别于两个串连的发酵罐之间及后一个发酵罐与回收罐之间联入渗透蒸发膜组件，35℃下进行循环发酵。发酵32小时后，整个装置进入稳定状态，启动真空泵进行渗透蒸发分离乙醇，分离出的乙醇蒸汽用冷阱冷凝收集于产品罐中。

实验结果：连续发酵370小时后，与膜耦合的发酵装置剩余葡萄糖0.134g·L^-1，剩余木糖4.921g·L^-1，乙醇浓度为12.256g·L^-1，转化率达0.457h^-1，乙醇生产能力为10.996g·L^-1·h^-1，普通酿酒酵母细胞浓度为8.35×10⁸cells·mL^-1，嗜鞣管囊酵母细胞浓度为5.31×10⁸cells·mL^-1。通过与无膜耦合的发酵装置发酵结果(剩余葡萄糖0.129g·L^-1，剩余木糖9.662g·L^-1，乙醇浓度为29.313g·L^-1，转化率达0.391h^-1，乙醇生产能力为9.404g·L^-1·h^-1，普通酿酒酵母细胞浓度为7.49×10⁸cells·mL^-1，嗜鞣管囊酵母细胞浓度为3.50×10⁸cells·mL^-1)相比较，剩余葡萄糖的浓度基本处于一个水平；有膜情况剩余木糖的浓度仅为无膜情况下的约50％；有膜装置相对无膜装置流出液中乙醇浓度有很大程度的降低；如果将渗透蒸发出的乙醇量折算在流出液中，所算得的转化率和生产能力与无膜情况下相比都有较大程度的提高；普通通酿酒酵母细胞浓度提高得不大；嗜鞣管囊酵母细胞浓度提高了两倍以上。

此实施例说明：发酵装置通过渗透蒸发作用，能够分离出乙醇原液，明显降低其对嗜鞣管囊酵母细胞的抑制作用，这使嗜鞣管囊酵母细胞浓度提高，进而提高了乙醇的产量；而由于葡萄糖主要由装于发酵罐1中的普通酿酒酵母细胞发酵，其发酵环境基本不受渗透蒸发膜的影响，故剩余葡萄糖浓度和普通酿酒酵母细胞浓度，在与有膜耦合和无膜耦合两种发酵状态下基本不变。

Claims

1.一种利用固定化酵母细胞与渗透蒸发膜耦合连续发酵葡萄糖木糖的方法，其特征在于以下步骤：

(1)普通酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母细胞的活化培养：配置两瓶200mL细胞活化培养基，其中含葡萄糖50g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 2g·L^-1，KH₂PO₄ 2g·L^-1，酵母粉5g·L^-1，蛋白胨5g·L^-1；115℃下灭菌25min，冷却至室温；在无菌操作台上将保存于斜面培养基上的两种酵母细胞放入各自的活化培养基中，在30℃，150转/分条件下摇床培养48小时；

(2)海藻酸钙胶珠包埋酵母细胞：将浓度为40g·L^-1的海藻酸钠溶液400mL平均分为两份，分别与活化后的普通酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母细胞混合均匀，通过蠕动泵以7.6mL·min^-1的速率分别滴入浓度为60g·L^-1的CaCl₂溶液中，以150～200转/分不断搅拌，固化20分钟，制得直径为4～6mm的分别包埋普通酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母的固定化胶珠；

(3)配置细胞增殖培养基及发酵培养基：细胞增殖培养基包含葡萄糖50g·L^-1，酵母膏2g·L^-1，KH₂PO₄ 2g·L^-1，MgSO₄ 0.2g·L^-1，CaCl₂ 0.2g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 2g·L^-1；发酵培养基包含葡萄糖50g·L^-1，木糖25g·L^-1，酵母膏2g·L^-1，KH₂PO₄ 2g·L^-1，MgSO₄ 0.2g·L^-1，CaCl₂ 0.2g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 2g·L^-1；115℃下灭菌25min，冷却至室温，待用；

(4)发酵罐内酵母细胞的扩增：用洗涤剂及软刷清洗发酵罐、缓冲罐、硅胶管、铁管、胶塞，超纯水冲洗三遍并用牛皮纸包好，121℃下灭菌25min，烘干；把两个发酵罐固定于实验架上，将包埋酵母细胞的胶珠分别装入两个发酵罐中，使每个罐中胶珠总体积占整个发酵罐体积的70～80％，超纯水冲洗掉胶珠表面残留的CaCl₂；串联两个发酵罐，35℃下循环发酵罐中的细胞增殖培养基，使酵母细胞适应新环境并增殖，直至葡萄糖浓度降至1g·L^-1以下；

(5)与渗透蒸发膜耦合，连续发酵葡萄糖木糖混合液：把细胞增殖培养基换为发酵培养基，分别于两个串连的发酵罐之间及后一个发酵罐与回收罐之间联入渗透蒸发膜组件，进行循环发酵；

(6)分离乙醇：32小时后，循环发酵过程进入稳定状态，启动真空泵，进行渗透蒸发分离乙醇，分离出的乙醇蒸汽用冷阱冷凝收集于产品罐中。