CN104789453A - 一种实验室用厌氧固定化发酵装置以及厌氧发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种实验室用厌氧固定化发酵装置以及厌氧发酵方法，发酵装置包括无菌蒸馏水瓶、CO₂发生瓶、缓冲液瓶、发酵反应瓶、培养基注射器以及厌氧指示瓶，无菌水瓶与CO₂发生瓶通过上端开口相连通，且CO₂发生瓶还与缓冲液瓶通过导管相连通，缓冲液瓶通过导管与发酵反应瓶相连通，发酵反应瓶还具有培养基注入口、发酵液排出口以及厌氧检测接口。本发明利用大多数实验室都应具备的碳酸氢钠和柠檬酸等试剂以及抽滤瓶、试剂瓶等器材，组建起一套实用有效的厌氧发酵装置，结构简单实用，且成本较低，便于推广使用。

Description

一种实验室用厌氧固定化发酵装置以及厌氧发酵方法

技术领域

本发明涉及实验仪器技术领域，具体涉及一种实验室用厌氧固定化发酵装置以及厌氧发酵方法。

背景技术

微生物的研究往往离不开发酵培养，并且有些微生物属于兼性或专性厌氧菌，因而需要采用厌氧发酵装置。对实验室而言，要想进行厌氧微生物的研究需要配备专门的厌氧工作站，但是厌氧工作站设备昂贵且操作复杂，有些不是专门从事这方面研究的实验室可能不具备这些实验条件，而个别实验阶段需要用到厌氧发酵时研究便受到了限制。

发明内容

本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种实验室用厌氧固定化发酵装置以及厌氧发酵方法。

本发明为解决上述技术问题的不足，所采用的技术方案是：一种实验室用厌氧固定化发酵装置，包括无菌蒸馏水瓶、CO₂发生瓶、缓冲液瓶、发酵反应瓶、培养基注射器以及厌氧指示瓶，所述CO₂发生瓶内填充有重量比为1：1的碳酸氢钠和柠檬酸混合干粉，缓冲液瓶内的缓冲液体为无菌蒸馏水，厌氧厌氧指示瓶内装有亚甲兰指示剂。所述无菌水瓶与CO₂发生瓶通过上端开口相连通，且CO₂发生瓶还与缓冲液瓶通过导管相连通，该导管的一端置于CO₂发生瓶内，其另一端没入缓冲液瓶中的缓冲液内，导管上还设置有阀门A，缓冲液瓶通过导管与发酵反应瓶相连通，该导管上设置有阀门B，发酵反应瓶还具有培养基注入口、发酵液排出口以及厌氧检测接口，发酵反应瓶底部铺设有一层凝胶小珠，发酵液排出口设置在高于凝胶小珠层的位置且发酵液排出口设置有阀门C，发酵反应瓶的培养基注入口可连接培养基注射器，发酵反应瓶的厌氧检测接口通过导管连接厌氧指示瓶，该导管上设置有阀门D。

一种采用上述发酵装置进行厌氧固定化发酵的方法，具体为：包括以下步骤：

（1）将发酵装置的各个部件经过高压灭菌处理，然后在无菌操作台上制备凝胶小珠，并将需要发酵的菌种固定在凝胶小珠里，备用；

（2）将步骤（1）备用的凝胶小珠转入发酵反应瓶中，然后通过培养基注射器向发酵反应瓶内加入培养基，加入结束后封闭发酵反应瓶的培养基注入口；

（3）打开阀门A、B和D，挤压无菌蒸馏水瓶，使无菌蒸馏水瓶内的蒸馏水进入CO₂发生瓶内与混合干粉反应，产生大量CO₂气体，当厌氧厌氧指示瓶内的指示剂变为无色时，关闭阀门B和D，将发酵反应瓶拆除并密封，然后将密封好的发酵反应瓶放入恒温摇床进行培养；

（4）发酵完成后，取出发酵反应瓶，打开阀门C，收集成熟发酵液，装入瓶中密封保存。

有益效果

本发明利用大多数实验室都应具备的碳酸氢钠和柠檬酸等试剂以及抽滤瓶、试剂瓶等器材，组建起一套实用有效的厌氧发酵装置，结构简单实用，且成本较低，便于推广使用。

附图说明

图1为本发明发酵装置的结构示意图；

图中标记：1、无菌蒸馏水瓶，2、CO₂发生瓶，3、缓冲液瓶，4、发酵反应瓶，5、培养基注射器，6、厌氧指示瓶，7、阀门A，8、阀门B，9、阀门C，10、阀门D。

具体实施方式

如图所示：一种实验室用厌氧固定化发酵装置，包括无菌蒸馏水瓶1、CO₂发生瓶2、缓冲液瓶3、发酵反应瓶4、培养基注射器5以及厌氧指示瓶6，所述CO₂发生瓶2内填充有重量比为1：1的碳酸氢钠和柠檬酸混合干粉，缓冲液瓶3内的缓冲液体为无菌蒸馏水，厌氧厌氧指示瓶6内装有亚甲兰指示剂。所述蒸馏无菌水瓶1与CO₂发生瓶2通过上端开口相连通，且CO₂发生瓶2还与缓冲液瓶3通过导管相连通，该导管的一端置于CO₂发生瓶2内，其另一端没入缓冲液瓶3中的缓冲液内，导管上还设置有阀门A7，缓冲液瓶3通过导管与发酵反应瓶4相连通，该导管上设置有阀门B8，发酵反应瓶4还具有培养基注入口、发酵液排出口以及厌氧检测接口，发酵反应瓶4底部铺设有一层凝胶小珠，发酵液排出口设置在高于凝胶小珠层的位置且发酵液排出口设置有阀门C9，发酵反应瓶4的培养基注入口可连接培养基注射器5，发酵反应瓶4的厌氧检测接口通过导管连接厌氧指示瓶6，该导管上设置有阀门D10。

一种采用上述发酵装置进行厌氧固定化发酵的方法（兔粪中双歧杆菌等有益菌的富集培养），具体为：包括以下步骤：

（1）将发酵装置的各个部件经过高压灭菌处理，然后在无菌操作台上制备凝胶小珠，并将需要发酵的菌种固定在凝胶小珠里，备用；

收集肉兔新鲜粪样（约2g），转移到含7mL预先制备的无菌蛋白胨水中（0.1%，pH 7），立即送入实验室中4℃保存。称量粪便悬浮液，用蛋白胨水调整最终粪样浓度为20%（w/v）。均质并轻微离心（700g/min）除去大颗粒。整个过程在排便后两小时内完成。

固定化凝胶小珠的制备：取菌悬液10 mL与10 mL 4％的海藻酸钠溶液（加热溶化后降温至40℃以下）混合。将200 mL 4％的CaCl2溶液移入烧杯中，30℃水浴10 min，将灭过菌的磁力搅拌子放入烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌机上，搅拌。将海藻酸钠菌体悬液移入注射器中，缓缓斜向下呈一定的角度距液面30cm滴入CaCl2溶液中，形成直径2～3 mm的固定化小球。滴完，4℃冰箱固定化2 h。最后生理盐水洗涤，浸于生理盐水中4℃保存备用。整个过程在无菌条件下1小时内完成。

（2）将步骤（1）备用的凝胶小珠转入发酵反应瓶中，然后通过培养基注射器向发酵反应瓶内加入培养基，加入结束后封闭发酵反应瓶的培养基注入口；

发酵培养基配方（g/L）：牛肉膏 2.4、蛋白胨 10、L-半胱氨酸 0.6、葡萄糖 2.5、酵母膏 5.0、NaCl 5.0。

（3）打开阀门A、B和D，挤压无菌蒸馏水瓶，使无菌蒸馏水瓶内的蒸馏水进入CO₂发生瓶内与混合干粉反应，产生大量CO₂气体，当厌氧厌氧指示瓶内的指示剂变为无色时，关闭阀门B和D，将发酵反应瓶拆除并密封，然后将密封好的发酵反应瓶放入恒温摇床进行培养；

（4）发酵完成后，取出发酵反应瓶，打开阀门C，收集成熟发酵液，装入瓶中密封保存。

    平板菌落鉴定和计数：分别取发酵前的粪样和发酵后的成熟发酵液涂平板计数，用Beerens培养基计双歧杆菌数，MRS培养基计乳酸菌数，麦康凯培养基计肠杆菌，EC培养基计肠球菌。

结果分析：经过厌氧固定化发酵获得的发酵液与粪样中的菌群组成对比如下表所示，可以看出，厌氧发酵处理后双歧杆菌和乳酸菌得到大量富集，尤其是严格厌氧的双歧杆菌，而好氧的肠杆菌和肠球菌含量明显降低。表明所设计的厌氧固定化装置能够为双歧杆菌等厌氧菌的培养提供良好的无氧发酵环境，装置有较强的实用性。

Claims (5)

1.一种实验室用厌氧固定化发酵装置，其特征在于：包括无菌蒸馏水瓶、CO₂发生瓶、缓冲液瓶、发酵反应瓶、培养基注射器以及厌氧指示瓶，所述无菌蒸馏水瓶与CO₂发生瓶通过上端开口相连通，且CO₂发生瓶还与缓冲液瓶通过导管相连通，该导管的一端置于CO₂发生瓶内，其另一端没入缓冲液瓶中的缓冲液内，导管上还设置有阀门A，缓冲液瓶通过导管与发酵反应瓶相连通，该导管上设置有阀门B，发酵反应瓶还具有培养基注入口、发酵液排出口以及厌氧检测接口，发酵反应瓶底部铺设有一层凝胶小珠，发酵液排出口设置在高于凝胶小珠层的位置且发酵液排出口设置有阀门C，发酵反应瓶的培养基注入口可连接培养基注射器，发酵反应瓶的厌氧检测接口通过导管连接厌氧指示瓶，该导管上设置有阀门D。

2.如权利要求1所述的一种实验室用厌氧固定化发酵装置，其特征在于：所述CO₂发生瓶内填充有重量比为1：1的碳酸氢钠和柠檬酸混合干粉。

3.如权利要求1所述的一种实验室用厌氧固定化发酵装置，其特征在于：所述缓冲液瓶内的缓冲液体为无菌蒸馏水。

4.如权利要求1所述的一种实验室用厌氧固定化发酵装置，其特征在于：所述厌氧厌氧指示瓶内装有亚甲兰指示剂。

5.采用权利要求1-4任一权利要求的发酵装置进行厌氧固定化发酵的方法，具体为：包括以下步骤：

（1）将发酵装置的各个部件经过高压灭菌处理，然后在无菌操作台上制备凝胶小珠，并将需要发酵的菌种固定在凝胶小珠里，备用；

（2）将步骤（1）备用的凝胶小珠转入发酵反应瓶中，然后通过培养基注射器向发酵反应瓶内加入培养基，加入结束后封闭发酵反应瓶的培养基注入口；

（3）打开阀门A、B和D，挤压无菌蒸馏水瓶，使无菌蒸馏水瓶内的蒸馏水进入CO₂发生瓶内与混合干粉反应，产生大量CO₂气体，当厌氧厌氧指示瓶内的指示剂变为无色时，关闭阀门B和D，将发酵反应瓶拆除并密封，然后将密封好的发酵反应瓶放入恒温摇床进行培养；

（4）发酵完成后，取出发酵反应瓶，打开阀门C，收集成熟发酵液，装入瓶中密封保存。