CN108018247A - 一种高产直链葡聚糖菌株及其葡聚糖发酵生产方法 - Google Patents

一种高产直链葡聚糖菌株及其葡聚糖发酵生产方法 Download PDF

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Abstract

一种高产直链葡聚糖菌株及其葡聚糖发酵生产方法，该菌株命名为柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21。本发明是从内蒙古锡林浩特市锡林郭勒盟土著牧民自制的奶豆腐中分离得到，并发现其可以产生具有优良特性的胞外多糖。将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21接种于含5％蔗糖的MRS基础培养基中，在初始培养基pH值为6～8，温度为25～37℃，摇床转速0～170rpm条件下，培养36～72h，得到发酵液；将粗多糖进行纯化，即得胞外多糖。本发明菌株及发酵生产方法具有产糖周期短、产糖量高、安全无毒副作用，且该胞外多糖具有较高的溶解性、乳化性和热稳定性，为工业化应用提供了理论基础和依据，具有广泛的商业化应用前景。

Description

一种高产直链葡聚糖菌株及其葡聚糖发酵生产方法
技术领域
本发明涉及一种高产直链葡聚糖菌株及其葡聚糖发酵生产方法。
背景技术
胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是微生物(如细菌、酵母、真菌)在其生长代谢过程中分泌到细胞外的粘液多糖或荚膜多糖。微生物胞外多糖因具有来源广泛、反应所需条件温和、易于分离纯化等优点，一直是胞外多糖理论和实践研究的主要来源。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类广泛分布于自然界中、能发酵碳水化合物、在发酵过程产生大量乳酸的不产芽孢、接触酶阴性、革兰氏阳性菌的统称。作为一类公认绿色安全无毒的食品级微生物(GRAS)，并且乳酸菌具有发酵周期短、营养要求简单等优越性，成为微生物胞外多糖的理想来源。利用乳酸菌来生产胞外多糖正日益受到国内外研究者的关注。
自40年代成功开发出由肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)发酵生产右旋糖酐(dextran)以来，世界范围内微生物胞外多糖的研究与开发取得了令人瞩目的成就，对新的微生物胞外多糖进行开发和利用已成为工业微生物研究的热点之一。乳酸菌胞外多糖已作为稳定剂、增稠剂被用于酸奶、奶酪等发酵奶制品的生产中。此外，乳酸菌EPS具有多种功能特性，可作为天然的增稠剂和质地改良剂应用于发酵乳制品中，还具有良好的生理活性如抗肿瘤、免疫调节活性等，也可以作为益生元促进肠道内乳双歧杆菌之类的有益菌的生长，调节肠道菌群平衡，促进宿主健康。因此与其他多糖相比，乳酸菌胞外多糖的研究更具有实际的应用价值，乳酸菌生长极为迅速，它的胞外多糖提取工艺更简单，安全性较高、价格便宜，比其他微生物多糖更适用于人类。已经有大量的研究报道关于自然界中发现的产EPS的乳酸菌菌株，但普遍存在产量不高的问题。因此，充分挖掘自然界中丰富的乳酸菌资源，发现高产胞外多糖的乳酸菌细菌菌株，以短周期、低成本获得更多的胞外多糖，一直是微生物学领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是为了拓展产胞外多糖的微生物菌种来源，提供一种高产直链葡聚糖菌株及其葡聚糖发酵生产方法。
一种高产直链葡聚糖菌株，其为柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21是从内蒙古锡林浩特市锡林郭勒盟土著牧民自制的奶豆腐中分离得到，并发现其可以产生具有优良特性的胞外多糖。经形态学、生理生化实验证明该菌为柠檬明串珠菌，并将其命名为柠檬明串珠菌N21(Leuconostoc citreum N21)，已于2017年12月4日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15015。
为了进一步验证该菌株的种属进而研究该菌株所产胞外多糖的结构和性质，进行了16S rDNA序列分析(上游引物8F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；下游引物1492R：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。该菌株经16S rDNA基因测序的结果见序列表SEQ ID NO:1。
通过傅里叶红外光谱(FT-IR)、气相色谱(GC)、高效体积排阻色谱(HPSEC)和核磁共振(NMR)技术对本发明产生的胞外多糖进行了结构分析，结果显示：本发明胞外多糖只含有一种糖单元，是一种高度线性的由ɑ-(1→6)糖苷键连接的葡聚糖，不含有支链。基于热重分析(TG)和理化性质的研究证明本发明胞外多糖具有较高的溶解性、乳化性和热稳定性，耐热性强(降解温度为308.47℃)。
表1形态学观察结果汇总
表2生理生化鉴定结果
注：+，阳性反应；－，阴性反应。
表3柠檬明串珠菌N21糖发酵试验结果
注：+，阳性反应；－，阴性反应。
一种高产直链葡聚糖的发酵生产方法，采取上述的高产直链葡聚糖菌株，包括以下步骤：
(1)将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21接种于含5％蔗糖的MRS基础培养基中，在初始培养基pH值为6～8，温度为25～37℃，摇床转速0～170rpm条件下，培养36～72h，得到发酵液；
(2)将发酵液进行低温高速离心，去除菌体，取上清；
(3)将离心去除菌体后的上清用乙醇沉淀，静置，离心，取沉淀，即粗多糖；
(4)将粗多糖进行纯化，得到纯胞外多糖。
步骤(1)中所述初始培养基pH值为6.5，温度为25～37℃，摇床转速0～170rpm条件下，培养36～72h。
步骤(1)中所述初始培养基pH值为6.5，温度为30℃，摇床转速0～170rpm条件下，培养36～72h。
步骤(1)中所述初始培养基pH值为6.5，温度为30℃，摇床转速100rpm条件下，培养36～72h。
步骤(1)中所述初始培养基pH值为6.5，温度为30℃，摇床转速100rpm条件下，培养48h。
步骤(2)所述离心转速为12000rpm，离心时间为30～40min。
步骤(3)所述乙醇百分比浓度为95％～100％，上清液:乙醇体积比为1:3，静置12h，12000rpm离心30～40min。
步骤(4)所述纯化采用凝胶过滤层析对多糖进行纯化。
本发明的有益效果为：本发明通过系列生物化学技术获得菌株发酵产物胞外多糖，采用现代提取技术对发酵液提取纯化获得高纯度多糖。经过系列实验验证，说明所获的菌株具有明串珠菌属的特性，在底物蔗糖的诱导下，可以产生大量胞外多糖。因此，柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21在产糖发酵培养基中发酵而得的发酵液中，含有胞外多糖，具有产糖周期短、产糖量高、安全无毒副作用，且该胞外多糖具有较高的溶解性、乳化性和热稳定性，为工业化应用提供了理论基础和依据，具有广泛的商业化应用前景。
附图说明
图1是柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21菌落形态；
图2是柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21胞外多糖凝胶过滤层析图谱；
图3是柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21纯胞外多糖紫外光谱图；
图4是柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21纯胞外多糖琼脂糖凝胶电泳图；
图5是柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21纯胞外多糖红外光谱图；
图6是柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21纯胞外多糖扫描电镜图；
图7是柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21纯胞外多糖的1H NMR谱图(a)和13C NMR谱图(b)。
具体实施方式
实施例1：一种高产胞外多糖菌株的分离筛选
(1)培养基
MRS基础培养基：葡萄糖20g，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸铵2g，K2HPO4 2g，CH3COONa 5g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，吐温80 1mL，蒸馏水1000mL，pH值6.5，115℃灭菌20min。
MRS产糖发酵培养基：蔗糖50g，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，CH3COONa 5g，柠檬酸铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，吐温80 1mL，蒸馏水1000mL，pH值6.5，115℃灭菌20min。
(2)样品预处理
称取奶豆腐1g加入装有9mL的无菌生理盐水中，制成10-1浓度的样品液，震荡混匀后逐级稀释到适宜浓度，静置备用。
(3)产粘菌落初筛
取上述各稀释度的菌液50μL涂布于产糖培养基琼脂平板中，于37℃恒温培养箱中培养24-48h。挑取平板上产粘的菌落区域，于产糖培养基琼脂平板上反复三区划线，得到纯培养物的平板置于4℃冰箱保存。
(4)菌株复筛
将从平板上得到的纯培养物接种到MRS液体培养基中培养18h，再按2％(v/v)的接种量接种到产糖液体培养基中，于30℃培养48h。取发酵液于90℃水浴中加热10min，除去菌液中可能降解多糖的酶，冷却到室温。向发酵液中加入80％三氯乙酸(TCA)溶液至终浓度为5％(m/v)，室温下搅拌2h，12000×g 4℃离心40min，去除细胞和蛋白沉淀。上清液装入透析袋中(截留分子量14000Da)，4℃冰箱中超纯水透析2d，每8h换一次水。定容后，测定菌株产胞外多糖的产量。结合产粘菌落的粘液浓度，选取多糖产量较高的菌株。
实施例2：一种高产胞外多糖菌株的鉴定
(1)形态学鉴定
将菌株N21接种到MRS琼脂平板上三区划线，30℃培养24-48h后，观察记录菌株在平板上的单菌落特征。用接种针挑取少量新鲜菌体涂布在干净玻片上进行革兰氏染色，然后在显微镜下观察细胞个体形态及排列方式。
(2)生理生化鉴定
①接触酶试验：挑选革兰氏染色结果为阳性的菌株做接触酶试验。
②葡萄糖产酸产气试验：在普通MRS液体培养基中加入1.6％溴甲酚紫2mL/L和倒置的杜氏小管。培养基中的指示剂颜色由紫变黄表示产酸，若还是呈紫色则表示不产酸，杜氏小管中如果有气泡产生则表示能利用葡萄糖产气。
③糖发酵试验：将MRS培养基中的葡萄糖分别换成L-阿拉伯糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖，鼠李糖，再加入1.6％溴甲酚紫2mL/L。若培养基中指示剂变成黄色，表明该菌株能利用该糖产酸，为阳性反应。
(3)16S rDNA序列分析
①细菌基因组DNA的提取
吸取100μL N21菌株菌悬液于灭菌后的MRS液体培养基中，在37℃振荡培养箱中培养24h。按照细菌基因组试剂盒上的操作步骤提取菌株N21的基因组DNA。
②PCR扩增
设计的PCR引物为：
上游引物8F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’
下游引物1492R：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，引物由上海生工生物工程公司合成并送货。
PCR反应条件为：95℃预热3min，95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，循环30次，72℃保持5min，4℃保温。
③琼脂糖凝胶电泳
称取琼脂糖粉末0.2g置于三角瓶中，加入20mL TAE缓冲液配成1.0％的浓度，用微波炉慢慢加热使琼脂糖逐渐全部融化，将其缓慢倒入制胶槽中，插上样品梳后室温静置0.5-1h，使凝胶凝结后慢慢拔出样品梳。将凝胶放入电泳槽中，加入TAE缓冲液，使缓冲液没过凝胶1cm高度。
用移液枪吸取2μL loading buffer置于干净一次性手套上，再吸取5μL PCR扩增产物，反复抽吸混匀，将混合液加到样品槽中。待测样品加样完毕后，在电泳槽一端加入5μLDNA marker。在120V恒电压、80A恒电流下进行电泳，当loading buffer指示剂移动到凝胶底部时，取出凝胶用凝胶成像仪在UV下成像，检查有无条带。
④16S rDNA测序及序列比对
阳性PCR产物送样至上海生工进行测序，将测序结果在NCBI数据库中应用BLAST工具与GenBank数据库已有序列进行比对分析，分析待测菌株与已知菌株相应序列的同源性，确定筛选出来的产糖菌株种属。
实施例3：一种高产胞外多糖菌株发酵产胞外多糖的发酵工艺
本实施例一种高产胞外多糖菌株发酵产胞外多糖的发酵工艺，按以下步骤进行：
(1)制备种子液
将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21接种于基础MRS培养基中，使培养基中初始细胞浓度为1.0×108个/mL，即为种子液。
(2)产糖发酵条件
将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21以2.0％(V/V)的接种量，接种于初始pH值为6-8的100/250mL培养基中，在25-37℃的温度下恒温振荡培养36-72h，利用苯酚硫酸法测定发酵上清液多糖含量。
在初始pH值为6.5、温度为30℃、摇床转速100rpm条件下，培养48h，得到发酵液，对发酵液进行提取，获得胞外多糖。本实施例获得的发酵液中获得胞外多糖的含量为24.36±1.84g/L。
实施例4：一种高产胞外多糖菌株发酵产胞外多糖的分离纯化工艺
(1)粗多糖制备
将活化好的柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21菌液按2％(v/v)的接种量接种到产糖发酵培养基中，30℃，120rpm培养48h得到胞外多糖发酵液。将500mL发酵液4℃，12000rpm离心40min，除去菌体。上清液加入3倍体积的预冷95％乙醇，4℃孵化过夜以沉淀多糖。4℃，12000rpm离心50min收集多糖沉淀，用250mL 超纯水30～40℃溶解多糖沉淀，加入250mL(与溶解多糖所用的超纯水等体积)10％三氯乙酸溶液除去蛋白，4℃静置10h，4℃，12000rpm离心40min收集上清液。加入3倍体积的预冷95％乙醇，4℃孵化过夜以沉淀多糖。4℃，12000rpm离心40min收集多糖沉淀，重溶于超纯水中(大约200mL)，装入透析袋(截留分子量14000Da)中，4℃蒸馏水透析2d，每8h换一次水。最终得到粗多糖的水溶液，4℃冰箱保存。
(2)多糖纯化
取上述粗多糖的水溶液直接或先适度稀释后进行凝胶过滤层析，合并收集管多糖溶液，冷冻干燥24h，得到纯多糖，利用苯酚硫酸法测定纯化胞外多糖含量。
(3)多糖纯度鉴定
①紫外-可见光谱法纯度分析
准确称取纯化后的多糖5mg，溶于5mL超纯水中，制成1mg/mL的多糖溶液，用紫外可见光谱仪于190-350nm波段进行紫外扫描，检测多糖纯度。
②琼脂糖凝胶电泳
称取纯多糖样品2mg溶于0.2mL去离子水中配制成10mg/mL的溶液。以1％琼脂糖溶液制成胶，电极缓冲液用TAE缓冲液，电压为120V，电泳加样量为7μL样品混合2μLLoadingBuffer，电泳时间为20min。电泳停止后，将胶转移至透明容器中，慢慢倒入0.1％的甲苯胺蓝溶液没过凝胶，静置染色10min，再用脱色液清洗三四次，然后用去离子水反复浸泡至凝胶背景接近无色，观察拍照保存。
本实施例获得的发酵液中获得的胞外多糖是均一的多糖组分，无蛋白及核酸污染，纯度高。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种高产直链葡聚糖菌株及其葡聚糖发酵生产方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1409
<212> DNA
<213> 柠檬明串珠菌N21(Leuconstoc citreumN21)
<400> 1
gcagtcgaac gcgcagcgag aggtgcttgc acctttcaag cgagtggcga acgggtgagt 60
aacacgtgga taacctgcct caaggctggg gataacattt ggaaacagat gctaataccg 120
aataaaactt agtatcgcat gatatcaagt taaaaggcgc tacggcgtca cctagagatg 180
gatccgcggt gcattagtta gttggtgggg taaaggctta ccaagacaat gatgcatagc 240
cgagttgaga gactgatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag 300
gctgcagtag ggaatcttcc acaatgggcg caagcctgat ggagcaacgc cgcgtgtgtg 360
atgaaggctt tcgggtcgta aagcactgtt gtatgggaag aaatgctaaa atagggaatg 420
attttagttt gacggtacca taccagaaag ggacggctaa atacgtgcca gcagccgcgg 480
taatacgtat gtcccgagcg ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcagacggtt 540
gattaagtct gatgtgaaag cccggagctc aactccggaa tggcattgga aactggttaa 600
cttgagtgtt gtagaggtaa gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg 660
gaagaacacc agtggcgaag gcggcttact ggacaacaac tgacgttgag gctcgaaagt 720
gtgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccacac cgtaaacgat gaatactagg 780
tgttaggagg tttccgcctc ttagtgccga agctaacgca ttaagtattc cgcctgggga 840
gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag cggtggagca 900
tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tttgaagctt 960
ttagagatag aagtgttctc ttcggagaca aagtgacagg tggtgcatgg tcgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc 1080
cagcattcag ttgggcactc tagcgagact gccggtgaca aaccggagga aggcggggac 1140
gacgtcagat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggcgtatac 1200
aacgagttgc caacctgcga aggtgagcta atctcttaaa gtacgtctca gttcggactg 1260
cagtctgcaa ctcgactgca cgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc 1320
ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tttgtaatgc 1380
ccaaagccgg tggcctaacc ttcgggagg 1409

Claims (9)

1.一种高产直链葡聚糖菌株，其为柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21，已于2017年12月4日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15015。
2.一种高产直链葡聚糖的发酵生产方法，其特征在于，采取如权利要求1所述的高产直链葡聚糖菌株，包括以下步骤：
(1)将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21接种于含5％蔗糖的MRS基础培养基中，在初始培养基pH值为6～8，温度为25～37℃，摇床转速0～170rpm条件下，培养36～72h，得到发酵液；
(2)将发酵液进行低温高速离心，去除菌体，取上清；
(3)将离心去除菌体后的上清用乙醇沉淀，静置，离心，取沉淀，即粗多糖；
(4)将粗多糖进行纯化，得到纯胞外多糖。
3.根据权利要求2所述的一种产胞外多糖菌株的多糖发酵生产方法，其特征在于步骤(1)中所述初始培养基pH值为6.5，温度为25～37℃，摇床转速0～170rpm条件下，培养36～72h。
4.根据权利要求2所述的一种产胞外多糖菌株的多糖发酵生产方法，其特征在于步骤(1)中所述初始培养基pH值为6.5，温度为30℃，摇床转速0～170rpm条件下，培养36～72h。
5.根据权利要求2所述的一种产胞外多糖菌株的多糖发酵生产方法，其特征在于步骤(1)中所述初始培养基pH值为6.5，温度为30℃，摇床转速100rpm条件下，培养36～72h。
6.根据权利要求2所述的一种产胞外多糖菌株的多糖发酵生产方法，其特征在于步骤(1)中所述初始培养基pH值为6.5，温度为30℃，摇床转速100rpm条件下，培养48h。
7.根据权利要求2所述的一种产胞外多糖菌株的多糖发酵生产方法，其特征在于步骤(2)所述离心转速为12000rpm，离心时间为30～40min。
8.根据权利要求2所述的一种产胞外多糖菌株的多糖发酵生产方法，其特征在于步骤(3)所述所述乙醇百分比浓度为95％～100％，上清液:乙醇体积比为1:3，静置12h，12000rpm离心30～40min。
9.根据权利要求2所述的一种产胞外多糖菌株的多糖发酵生产方法，其特征在于步骤(4)所述纯化采用凝胶过滤层析对多糖进行纯化。
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