CN113430185A - 一种乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

一种乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法，涉及一种蛋白酶的分离纯化方法。乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法：一、将柠檬明串珠菌N21接种于MRS液体培养基；再将种子液接种于产酶液体培养基发酵；二、将发酵液离心，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；三、粗酶液中加入硫酸铵并连续搅拌，再将沉淀溶于去离子水中透析；四、用DEAE‑sepharose FF阴离子交换层析和Sepadex G75分子筛层析纯化浓缩，超滤浓缩，之后冷冻干燥，得到固态葡聚糖蔗糖酶。本发明葡聚糖蔗糖酶分子量为170kDa，体外最适反应温度为30℃、最适pH值为5.5。金属离子K+、Na+、Ca2+和Tween 80对本发明获得的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶具有促进作用，Zn2+、Hg+、Cu2+和Fe3+对本发明获得的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶有抑制作用。

Description

一种乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白酶的分离纯化方法。
背景技术
葡聚糖蔗糖酶(Glucansucrase)亦称蔗糖-6-葡萄糖基转移酶，是一种糖苷转移酶(Glucosyltransferase)，主要由明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)及乳杆菌属(Lactobacillus)细菌产生的高分子量胞外酶，其大小在120～200kDa之间。能以蔗糖为受体底物，合成多种α-葡聚多糖，如葡聚糖(glucan)、变聚糖或者交换葡聚糖。葡聚糖在医疗、食品和生化制剂等方面有广泛的用途，与植物多糖相比，这种微生物胞外多糖具有独特而优良的特性，它在食品工业中可作为增稠剂、稳定剂、粘合剂、填充剂及抗结晶剂。
不同来源的葡聚糖蔗糖酶以蔗糖为底物催化反应后生产的产物结构通常是不同的。肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroids)NRRLB-512生成的葡聚糖的α-1,6-糖苷键含量在95％左右。而肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroids)NRRLB-1355菌株生成葡聚糖主要由α-1,3-糖苷键连接而成。
在化工生产中，生物酶发挥着愈来愈重要的作用，但是目前国内对葡聚糖蔗糖酶的研究较少，而国际上对葡聚糖蔗糖酶的研究则较为深入。目前生产乳酸菌葡聚糖的方法主要有两种，即发酵法与酶合成法。尽管存在许多问题，人们还是对它做了大量的研究并分离纯化得到葡聚糖蔗糖酶，并对其性质进行了研究。在国内，有关其生物合成的研究主要集中于发酵菌种、发酵条件及酶催化条件等方面，涉及其生物合成酶的研究甚乏。
发明内容
本发明提供了一种乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法，该方法简单有效，乳酸菌葡聚糖蔗糖酶产率及纯度高。
乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法：
一、将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21活化接种于MRS液体培养基、在30±1℃、静止培养18±0.5h，得到种子液；再将种子液按1％(V/V)的接种量接种于产酶液体培养基中，在30±1℃、静止培养20±1h，得到发酵液；
二、将发酵液离心，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；
三、在4℃条件下向葡聚糖蔗糖酶粗酶液中加入硫酸铵并连续搅拌，沉淀酶蛋白；将沉淀的酶蛋白溶于去离子水中再装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，在4℃条件下透析，之后用5～8kDa超滤浓缩管浓缩酶蛋白溶液；
四、用DEAE-sepharose FF阴离子交换层析，然后合并阴离子交换层析液用5～8kDa超滤浓缩管浓缩，之后再用Sepadex G75分子筛层析纯化浓缩，然后合并分子筛层析液用5～8kDa超滤浓缩管进一步浓缩，之后冷冻干燥，得到固态葡聚糖蔗糖酶；
其中，步骤一产酶液体培养基中蔗糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K2HPO4的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO4·7H2O的浓度为0.58g/L、MnSO4·4H2O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，产酶液体培养基pH值为6。
本发明方法步骤一得到的发酵液呈粘稠状，步骤二发酵液经离心去除菌体后，上清变澄清，但粘度依然较高，为葡聚糖蔗糖酶粗酶液。利用DNS法测定步骤二葡聚糖蔗糖酶粗酶液中葡聚糖蔗糖酶的活性为5.23U/mL。
本发明步骤三所述沉淀酶蛋白中葡聚糖蔗糖酶的活性为97U/mL；步骤三透析液用超滤浓缩管将体积浓缩为原体积的1/10，上述浓缩液中葡聚糖蔗糖酶的活性为74U/mL。
本发明方法获得的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶为白色固体粉末。
本发明使我们更加深入了解乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的催化作用，不仅可以为体外定向改造葡聚糖糖提供基础，还可以进一步揭示葡聚糖蔗糖酶的作用机制。本发明方法步骤简洁，成本低，酶纯化效果好，回收效率高，易于扩大化，为大规模制备葡聚糖蔗糖酶奠定了重要基础。
本发明获得的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶在体外生成的葡聚糖主要是以α-1,3-糖苷键连接而成。本发明葡聚糖蔗糖酶分子量为170kDa，体外最适反应温度为30℃、最适pH值为5.5。金属离子K+、Na+、Ca2+和Tween 80对本发明获得的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶具有促进作用，Zn2+、Hg+、Cu2+和Fe3+对本发明获得的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶有抑制作用。
本发明方法获得的葡聚糖蔗糖酶产率及纯度高，该葡聚糖蔗糖酶可高效水解蔗糖来生产高纯度的葡聚糖。
附图说明
图1是实施例2中乳酸菌葡聚糖蔗糖酶在不同作用温度条件下的酶活力曲线图；
图2是实施例2中乳酸菌葡聚糖蔗糖酶在不同作用pH值条件下的酶活力曲线图；
图3是实施例2中不同金属离子对乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的酶活性影响结果；
图4是实施例2中表面活性剂及抑制剂对乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的酶活性影响结果；
图5实施例3中乳酸菌葡聚糖蔗糖酶体外合成葡聚糖的效果对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式一：本实施方式乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法：
一、将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21活化接种于MRS液体培养基、在30±1℃、静止培养18±0.5h，得到种子液；再将种子液按1％(V/V)的接种量接种于产酶液体培养基中，在30±1℃、静止培养20±1h，得到发酵液；
二、将发酵液离心，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；
三、在4℃条件下向葡聚糖蔗糖酶粗酶液中加入硫酸铵并连续搅拌，沉淀酶蛋白；将沉淀的酶蛋白溶于去离子水中再装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，在4℃条件下透析，之后用5～8kDa超滤浓缩管浓缩酶蛋白溶液；
四、用DEAE-sepharose FF阴离子交换层析，然后合并阴离子交换层析液用5～8kDa超滤浓缩管浓缩，之后再用Sepadex G75分子筛层析纯化浓缩，然后合并分子筛层析液用5～8kDa超滤浓缩管进一步浓缩，之后冷冻干燥，得到固态葡聚糖蔗糖酶；
其中，步骤一产酶液体培养基中蔗糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K2HPO4的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO4·7H2O的浓度为0.58g/L、MnSO4·4H2O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，产酶液体培养基pH值为6。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于：步骤三加入的硫酸铵浓度为65％；连续搅拌时间为6h。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点在于：步骤二在4℃、10000rpm条件下离心20min。其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同点在于：步骤四中所述DEAE-sepharose FF阴离子交换层析中用浓度为10mM、pH 5.5的NaAc缓冲液平衡柱，之后用0.6M、pH 5.5的NaAc缓冲液作为洗脱剂洗脱蛋白。其他步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
本实施方式中合并DEAE-sepharose FF阴离子交换层析液用超滤浓缩管将体积浓缩为原体积的1/10，上述浓缩液中葡聚糖蔗糖酶的活性为90U/mL。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点在于：步骤四中所述Sepadex G75分子筛层析用浓度为10mM、pH 5.5的NaAc缓冲液平衡柱，之后用浓度为0.6M、pH 5.5的NaAc缓冲液作为洗脱剂洗脱蛋白。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
本实施方式合并Sepadex G75分子筛层析液用超滤浓缩管将体积浓缩为原体积的1/6，上述浓缩液中葡聚糖蔗糖酶的活性为83U/mL，比活力为326.22U/mg，纯化倍数为12.34倍。
实施例1：
一、将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21活化接种于MRS液体培养基、在30℃、静止培养18h，得到种子液；再将种子液按1％(V/V)的接种量接种于产酶液体培养基中，在30℃、静止培养20h，得到发酵液；
二、将发酵液在4℃、10000rpm条件下离心20min，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；
三、在4℃条件下向葡聚糖蔗糖酶粗酶液中加入浓度为65％的硫酸铵并连续搅拌6h，沉淀酶蛋白；将沉淀的酶蛋白溶于去离子水中再装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，在4℃条件下透析18h，期间每隔4h换水一次，之后用5～8kDa超滤浓缩管浓缩酶蛋白溶液；
四、用DEAE-sepharose FF阴离子交换层析，然后合并阴离子交换层析液用5～8kDa超滤浓缩管浓缩，之后再用Sepadex G75分子筛层析纯化浓缩，然后合并分子筛层析液用5～8kDa超滤浓缩管进一步浓缩，之后冷冻干燥，得到固态葡聚糖蔗糖酶；
其中，步骤一产酶液体培养基中蔗糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K2HPO4的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO4·7H2O的浓度为0.58g/L、MnSO4·4H2O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，产酶液体培养基pH值为6；
步骤四中所述DEAE-sepharose FF阴离子交换层析中用浓度为10mM、pH 5.5的NaAc缓冲液平衡柱，之后用0.6M、pH 5.5的NaAc缓冲液作为洗脱剂洗脱蛋白；
步骤四中所述Sepadex G75分子筛层析用浓度为10mM、pH 5.5的NaAc缓冲液平衡柱，之后用浓度为0.6M、pH 5.5的NaAc缓冲液作为洗脱剂洗脱蛋白。
MRS液体培养基成分：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉浸粉10g/L，酵母浸粉5g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸铵2g/L，无水乙酸钠5g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O0.25g/L，吐温80 1mL/L，pH 6。
利用DNS法测定本实施例获得的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶，其酶活性为83U/mL，比活力为326.22U/mg，纯化倍数为12.34倍。用分离胶浓度为7.5％，浓缩胶浓度为4％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行纯度及分子量鉴定，检测结果显示为单一条带，分子量大小约为170kDa，本实施例得到的组分均为葡聚糖蔗糖酶。
实施例2：
实施例1制备的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的酶学性质
首先取2mL 10U/mL实施例1制备的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶，探究作用温度(20、30、40、50、60℃)和作用pH值(4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5)对酶活力的影响。
其次取2mL 20U/mL实施例1制备的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶与2mL 5mM不同金属离子(K+、Na+、Hg+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+)混合，30℃条件下反应30min后，探究金属离子对酶活的作用。
取2mL 20U/mL实施例1制备的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶与2mL 1mM不同的表面活性剂(SDS、Tween 80、EDTA、β-ME、Triton X-100、PMSF)混合，30℃条件下反应30min后，探究表面活性剂或抑制剂对酶活的作用。
实验结果如图1～5所示，本发明乳酸菌葡聚糖蔗糖酶最适作用温度和pH分别是30℃和pH 5.5。Ca2+对本发明乳酸菌葡聚糖蔗糖酶有显著促进作用，K+、Na+、Zn2+对本发明乳酸菌葡聚糖蔗糖酶有较弱的促进作用，Hg+、Cu2+、Fe3+对本发明乳酸菌葡聚糖蔗糖酶有较强的抑制作用。SDS、EDTA、β-ME、PMSF和Triton X-100对本发明乳酸菌葡聚糖蔗糖酶有抑制作用，Tween 80对本发明乳酸菌葡聚糖蔗糖酶有促进作用。
实施例3：
实施例1制备的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶体外合成葡聚糖：
1)合成葡聚糖
取2mL 8U/mL实施例1制备的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶与100mL 100g/L蔗糖混合，并加入2mM CaCl2，在pH值为5.5，静止的条件下，30℃孵育8h。
2)葡聚糖纯化
反应结束后，将合成的葡聚糖产物在80℃水浴中孵育30min，灭活酶活。之后将反应物在室温条件下10000r/min，离心20min，去除蛋白质。向离心后的反应液中加入三倍体积的预冷的95％乙醇，4℃静置过夜后，10000r/min，离心40min得到葡聚糖沉淀。将葡聚糖沉淀溶于去离子水中，得到纯葡聚糖样品。利用苯酚硫酸法测定葡聚糖的催化合成效率。
本实施例柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21葡聚糖蔗糖酶可以催化蔗糖合成葡聚糖，底物的摩尔转化率达95％。

Claims (5)

1.一种乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法，其特征在于乳酸菌葡聚糖蔗糖酶按以下步骤分离纯化：
一、将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)N21活化接种于MRS液体培养基、在30±1℃、静止培养18±0.5h，得到种子液；再将种子液按1％(V/V)的接种量接种于产酶液体培养基中，在30±1℃、静止培养20±1h，得到发酵液；
二、将发酵液离心，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；
三、在4℃条件下向葡聚糖蔗糖酶粗酶液中加入硫酸铵并连续搅拌，沉淀酶蛋白；将沉淀的酶蛋白溶于去离子水中再装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，在4℃条件下透析，之后用5～8kDa超滤浓缩管浓缩酶蛋白溶液；
四、用DEAE-sepharose FF阴离子交换层析，然后合并阴离子交换层析液用5～8kDa超滤浓缩管浓缩，之后再用Sepadex G75分子筛层析纯化浓缩，然后合并分子筛层析液用5～8kDa超滤浓缩管进一步浓缩，之后冷冻干燥，得到固态葡聚糖蔗糖酶；
其中，步骤一产酶液体培养基中蔗糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K2HPO4的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO4·7H2O的浓度为0.58g/L、MnSO4·4H2O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，产酶液体培养基pH值为6。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法，其特征在于步骤三加入的硫酸铵浓度为65％；连续搅拌时间为6h。
3.根据权利要求1所述的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法，其特征在于步骤二在4℃、10000rpm条件下离心20min。
4.根据权利要求1所述的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法，其特征在于步骤四中所述DEAE-sepharose FF阴离子交换层析中用浓度为10mM、pH 5.5的NaAc缓冲液平衡柱，之后用0.6M、pH 5.5的NaAc缓冲液作为洗脱剂洗脱蛋白。
5.根据权利要求1所述的乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的分离纯化方法，其特征在于步骤四中所述Sepadex G75分子筛层析用浓度为10mM、pH 5.5的NaAc缓冲液平衡柱，之后用浓度为0.6M、pH 5.5的NaAc缓冲液作为洗脱剂洗脱蛋白。
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