CN113584101A - 一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法 - Google Patents
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Abstract
一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，涉及一种蛋白酶体外合成胞外多糖方法。体外合成胞外多糖方法：一、将柠檬明串珠菌接种于产酶液体培养基中发酵；二、将发酵液离心，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；三、葡聚糖蔗糖酶粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、浓缩和层析纯化，得到葡聚糖蔗糖酶纯酶液；四、用葡聚糖蔗糖酶纯酶液体外催化蔗糖合成胞外多糖。本发明方法通过系列生物化学技术获得葡聚糖蔗糖酶，经合成、提取技术纯化获得高纯度多糖。本发明方法中葡聚糖蔗糖酶在底物蔗糖的诱导下，产生大量胞外多糖；具有产糖周期短、产糖量高、纯度高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白酶体外合成胞外多糖方法。
背景技术
多糖(polysaccharides)是由多个单糖分子经脱水、缩合，由糖苷键连接成的天然高分子聚合物，它广泛存在于高等植物、真菌、藻类、细菌及动物体细胞中，是构成生命的四大基本物质之一。胞外多糖(EPS，exopolysaccharides)作为微生物生长过程中代谢的长链多糖，由重复单元的糖或糖的衍生物、不同比例葡萄糖、半乳糖及鼠李糖组成。研究发现微生物胞外多糖对心脑血管、肿瘤和急慢性炎症等疾病具有预防和治疗作用，在调节免疫、降血压、降血糖、降低胆固醇和甘油三酯，抗肿瘤、抗炎、抗血小板凝集、抗氧化及抗衰老等方面具有独特的生物活性，而且毒副作用低。此外，胞外多糖所特有的流变学特性，使其可作为增稠剂、稳定剂、胶凝剂、乳化剂等广泛应用在食品行业、医药行业及化工行业。
葡聚糖蔗糖酶(dextransucrase或glucosyltransferase)是一种由乳酸菌、某些酵母菌及枯草芽孢杆菌等微生物发酵产生的胞外糖基转移酶，能以蔗糖为受体底物、在无其它物质参与反应时生成EPSs；当有可识别的外源受体存在时，也能将葡糖基转移给外源受体而生产各种糖基化产物。因葡聚糖蔗糖酶反应的特异性、产物的多样性以及对于产物合成的可操作性而使其成为生物催化合成中一种重要的工具酶。目前国内外有许多产EPSs的微生物被分离出来，对EPSs也做了大量的研究，其许多生物活性也被发现。不同微生物生产EPSs的能力不同，产量普遍较低等，这些都限制了EPSs的应用，因此利用葡聚糖蔗糖酶体外合成EPSs不仅可以提高EPSs的产量，还可以简化分离纯化手段，提高提取率，为定向改造EPSs提供前提基础，为开发功能性EPSs提供理论依据。
发明内容
本发明提供了一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，该方法操作简便，具有胞外多糖产量高、纯度高等优点。
葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法：
一、将柠檬明串珠菌接种于产酶液体培养基中，在30±1℃、静止培养20±1h，得到发酵液；
二、将发酵液离心，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；
三、葡聚糖蔗糖酶粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、浓缩和层析纯化，得到葡聚糖蔗糖酶纯酶液；
四、用葡聚糖蔗糖酶纯酶液体外催化蔗糖合成胞外多糖；
其中，步骤一产酶液体培养基中蔗糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K2HPO4的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO4·7H2O的浓度为0.58g/L、MnSO4·4H2O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，产酶液体培养基pH值为5.5；
步骤四体外催化反应体系中蔗糖浓度为40～160g/L、葡聚糖蔗糖酶的添加量为1～10U/mL、CaCl2的添加量为0～6mM；体外催化反应温度为30℃、pH为5.0～7.0、摇床转速为0～200rpm，反应时间1～10h。
本发明方法通过系列生物化学技术获得葡聚糖蔗糖酶，经合成、提取技术纯化获得高纯度多糖。本发明方法中葡聚糖蔗糖酶在底物蔗糖的诱导下，产生大量胞外多糖；具有产糖周期短、产糖量高、纯度高的优点。
附图说明
图1是实施例1葡聚糖蔗糖酶体外合成的胞外多糖；
图2是实施例1制备的胞外多糖紫外光谱图；
图3是实施例3葡聚糖蔗糖酶加入不同蔗糖浓度的无菌蔗糖-脱脂牛奶中孵育后的凝结效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式一：本实施方式葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法：
一、将柠檬明串珠菌接种于产酶液体培养基中，在30±1℃、静止培养20±1h，得到发酵液；
二、将发酵液离心，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；
三、葡聚糖蔗糖酶粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、浓缩和层析纯化，得到葡聚糖蔗糖酶纯酶液；
四、用葡聚糖蔗糖酶纯酶液体外催化蔗糖合成胞外多糖；
其中，步骤一产酶液体培养基中蔗糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K2HPO4的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO4·7H2O的浓度为0.58g/L、MnSO4·4H2O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，产酶液体培养基pH值为5.5；
步骤四体外催化反应体系中蔗糖浓度为40～160g/L、葡聚糖蔗糖酶的添加量为1～10U/mL、CaCl2的添加量为0～6mM；体外催化反应温度为30℃、pH为5.0～7.0、摇床转速为0～200rpm，反应时间1～10h。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于：步骤一所述柠檬明串珠菌为柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)B-2；柠檬明串珠菌的接种量为1％(V/V)。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
接种1％的柠檬明串珠菌种子液，柠檬明串珠菌种子液中葡萄糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K2HPO4的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO4·7H2O的浓度为0.58g/L、MnSO4·4H2O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，pH为6。柠檬明串珠菌种子液中初始柠檬明串珠菌浓度为1.0×108个/mL。
柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)B-2中的葡聚糖蔗糖酶能够以蔗糖为底物高效催化合成胞外多糖。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点在于：步骤四中体外催化反应体系中蔗糖浓度为100g/L、葡聚糖蔗糖酶的添加量为8U/mL、CaCl2的添加量为3mM；体外催化反应温度为30℃、pH为5.5、摇床转速为80rpm，反应时间6h。其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同点在于：步骤二在4℃、8000rpm条件下离心20min。其他步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点在于：步骤三向葡聚糖蔗糖酶粗酶液中加入硫酸铵，硫酸铵终浓度为55％(W/V)，之后将粗酶液装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中、4℃条件下透析24h；然后用聚乙二醇浓缩，浓缩液再用DEAE-sepharose FF阴离子交换层析和Sepadex G75分子筛层析纯化。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点在于：对外催化蔗糖合成的胞外多糖进行纯化：步骤四合成的胞外多糖用三氯乙酸去蛋白，再用乙醇沉淀多糖，之后进行透析，既得到纯胞外多糖。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
实施例1
葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法：
一、将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)B-2接种于产酶液体培养基中，柠檬明串珠菌的接种1％(V/V)柠檬明串珠菌种子液，在30℃、静止培养20h，得到发酵液；
二、将发酵液在4℃、8000rpm条件下离心20min，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；
三、葡聚糖蔗糖酶粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、浓缩和层析纯化，得到葡聚糖蔗糖酶纯酶液；
四、用葡聚糖蔗糖酶纯酶液体外催化蔗糖合成胞外多糖；
五、对外催化蔗糖合成的胞外多糖进行纯化：步骤四合成的胞外多糖用三氯乙酸去蛋白，再用乙醇沉淀多糖，之后进行透析，既得到纯胞外多糖；
其中，步骤一产酶液体培养基中蔗糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K2HPO4的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO4·7H2O的浓度为0.58g/L、MnSO4·4H2O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，产酶液体培养基pH值为5.5；
步骤四体外催化反应体系中蔗糖浓度为100g/L、葡聚糖蔗糖酶的添加量为8U/mL、CaCl2的添加量为3mM；体外催化反应温度为30℃、pH为5.5、摇床转速为80rpm，反应时间6h；
步骤五、将步骤四合成的胞外多糖产物在80℃水浴中孵育30min，灭活未反应的葡聚糖蔗糖酶；之后向产物中加入等体积的浓度为10％(w/v)的三氯乙酸，于4℃环境下连续搅拌4h，在4℃、12000rpm离心，去除蛋白质；向离心后的上清液中加入三倍体积的预冷的95％乙醇，4℃静置过夜，然后4℃、12000rpm离心得到胞外多糖沉淀；将胞外多糖沉淀溶于去离子水中，装入截留分子量为14000Da的透析袋中透析2d，每隔6h换一次水，得到纯胞外多糖。
本实施例所述柠檬明串珠菌种子液中葡萄糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K2HPO4的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO4·7H2O的浓度为0.58g/L、MnSO4·4H2O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，pH为6。柠檬明串珠菌种子液中初始柠檬明串珠菌浓度为1.0×108个/mL。
本实施例步骤三向葡聚糖蔗糖酶粗酶液中加入硫酸铵，硫酸铵终浓度为55％(W/V)，之后将粗酶液装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中、4℃条件下透析24h；然后用聚乙二醇浓缩，浓缩液再用DEAE-sepharose FF阴离子交换层析和Sepadex G75分子筛层析纯化。
利用DNS法测定本实施例得到的葡聚糖蔗糖酶纯酶液的活性为80U/mL。利用紫外可见分光光度计在190-350nm波长范围内进行扫描，本实施例所合成的胞外多糖纯度高，无核酸和蛋白污染。
利用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，本实施例获得的胞外多糖中未检测出蛋白；利用苯酚硫酸法测定胞外多糖含量，摩尔转化率达94％。
实施例2
采用本发明的方法，对不同工艺条件进行优化：
1)产糖条件优化
将纯化后的葡聚糖蔗糖酶(终浓度5U/mL)与蔗糖(终浓度80g/L)混合，配置不同pH值的缓冲液，使反应分别在pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的条件下，30℃，静止孵育5h。利用苯酚硫酸法测定混合液中胞外多糖含量，确定最佳反应pH值为5.5。
将不同浓度纯化后的葡聚糖蔗糖酶(终浓度1、2、3、4、5、6、7、8、9和10U/mL)与蔗糖(终浓度80g/L)混合，在pH值为5.5的条件下，30℃，静止孵育5h。利用苯酚硫酸法测定混合液中胞外多糖含量，确定最佳葡聚糖蔗糖酶加入量为8U/mL。
将纯化后的葡聚糖蔗糖酶(终浓度8U/mL)与不同浓度蔗糖(终浓度40、60、80、100、120、140、160g/L)混合，在pH值为5.5的条件下，30℃，静止孵育5h。利用苯酚硫酸法测定混合液中胞外多糖含量，确定最佳蔗糖加入量为100g/L。
向上述反应液中加入不同浓度CaCl2(0、1、2、3、4、5和6mM)，在pH值为5.5的条件下，30℃，静止孵育5h。利用苯酚硫酸法测定混合液中胞外多糖含量，确定最佳CaCl2添加量为3mM。
将纯化后的葡聚糖蔗糖酶(终浓度8U/mL)与浓度蔗糖(终浓度100g/L)混合，加入CaCl2(终浓度3mM)，在pH值为5.5，在0、40、80、120、160、200rpm条件下，30℃孵育5h。利用苯酚硫酸法测定混合液中胞外多糖含量，确定最佳培养转速为80rpm。
将纯化后的葡聚糖蔗糖酶(终浓度8U/mL)与浓度蔗糖(终浓度100g/L)混合，加入CaCl2(终浓度3mM)，在pH值为5.5，80rpm的条件下，30℃分别孵育1、2、3、4、5、6、7、8、9和10h。利用苯酚硫酸法测定混合液中胞外多糖含量，确定最佳孵育时间为6h。
实施例3：葡聚糖蔗糖酶促进牛奶凝结
本实施例一种葡聚糖蔗糖酶促进牛奶凝结工艺，按以下步骤进行：
取实施例1中纯化后的葡聚糖蔗糖酶(终浓度100mU/mL)，加入到5mL不同浓度无菌蔗糖-脱脂牛奶(蔗糖终浓度分别为3和9％(w/v))中，30℃静止孵育3h，观察脱脂牛奶的凝结情况(如图3所示)。
本实施例获得的葡聚糖蔗糖酶可以催化蔗糖生成胞外多糖，从而使脱脂牛奶凝结，随着蔗糖浓度越高，所生成的胞外多糖越多，凝固效果越好。
Claims (6)
1.一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖按以下步骤实现：
一、将柠檬明串珠菌接种于产酶液体培养基中，在30±1℃、静止培养20±1h，得到发酵液；
二、将发酵液离心，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；
三、葡聚糖蔗糖酶粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、浓缩和层析纯化，得到葡聚糖蔗糖酶纯酶液；
四、用葡聚糖蔗糖酶纯酶液体外催化蔗糖合成胞外多糖；
其中，步骤一产酶液体培养基中蔗糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K2HPO4的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO4·7H2O的浓度为0.58g/L、MnSO4·4H2O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，产酶液体培养基pH值为5.5；
步骤四体外催化反应体系中蔗糖浓度为40～160g/L、葡聚糖蔗糖酶的添加量为1～10U/mL、CaCl2的添加量为0～6mM；体外催化反应温度为30℃、pH为5.0～7.0、摇床转速为0～200rpm，反应时间1～10h。
2.根据权利要求1所述的一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于步骤一所述柠檬明串珠菌为柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)B-2；柠檬明串珠菌的接种量为1％(V/V)。
3.根据权利要求1或2所述的一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于步骤四中体外催化反应体系中蔗糖浓度为100g/L、葡聚糖蔗糖酶的添加量为8U/mL、CaCl2的添加量为3mM；体外催化反应温度为30℃、pH为5.5、摇床转速为80rpm，反应时间6h。
4.根据权利要求1所述的一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于步骤二在4℃、8000rpm条件下离心20min。
5.根据权利要求1所述的一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于步骤三向葡聚糖蔗糖酶粗酶液中加入硫酸铵，硫酸铵终浓度为55％(W/V)，之后将粗酶液装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中、4℃条件下透析24h；然后用聚乙二醇浓缩，浓缩液再用DEAE-sepharose FF阴离子交换层析和Sepadex G75分子筛层析纯化。
6.根据权利要求1所述的一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于对外催化蔗糖合成的胞外多糖进行纯化：步骤四合成的胞外多糖用三氯乙酸去蛋白，再用乙醇沉淀多糖，之后进行透析，既得到纯胞外多糖。
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