CN118028400A - 一种以甘蔗汁为原料发酵制备右旋糖酐和果糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以甘蔗汁为原料发酵制备右旋糖酐和果糖的方法，涉及右旋糖酐和果糖的制备方法，具体是将肠膜状明串珠菌接种到含有甘蔗汁的发酵培养基，经发酵培养得到发酵液和分离纯化制得到右旋糖酐和果糖。本发明方法直接以廉价的甘蔗汁为原料底物，甘蔗汁中蔗糖成分利用率高，省去了传统制备白砂糖的复杂工艺，其工艺流程简单，从而大大降低了右旋糖酐和果糖生产成本，具有省时、省力的优点。

Description

一种以甘蔗汁为原料发酵制备右旋糖酐和果糖的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种以甘蔗汁为原料通过肠膜状明串珠菌发酵制备右旋糖酐和果糖的方法。

背景技术

右旋糖酐(Dextran)，又称葡聚糖（Glucan）、右旋糖苷、右聚糖、多聚葡萄糖，它是一种以α-D-1，6糖苷键为主链连接而成的葡萄糖多合物，同时有少量α-1,2、α-1,3、α-1,4-糖苷键组成的分支结构。右旋糖酐分子量和结构的不同因而具有各自不同的生物学功能。如临床应用的右旋糖酐T20、T40、T70是一种优良的血容量补充药，也是生产补血药右旋糖酐铁的重要原料。右旋糖酐T20是良好的药物载体，可制备右旋糖酐铁等衍生物。右旋糖酐T40是目前公认的血浆代替品，也可用于治疗失血性休克，改善血液循环，改善微循环抗血栓等。右旋糖酐由于质地疏松柔软，具有安全无毒、无臭无味、黏性高、生物相容性好及持水性强等优点，广泛用于医药、制药、食品、化工、农牧业和色谱分析等多个领域。

目前，工业化制备右旋糖酐通常是以发酵法或酶法为主要手段，其本质上都是以白砂糖（即白糖、精制蔗糖）为出发原料，在右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase，EC 2 .4 .1.5)的催化作用下，将白砂糖中的蔗糖分子中果糖基切断，即同时生成等摩尔量的果糖（Fructose），并把葡萄糖基通过α-D-1，6糖苷键连接聚合而成的葡萄糖多合物（即右旋糖酐），在其制备过程中可通过改变工艺条件来制备不同分子量的右旋糖酐产品，以满足右旋糖酐的不同应用需求。肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、口腔链球菌（Oral streptococcus）、乳酸明串珠菌(Leuconostoc lactis)、大蒜明串珠菌（Leuconostoc garlicum）等是产生右旋糖酐蔗糖酶的天然菌种，可以通过这些菌种发酵蔗糖制备右旋糖酐和（或)果糖以外，也可以通过这些菌种或其它产右旋糖酐蔗糖酶的工程菌来制备右旋糖酐蔗糖酶，再通过酶法转化蔗糖来制备右旋糖酐和果糖。

果糖是一种有重要用途的左旋性六碳糖，广泛应用于食品、医药、保健品等领域。传统法采用异构酶转化葡萄糖生产的果葡糖浆，或酸水解蔗糖产生葡萄糖和果糖，其转化液果糖理论最多接近50％浓度，且果糖和葡萄糖性质相近，从中转化液分离果糖需要模拟移动床层析分离，投入大，成本高。通过右旋糖酐蔗糖酶转化蔗糖制备右旋糖酐的过程中，产生等摩尔量的果糖副产物，由于右旋糖酐和果糖的分子量差异大，更容易分离纯化得到高纯度的果糖。

蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖组成的双糖，它主要来源于甘蔗茎秆和甜菜块根等植物组织。甘蔗是一种光合作用效率比较高的植物，广泛种植在我国亚热带地区，其有生产成本低廉，原料来源丰富等优质。甘蔗制糖企业将收集来的甘蔗茎秆，经清洗、粉碎、压榨后获得甘蔗汁，再通过添加磷酸调节pH、石灰乳中和、絮凝剂澄清、SO₂漂白、糖浆蒸发浓缩糖蜜分离干燥结晶等一系列复杂的工艺后制备得到白砂糖。

甘蔗汁是甘蔗茎秆直接经过压榨后产生的汁液，其含糖量一般在18～20％，其中大部分糖为蔗糖，少量为葡萄糖和果糖，并且含有丰富的氨基酸、维生素和多种矿物质，是一种天然的、优良的培养基质。利用甘蔗汁为主要原料配制成不同培养基，通过不同微生物发酵可以制备甘露醇（中国发明专利：CN201410254455.6）、制备可得然胶（中国发明专利：CN201811325646.1）、生产乙醇、丁醇（中国发明专利：CN200310026982.3；CN200810073826.5）、生产丁二酸（中国发明专利：CN201310733205.6）、生产饲料（中国发明专利：CN202110568225.7）等等。有研究报导，肠膜状明串珠菌（L.mesenteroides）类细菌本来就是从甘蔗糖厂、甘蔗地或泡菜发酵物中最先分离得到的微生物。在甘蔗入榨时，致成蔗汁板结为“蔗饭”的现象正是肠膜状明串珠菌类生长活动造成的后果，可见甘蔗汁正是这类微生物生长和繁殖的天然环境（甘蔗糖业, 2014, 06: 28-32;中国调味品, 2019, 44(11): 157-161）。按《中国药典》2020年版要求，医药级右旋糖酐T20、T40、T70及其衍生物相关的药品，是以肠膜状明串珠菌（L.mesenteroides-1226）发酵蔗糖生成高分子右旋糖酐聚合物，经不同工艺精制处理后，得到符合临床应用要求的右旋糖酐系列产品。

目前，利用甘蔗汁为培养基主要成分进行发酵制备右旋糖酐和果糖的方法未见相关报导。

本发明通过配制以甘蔗汁为主要原料的发酵培养基，肠膜状明串珠菌利用甘蔗汁中其它丰富的营养成分进行生长繁殖，其分泌的右旋糖酐蔗糖酶直接将甘蔗汁中的蔗糖成分转化为右旋糖酐，同时生成等摩尔量的果糖副产物，从而省去制备白砂糖的繁杂工艺和昂贵成本。本发明的方法直接将甘蔗榨汁即甘蔗汁为培养基成分，省去了传统制糖企业制备白砂糖的复杂工艺，同时得到高纯度的果糖，右旋糖酐和果糖的生产成本大为降低，具有省时、省力、工艺简单的优势，为将来以甘蔗汁为原料工业化生产右旋糖酐和果糖奠定技术基础。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术方面存在的问题，公开了一种利用甘蔗汁为原料发酵制备右旋糖酐和果糖的方法。本发明突出的优点就是利用原料来源丰富、生产成本低廉的甘蔗通过榨取汁液，以此甘蔗汁液替代昂贵的白砂糖作为原料底物，配制成发酵培养基，肠膜状明串珠菌主要利用甘蔗汁中丰富的其它营养成分进行生长繁殖，同时分泌出右旋糖酐蔗糖酶又将甘蔗汁中的蔗糖成分直接转化为右旋糖酐，同时生成等摩尔量的果糖副产物。由于右旋糖酐和果糖的分子量差异大，两种产物更容易分开并纯化，较传统方法更容易纯化得到高纯度的果糖。本发明的方法把甘蔗本身的有用成分利用到了极致，也省去了从“甘蔗”到“白砂糖”复杂的制备工艺及其昂贵的制备成本。

本发明制备右旋糖酐的方法，正是按《中国药典》相关右旋糖酐工艺要求改进而来的，仅仅是以更天然、更廉价的甘蔗汁代替白砂糖为原料，经发酵、分离纯化及其后期的精制处理后可得到符合《中国药典》要求的产品。

本发明方法的优点和有益效果如下：

本发明的技术思路，顺应了肠膜状明串珠菌生长环境和生理特点，根据甘蔗汁成分改进的MRS培养基而制成的发酵培养基，降低了制备右旋糖酐和果糖的成本。本发明利用甘蔗汁为培养基发酵制备右旋糖酐和果糖，不需要右旋糖酐蔗糖酶的分度纯化，不需要将甘蔗制成白砂糖的复杂工艺，也不需要将蔗汁中的蔗糖进行分离纯化，无传统制糖工艺后期废糖蜜的残留，甘蔗汁中的蔗糖成分利用率可达98%以上，大大提高了甘蔗中蔗糖成分的利用率。本发明方法产生的右旋糖酐和果糖的分子量差异大，两种产物更容易分开并纯化，从而大大降低右旋糖酐和果糖的制备成本，其将促进甘蔗糖转化为右旋糖酐和果糖的工业化生产，有利于提高甘蔗的附加值，因此具有较大应用的前景。

附图说明

图1为以甘蔗汁为原料发酵制备右旋糖酐和果糖的发酵液色谱分析图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，下述实例所述内容属于本发明的主要内容，但是并不仅仅限于这些内容。需要说明的是，有些对本领域专业人员来说是显而易见的修改或扩展内容，如适当修改发酵培养基成分和改变发酵条件，或使用具有等同功能的菌株或工程菌进行发酵，或按本方法进行不同比例的放大实验或生产，亦可得到本发明相似的效果，虽然并未在本专利说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。实验材料及实验方法说明:本发明及实施例所述的菌株，即肠膜状明串珠菌肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides LM-1226），现编号为CMCC（B)-34991，购于中国医学细菌保藏管理中心；培养基其他成分、实验制剂、耗材均从生化试剂公司买到，新鲜甘蔗茎杆（糖料蔗）从广西南宁市西乡塘区石埠镇一甘蔗种植地采集，甘蔗汁现榨现用，无其它添加成分。MRS培养成分为（每1000 mL）含有：酪蛋白胨 10.0克、牛肉浸取物 10.0克、酵母提取液 5.0克、葡萄糖 5.0克 、乙酸钠 5.0克 、柠檬酸二胺2.0克 、吐温 80 1.0克、磷酸氢二钾2.0克 、七水硫酸镁0.2克 、七水硫酸锰0.05克、碳酸钙2.0克 ，余量为水，调pH为6.8，121℃高温灭菌20 min再冷却即得。

实施例1

1.1甘蔗汁的制备

将新鲜甘蔗茎杆去皮，切成条状，用果汁机进行榨汁，得到汁液于12000 r/min离心20 min，再将得到的甘蔗汁上清液用5 N的NaOH溶液调其pH为6.5，取汁液于105℃高压灭菌20 min后得到无菌甘蔗汁。

1.2发酵培养基的制备

配制A培养基，其成分为含有酵母粉2.5 g/L、蛋白胨10 g/L、磷酸氢二钾1 g/L，MgSO₄ 0.1 mmol/L、磷酸氢二钠2 g/L，余量为水，调pH为6.5，121℃灭菌20 min后冷却待用。取100 mL步骤1.1制备的无菌甘蔗汁与90 mL的A培养基进行混合而得到发酵培养基，发酵培养基置于500 mL的无菌三角瓶内。

1.3种子液的制备

将肠膜明串珠菌以单菌落接种到已经置于50 mL的三角瓶内的10 mLMRS液体培养基中，28℃和220 r/min振荡培养18 h，得到其种子液。

1.4发酵培养条件

将上述种子液以5％的接菌量加入到步骤1.2制备的发酵培养基中，在28℃条件下以180 r/min的速度振荡培养30 h，得到含有右旋糖酐和果糖的发酵液。

1.5发酵液中右旋糖酐及果糖的检测及其分离纯化

发酵结束后，发酵液于12000 r/min离心20 min除去菌体等其他不溶性杂质，取1.0 mL发酵液稀释20倍，使用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC）测定发酵液中右旋糖酐的分子量及果糖的含量。HPGPC分析结果如图1所示，图谱上分别在9.490、16.390、18.263和18.893分钟处出现特征峰，其成分分别为大分子右旋糖酐（分子量1100 kDa、分布系数1.25）、极少量的微分子量（分子量2000 Da)右旋糖酐、残留的蔗糖（或其它二糖，总含量占2.01%）和大量的果糖，可见蔗汁中蔗糖的综合利用率可达98%。

将上述离心过的发酵液置于温度70℃水浴锅保温1 h以灭活右旋糖酐蔗糖酶和其它小分子蛋白，再于12000 r/min离心20 min除去蛋白杂质及其他不溶性杂质，上清液为乳状透明的含有大分子量右旋糖酐和果糖的混合溶液。上述混合溶液再经过2倍体积乙醇沉淀和70%乙醇洗涤（各2次），沉淀物经真空干燥后即得到大分子右旋糖酐。

将含有大量果糖的醇沉离心后得到的上清液按本研究小组的专利进行分离纯化（中国发明专利，专利号：202210698098.7），即含有大量果糖的醇沉上清液经200Da截留分子量纳滤膜除去低聚糖和微分子右旋糖酐，透过液再经过反渗透除去钠离子等杂质，进一步蒸发浓缩，得到高纯度果糖，纯度可达93％。

实施例2

2.1甘蔗汁的制备

将新鲜甘蔗茎杆去皮，切成条状，榨汁，得到汁液于12000 r/min离心20 min，再将得到的甘蔗汁上清液用5 N的NaOH溶液调其pH为6.8后，于115℃高压灭菌10 min后得到无菌甘蔗汁。

2.2发酵培养基的制备

配制A培养基，其成分为含有酵母粉5.0 g/L、蛋白胨7.5 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L，MgSO₄ 0.3 mmol/L、磷酸氢二钠1.0 g/L，余量为水，调pH为7.0，121℃灭菌15 min即得。取步骤2.1制备的80 mL无菌甘蔗汁与120 mL的A培养基进行混合而得发酵培养基，发酵培养基置于500 mL的无菌三角瓶内。

2.3种子液的制备

将肠膜明串珠菌以单菌落接种到已经置于50 mL的三角瓶内的10 mLMRS液体培养基中，28℃和220 r/min振荡培养24 h，得到其种子液。

2.4发酵培养条件

将上述种子液以2％接菌量加入到步骤2.2制备的发酵培养基中，在30℃条件下以150 r/min的速度振荡培养36 h，得到含有右旋糖酐的发酵液。

2.5右旋糖酐和果糖的分离纯化

发酵结束后，发酵液于12000 r/min离心30 min除去菌体等其他不溶性杂质，取1.0 mL发酵液稀释20倍，使用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC）测定发酵液中右旋糖酐的分子量和果糖的含量。将上述离心过的发酵液置于温度70℃水浴锅保温1 h以灭活右旋糖酐蔗糖酶和其它小分子蛋白，再于12000 r/min离心20 min除去蛋白杂质及其他不溶性杂质，上清液为乳状透明的含有大分子量右旋糖酐和果糖的混合溶液。上述混合溶液再经过2倍体积乙醇沉淀和70%乙醇（各3次），沉淀物经真空干燥后即得到大分子右旋糖酐。

将含有大量果糖的醇沉离心后得到的上清液按本研究小组的专利进行分离纯化（中国发明专利，专利号：202210698098.7），即含有大量果糖的醇沉上清液经200Da截留分子量纳滤膜纳滤除去低聚糖和右旋糖酐，透过液再经过反渗透除去钠离子等杂质，进一步蒸发浓缩，得到高纯度果糖，纯度可达91％。

应该理解的是，对本领域的研究人员来说，根据本专利说明的方法加以适当地改进或变换，如适当改变培养基成分和发酵条件等，亦得到本发明等同的效果。用于发酵的菌种，除了来源于肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）或与其功能等同的突变体以外，还可以来源于口腔链球菌（Oral streptococcus）、乳酸明串珠菌(Leuconostoc lactis)、大蒜明串珠菌（Leuconostoc garlicum）、Leuconostoc suionicum、芽孢杆菌属、放线菌、酸假孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热Thermus属Thermus thermophilus等以及能产生右旋糖酐蔗糖酶的菌株或其功能等同的突变体，或来源于其它含有右旋糖酐蔗糖酶或与其功能等同突变体的重组菌、工程菌，或能实现右旋糖酐蔗糖酶及其突变体表达的其它菌株等，或通过某些右旋糖酐蔗糖酶突变体按本发明的方法制备不同分子量的右旋糖酐或低聚葡萄糖，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种以甘蔗汁为原料发酵制备右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：包括下述步骤：

（1）发酵培养基的配制：将新鲜甘蔗茎杆去皮，榨汁，12000 r/min离心20-30 min，得到的甘蔗汁上清液用5 N的NaOH溶液调其pH为6.5-6.8，再于105-121℃灭菌10-20 min后得到无菌甘蔗汁；将无菌甘蔗汁与A培养基按1:0.8-1.5体积比（V/V)进行混合而得发酵培养基；A培养基的成分，含有酵母粉1-5 g/L、蛋白胨5-10 g/L、磷酸氢二钾1-2 g/L，MgSO₄ 0.1-0.3 mmol/L、磷酸氢二钠1-2 g/L，余量为水，调pH为6.5-7.0，121℃灭菌15-20 min后冷却即得；

（2）种子液制备及发酵液的制备：将肠膜明串珠菌以单菌落接种到MRS液体培养基中，28℃和220 r/min振荡培养18～24 h，得到其种子液；将上述种子液以1-5％接菌量加入到上述发酵培养基中，在25-30℃条件下以120-180 r/min的速度振荡培养30-36 h，得到含有右旋糖酐和果糖的发酵液；

（3）右旋糖酐和果糖的分离纯化：将发酵液用10000-12000 r/min离心20-30 min去除菌体沉淀，得到的发酵液上清再经2倍体积乙醇沉淀和70%乙醇洗涤，沉淀物经真空干燥后即得到大分子右旋糖酐；将醇沉得到的上清液经200Da截留分子量纳滤膜除去低聚糖和微分子右旋糖酐，透过液再经过反渗透除去钠离子等杂质，进一步蒸发浓缩即得到高纯度的果糖。

2.根据权利要求1所述的一种以甘蔗汁为原料发酵制备右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：所述肠膜状明串珠菌为肠膜状明串珠菌LM-1226。