CN1730660A

CN1730660A - 微生物催化法生产烟酰胺

Info

Publication number: CN1730660A
Application number: CN 200410053448
Authority: CN
Inventors: 沈寅初; 薛建萍; 李还宝; 王胜亮; 李勇; 朱健
Original assignee: SHANGHAI PESTICIDE RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: Shanghai Pesticide Research Institute
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2004-08-05
Publication date: 2006-02-08

Abstract

本发明属微生物技术领域。本发明公开了一种微生物催化法生产烟酰胺的方法。本发明采用接近棒杆菌产生的腈水合酶将3－腈基吡啶转化成烟酰胺。本发明的方法操作简便，反应条件温和，减少环境污染，分离提纯简单，产品纯度高，宜于规模型工业化生产。

Description

微生物催化法生产烟酰胺

技术领域：

本发明属微生物技术领域。具体涉及一种微生物催化法生产烟酰胺。

背景技术：

烟酰胺是人和动物必需的B-配合物维生素，在自然界分布很广，以干酵母谷物的胚芽、肉类(肝脏和肌肉)、花生等食物中含量较多，是生物体内脱氢辅酶的组成部分，参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢。烟酰胺在医药中是一种抗粗皮肤病的维生素，对某些皮肤病和神经障碍有特殊疗效。它还可以添加到食品和面粉中用以补充人体所需的维生素，其最大应用领域是饲料添加剂。同时，烟酰胺也是合成其它医药、农药的重要中间体。

目前主要的生产方法是：1.3-甲基吡啶氨氧化成烟酰胺和2-甲基-5-乙基吡啶用硝酸氧化成烟酰胺。氨氧化法(特别是2-甲基-5-乙基吡啶的硝酸氧化)是一种选择性很高的方法，但他是有危险的，为了降低这种危险，高素质的人员、最好的基础设施和较高的技术水准是必不可少，因而给产业化及技术转让设置了较大障碍。目前，还未获得可工业化应用的氨氧催化剂。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计一种便于产业化的生产方法。

本发明提供了一种微生物催化法生产烟酰胺的方法，该方法是通过发酵生产含有腈水合酶的接近棒杆菌或其诱变菌株细胞，在一定条件下用固定化细胞法或者游离细胞连续法催化3-腈基吡啶水合成烟酰胺，而后通过较为简单的后处理获得高纯度的烟酰胺产品。

本发明提供了一种微生物菌种，其特征在于该菌株的分类命名为接近棒杆菌，corynebacterium propinguum。该菌种已于2003年1月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记号：CGMCC No.0886。

本发明的具体实施方式如下：

(1)产酶细胞的制备：

先进行发酵种子的培养，在三角瓶或种子罐中装入适量的种子培养基(10-70％)，灭菌后接入一定量的菌种(1-10％)，在20-40℃下，旋转式摇床中(100-400rpm)振荡培养30-120小时，然后在50L-20m³的发酵罐其发酵培养基装入量为40％-70％，实罐消毒后接入2-7％的种子液，在通气量1∶0.2-1∶1(V.V.M)；搅拌转速：50-400rpm；罐压0.03-0.06MP；温度：20-40℃。发酵30-200小时；

种子培养基组成：0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％NaCl，0.05-0.3％K₂HPO₄，0.01-0.03％MgSO₄，尿素0.1-1％，PH7.0-7.5；

发酵培养基：1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％K₂HPO₄，0.03-0.1％KH₂PO₄，0.03-0.1％MgSO₄，2-20ppmCoCl₂，pH6.5-7.5；

(2)催化水合生产过程：

将发酵液在分离因素≥3000，离心分离，去上清液，获得产腈水合酶细胞；将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或pH7.0-8.0的缓冲液中，加入到反应釜中，发酵液与反应液体积的比例维持在≥1％。在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应。当产物浓度≥5％时，开始通过ultra-flow膜过滤系统出产物，同时开始补加3-腈基吡啶和水，该膜过滤系统让产物通过，并达到去除蛋白质及其它杂质，而能使游离细胞重新返回反应釜参与反应。通过调节3-腈基吡啶和水的流加速度和产物烟酰胺溶液的流出速度，从而使流出的产物烟酰胺溶液浓度保持在设定的范围，初始底物浓度≤20％(w/v)，最终转化率为≥99％；

(3)纯化处理：

将水合反应获得的一定浓度的烟酰胺液置于1-20℃的环境下，保持2小时以上。烟酰胺的溶解度随温度的降低而大大下降，保温一段时间后，出现大量结晶体，将晶体和水的混合溶液通过冷冻离心进行分离获得晶体，将晶体在35-50℃下进行真空干燥，最终获得的烟酰胺纯度在99.8％以上。

或者采用批式反应，批式反应的流程：将发酵液在分离因素≥3000kg，离心分离，去上清液，将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或pH7.0-8.0的缓冲液中，发酵液与反应液的比例维持在≥1％，在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应，反应过程中，通过补加3-腈基吡啶的固体或者溶液使底物浓度控制在0.001％-20％，经过1-24h的反应，获得浓度在10％以上的烟酰胺溶液，它的产物溶液累积到一定浓度后(≥10％)一次性出罐最终转化率为≥99％；

将达到一定浓度的反应液通过离心去掉细胞及细胞碎片，温度维持在28-32℃，将获得的清液再通过膜过滤系统去除蛋白质，把去除蛋白质的液体置于1-20℃的环境下，保持2小时以上。烟酰胺的溶解度随温度的降低而大大下降，保温一段时间后，出现大量结晶体，将晶体和水的混合溶液通过膜过滤或者冷冻离心进行分离获得晶体，将晶体在35-50℃下进行真空干燥，最终获得的烟酰胺纯度在99.8％以上。与连续法的区别在于，通过补加加入3-腈基吡啶的固体或者溶液，使底物浓度控制在10ppm以上，经过1-24h的反应，获得浓度在10％以上的烟酰胺溶液，它的产物溶液累积到一定浓度后(≥10％)一次性出罐，转化率≥99％。在分离提纯步骤还要加上，将达到一定浓度的反应液通过离心去掉细胞及细胞碎片，再通过膜过滤系统去除蛋白质，温度维持在28-32℃。其余方法均与连续法相同。

本发明使用接近棒杆菌及其诱变菌种产生的腈水合酶将3-腈基吡啶转化成烟酰胺，其操作过程简单、反应条件温和、减少环境污染，且分离提纯简单，产品纯度高。

本发明与现有技术相比具有下列特点：

1)现有技术用于催化腈成酰胺的菌株主要是红球菌属的细菌，本发明采用的是接近棒杆菌及其经诱变的菌种。该菌种由本所含腈的土壤中分离获得，经初步鉴定为接近棒杆菌。该菌株产酶能力强，在本发明的发酵条件下能获得较高的生物量，最高可达40毫克/毫升发酵液，因而其单位体积发酵液的总酶活也较高，最高可达1000万单位/毫升发酵液。(注：酶活定义，在一小时里将1微克的3-腈基吡啶转化为烟酰胺的酶量，单位：微克/小时)。

2)本发明的催化水合使用的工艺是批式反应或者游离细胞膜分离连续反应。与传统的批式反应相比，连续反应大大提高了生产效率，减轻了劳动强度，提高了生物酶催化剂及设备的利用率；同时本发明相对固定化细胞生产，减少了工艺流程，减少了三废，降低了生产成本，生产过程中减少了传质阻力提高了生产效率。批式反应对设备要求低，生产的烟酰胺浓度比连续法要高，简便了下游的分离提纯。

3)本发明的分离提纯采用将反应液冷冻结晶，而后过滤或者离心，再将晶体真空干燥或者喷雾干燥。

具体实施方式：

实施例1、

在1m3的种子罐中加入60％的培养基，实罐消毒后，接入1茄子瓶的斜面菌种，发酵前期的通气量为1∶0.3，搅拌速度为50rpm，后期的通气量为1∶0.5，搅拌速度为100rpm，罐压0.05mp，温度28℃，培养50小时。

在10m³的发酵罐中加入60％的发酵培养基，实罐消毒后接入5％的种子液，在通气量1∶0.5(V.V.M)；罐压0.05MP；搅拌转速：前期180rpm，后期100rpm；温度：28℃。发酵60小时。

种子培养基组成：0.6％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.05％K₂HPO₄，0.05％MgSO₄，0.05％KH₂PO₄，pH7.2

发酵培养基：2.1％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.9％尿素，0.05％K₂HPO₄，0.05％KH₂PO₄，0.1％MgSO₄，10ppm CoCl₂，pH7.5

实施例2、

将50毫升发酵液在分离因素为3500时，离心7分钟。去上清液，获得产腈水合酶的细胞。将细胞悬浮于去离子水溶液中，发酵液与反应液体积的比例是5％。在28℃的温度下，100rpm的搅拌速度下进行酶催化反应。3-腈基吡啶的初始浓度是5％，前30min以15ml/min的流速加入浓度50％的3-腈基吡啶溶液，而后产物烟酰胺溶液(约20％)以1000ml/h的速度通过ultra flow膜过滤系统，进入下一道工艺，同时16.5％的3-腈基吡啶溶液以1030ml/h的速度流加进入连续式反应罐。96小时后终止反应，共有有19280g的3-腈基吡啶转化为烟酰胺，转化率为≥99％。

实施例3、

将从连续反应获得的反应液置于4℃的冷冻环境下，保持2小时以上。烟酰胺的溶解度随温度的降低而大大下降，冷冻保温一段时间后，出现大量结晶体。将晶体和水的混合溶液通过冷冻离心进行分离获得晶体。将晶体在40℃下进行真空干燥，最终获得的烟酰胺纯度在99.8％以上。

实施例4、

将1升发酵液在分离因素为3500kg，离心7分钟。去上清液，获得20g的细胞。将细胞悬浮于去离子水中，发酵液与反应液体的比例维持在5％(v/v)。在28℃的温度下，100rpm的搅拌速度下进行酶催化反应。通过加入3-腈基吡啶固体使底物浓度在5％左右，随着反应的继续，不断补加一定量的底物使底物浓度维持在100ppm。在反应的收尾阶段，不再补加底物从而使底物浓度逐渐降低，趋向于零。一小时后有6000g的烟腈转化为烟酰胺，得到的烟酰胺溶液浓度为30％(w/v)转化率为≥99％。

实施例5、

将达到一定浓度的反应液通过离心去掉细胞及细胞碎片，然后通过膜过滤去除蛋白质。将获得的清液置于4℃的冷冻环境下，保持2小时以上。烟酰胺的溶解度随温度的降低而大大下降，冷冻保温一段时间后，出现大量结晶体。将晶体和水的混合溶液通过膜过滤或者冷冻离心进行分离获得晶体。将晶体在40℃下进行真空干燥，最终获得的烟酰胺纯度在99.8％以上。

Claims

1、一种微生物催化法生产烟酰胺的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)产酶细胞的制备：

先进行发酵种子的培养，在三角瓶或发酵罐中装入适量的种子培养基(10-70％)，灭菌后接入1-10％的微生物菌种，在20-40℃下，旋转式摇床中100-400rpm振荡培养48-120小时，然后在50L-20m³的发酵罐其发酵培养基装入量为40％-70％，实罐消毒后接入2-7％的种子液，在通气量1∶0.2-1∶1 V.V.M；罐压0.03-0.06MP；搅拌转速：50-400rpm；温度：20-40℃，发酵30-200小时；

种子培养基组成：0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％NaCl，0.05-0.3％ K₂HPO₄，0.01-0.03％MgSO₄，尿素0.1-1％，pH7.0-7.5：

发酵培养基：1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％ K₂HPO₄，0.03-0.1％ KH₂PO₄，0.03-0.1％MgSO₄，2-20ppmCoCl₂，pH6.5-7.5；

(2)催化水合生产过程：

将发酵液在分离因素≥3000kg，离心分离，去上清液，获得产腈水合酶细胞；将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或pH7.0-8.0的缓冲液中，加入到连续反应罐中，发酵液与反应液体的比例维持在≥1％，在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应，当产物浓度≥5％时，开始通过ultra flow膜过滤系统出产物，同时开始补加3-腈基吡啶和水，该膜过滤系统让产物通过，而使游离细胞重新返回反应釜参与反应，通过调节3-腈基吡啶和水的流加速度和产物烟酰胺溶液的流出速度，从而使流出的产物烟酰胺溶液浓度保持在设定的范围，初始底物浓度≤20％w/v，最终转化率为≥99％；

(3)纯化处理：

将水合反应获得的一定浓度的烟酰胺液置于1-4℃的冷冻环境下，保持2小时以上，烟酰胺的溶解度随温度的降低而大大下降，保温一段时间后，出现大量结晶体，将晶体和水的混合溶液通过冷冻离心进行分离获得晶体，将晶体在35-50℃下进行真空干燥，最终获得的烟酰胺纯度在99.8％以上。

2、根据权利要求1所述的一种微生物催化法生产烟酰胺的方法，其特征在于其中所述的步骤(2)和(3)采用下列方法：

将发酵液在分离因素≥3000kg，离心分离，去上清液，将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或pH7.0-8.0的缓冲液中，发酵液与反应液的比例维持在≥1％，在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应，反应过程中，通过补加3-腈基吡啶的固体或者溶液使底物浓度控制在0.001％-20％，经过1-24h的反应，获得浓度在10％以上的烟酰胺溶液，它的产物溶液累积到一定浓度后(≥10％)一次性出罐最终转化率为≥99％；

将达到一定浓度的反应液通过离心去掉细胞及细胞碎片，温度维持在28-32℃，将获得的清液再通过膜过滤系统去除蛋白质，把去除蛋白质的液体置于1-20℃的环境下，保持2小时以上，烟酰胺的溶解度随温度的降低而大大下降，冷冻保温一段时间后，出现大量结晶体，将晶体和水的混合溶液通过膜过滤或者冷冻离心进行分离获得晶体，将晶体在35-50℃下进行真空干燥，最终获得的烟酰胺纯度在99.8％以上。

3、根据权利要求1所述的一种微生物催化法生产烟酰胺的方法，其特征在于其中所述微生物菌种为接近棒杆菌，corynebacteriumpropinguum，保藏登记入册编号为：CGMCC No.0886。