CN104762340A - 一种利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法，包括烟腈水合酶生产菌细胞的培养、固定化细胞的制备、固定化细胞生物转化烟腈生产烟酰胺化水合反应、烟酰胺的提取工艺。本发明方法中采用固定化细胞作为催化剂，可以使生物催化剂多次重复利用，降低了生产成本，简化了工艺，产物产率有着很大的提高。本方法工艺简单，适合大规模生产，产物转化率高，纯度高。
Description
技术领域
本发明属于生物法合成领域，具体涉及一种利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法。
背景技术
烟酰胺又称尼克酰胺，维生素B3，英文Nicotinamide，分子式C6H6N2O，分子量122.13，白色针状结晶或粉末，有苦味，无臭，熔点128~131 ℃，比重1.400，易溶于水、醇和甘油。在空气中稳定，不吸潮。主要作为饲料的营养性添加剂(水溶性维生素)，也用于食品、医药、染料的中间体，同时用作电镀液的添加剂和生化试剂。烟酸、烟酰胺属B族维生素，通称VB，在实际应用中可等量替代,自然界的烟酸存在于肝、肾、酵母和米糠中，是生物体内脱氢辅酶Ⅰ或Ⅱ的组分，参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢。它们在医药中可用于治疗糙皮病等，还可以添加到食品和面粉中用以补充人体所需的维生素，其最大的应用领域是用作饲料添加剂。
工业上，烟酰胺、烟酸主要是以吡啶类化合物为原料生产的，世界烟酰胺、烟酸的生产主要集中在西欧和美国，日本也有少量生产。我国烟酸、烟酰胺的产量很少，只用于制药工业，因生产工艺水平落后，饲料工业中大量所需的烟酸、烟酰胺主要依赖进口。随着我国经济的腾飞，人民生活水平迅速提高，食品结构从植物型转变为动物型，饲料工业随之迅速发展：饲料中添加烟酸、烟酰胺后可提高畜禽的抗病、防病能力，加快生长速度,降低饲料成本。另外，我国人口众多，如果在医药和食品中加入适量的烟酰胺、烟酸对于提高人民的身体和健康水平具有重要意义。烟酸、烟酰胺在我国食品的应用尚未开发，因此尽快建设具有一定经济规模的生产装置，批量生产烟酸、烟酰胺，不仅有很大的现存市场，还有巨大的潜在市场。目前生产烟酰胺的工艺分为两大类，一种是化学合成法和另外一种是生物合成法。化学法主要是采用3-甲基吡啶、2-甲基-1,5-戊二胺、2-甲基-5-乙基吡啶等为初始原料，通过氧化剂直接氧化或催化氧化生成3-氰基吡啶，再经过碱液水解生产烟酰胺。常用的氧化剂有硝酸、臭氧、过氧化氢、和高锰酸钾。这些工艺虽然比较成熟，但是原料和催化剂价格昂贵，消耗量大，成本高，收率低，对环境的污染很大，很难进行大规模的工业化生产。生物合成法就是利用微生物发酵，产生生物酶，用生物酶催化反应的方法。采用微生物细胞中产生的腈水合酶转化3-氰基吡啶生成烟酰胺。微生物法生产烟酰胺反应条件温和，产物产率和纯度高，价格便宜，消耗量小，成本低，环境友好等优点，这些相比较化学合成法有着明显的优势。因而越来越多的学者对微生物法进行了研究。瑞士隆萨股份公司的J(赫夫林等人的发明专利“烟酰胺的制备方法”。在此发明中2-甲基-1，5-二氨基戊烷经催化、氨氧化、微生物法转化为烟酰胺。微生物反应采用红球菌属微生物或其功能相当的变体和突变株体进行。3-甲基吡啶转化为3-氰基吡啶的转化率高达99%，生产得到的烟酰胺纯度达99.5％以上。但此过程步骤繁多，工艺复杂。上海市农药研究所的沈寅初等人的发明专利“微生物催化法生产烟酰胺”采用接近棒杆菌产生的腈水合酶将3-氰基吡啶转化成烟酰胺。生产的烟酰胺的纯度和收率都(99.0％，虽然纯度和收率都很高，但是棒杆菌的培养是相当困难的，不适用与大规模的生产。浙江爱迪亚营养科技开发有限公司的邹军华等人的发明专利“一种谷氨酸棒杆菌及其应用于制备烟酰胺的方法”采用谷氨酸棒杆菌产生的腈水合酶于3-氰基吡啶水合反应得烟酰胺。所得烟酰胺的纯度达99.8％以上。但是这些方法对于大规模生产来说很不方便，不利于工艺的简化，生产成本较高。
发明内容
本发明提供了一种利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法。本方法工艺简单，适合大规模生产，产物转化率高，纯度高。
本发明采用的技术方案如下：
一种利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、烟腈水合酶生产菌细胞的培养：
a、 取葡萄糖40-60g，琼脂20-30 g，牛肉膏50-60 g， MgS04 0.6-1g，NaCl 10-15 g，KH2PO4 0.7-1 g，K2HPO4 0.8-1.5g，溶于适量水中，定容至1000mL，然后调pH至6.8-7.2，作为细菌的生长培养基；将枯草芽孢杆菌放在紫外灯的条件下培养48小时，得到枯草芽孢杆菌的突变株体作为菌种，将培养基灭菌后接入培养基体积的1-5%的菌种，于摇床上以60-200rpm恒温振荡培养，培养温度25-31 ℃，培养时间24-72h，得到种子液；然后进行发酵培养：发酵培养基消毒后接入培养基体积的2-5%的种子液，发酵前中期发酵罐的通气量为1:0.7-0.9V／V·min，后期的通气量为为1：0.3-0.4V／V·min，发酵温度为25-35 ℃，以70-150rpm的速度搅拌发酵40-80h，得到发酵液，发酵罐发酵时，让罐压先慢慢上升，然后再缓慢下降；要求罐压在24小时之内控制在0.04-0.05MPa下，以后罐压的变化为24-48小时控制在0.045-0.055MPa下，48-72小时控制在0.035-0.045MPa下，72小时之后控制在0.025-0.035MPa的压力下；
b 、将发酵液进行离心处理，去除上清液，得到湿的产腈水合酶细胞，加入湿的产腈水合酶细胞质量的1-2%的羧甲基纤维素钠，适量的去离子水，充分搅拌形成浓度为20-25%的产腈水合酶细胞悬浊液，再将此悬浊液注射到到浓度为3-5 % 的CaCl2水溶液中，注射结束以后低温保存，得固定化细胞悬浊液，即烟腈水合酶生产菌细胞悬浊液；
（2）、烟腈水合酶催化水合反应
在反应釜中，先添加容器量的50-60%的去离子水，调pH到7.0，采用分批加料的方式先向反应釜中首次添加底物 3-氰基吡啶和上述获得的生物催化剂固定化细胞悬浊液，在18-22℃，50-200rpm的搅拌速度下进行生物催化转化反应，每隔1小时对反应液中的3-氰基吡啶浓度进行检测，当浓度低于0.5g/L时，开始补加底物和生物催化剂固定化细胞悬浊液，补加的量与起始量一致，底物烟腈反应一定时间后，用HPLC法测定转化液中烟腈残留量,当烟腈残留量接近零时，即为生物催化反应的终点，所述的底物3-氰基吡啶和生物催化剂固定化细胞悬浊液的每批添加质量比为5:1；
（3）、烟酰胺的提取纯化工艺：
a、当转化液中烟酰胺的浓度在室温下达55-58 %， 开始冷却析晶,在结晶过程中开启搅拌，且当温度降到10-11 ℃时加入适量晶种，促使晶核形成并缓慢生长，所得烟酰胺晶体大，色泽好，过滤出晶体，得到一次母液，一次母液直接冷却析出烟酰胺晶体，滤出晶体，得到二次母液；
b、所得二次母液中烟酰胺浓度为25-28%， 先真空蒸发出一部分水分，使得溶液达到饱和状态再进行下一步的冷却析晶，所得三次母液在大生产时可套用至下一批转化液中，合并多次结晶的晶体，即为成品。
所述的利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法，其特征在于,所述的发酵培养基的组成：1-5%葡萄糖，1-5%液化淀粉、1-5%玉米浆、0.5-5%酵母膏，0.1-1%蛋氨酸，0.03-0.2%K2HPO4，0.01-0.1%MgSO4，0.01-0.1%ZnSO4、0.01-0.1%CuSO4、5-10ppmCoCl2，pH 7.0-7.5。
本发明的利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法中，将产腈水合酶细胞固定，采用固定化细胞作为生物催化剂将烟腈转化为烟酰胺的方法，同时又采用底物和产腈水合酶分批加料的方式多次补加， 采用分批少量多次添加底物3-氰基吡啶， 少量多次的加入对固定化细胞的毒性作用小，提高了生化反应的酶活性，有利于固定化细胞的多次转化，节约了成本、提高了转化率，同时减少了浓缩处理，简便了后期的分离提纯的工艺， 最终获得的烟酰胺纯度在99.8％以上。
具体实施方式
一种利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法，包括以下步骤：
（1）、烟腈水合酶生产菌细胞的培养：
a、 取葡萄糖50g，琼脂25 g，牛肉膏55g， MgS04 0.7g，NaCl 13 g，KH2PO4 0.8 g，K2HPO4 1.2g，溶于适量水中，定容至1000mL，然后调pH至7.0，
作为细菌的生长培养基；将枯草芽孢杆菌放在紫外灯的条件下培养48小时，得到枯草芽孢杆菌的突变株体作为菌种。将培养基灭菌后接入培养基体积的3%的菌种，于摇床上以60-200rpm恒温振荡培养，培养温度28 ℃，培养时间24-72h，得到种子液；然后进行发酵培养：发酵培养基消毒后接入培养基体积的4%的种子液，发酵前中期发酵罐的通气量为1:0.7-0.9V／V·min，后期的通气量为为1：0.3-0.4V／V·min，发酵温度为25-35 ℃，以70-150rpm的速度搅拌发酵40-80h，得到发酵液，发酵罐发酵时，让罐压先慢慢上升，然后再缓慢下降；要求罐压在24小时之内控制在0.04-0.05MPa下，以后罐压的变化为24-48小时控制在0.045-0.055MPa下，48-72小时控制在0.035-0.045MPa下，72小时之后控制在0.025-0.035MPa的压力下；其中，发酵培养基的组成：1-5%葡萄糖，1-5%液化淀粉、1-5%玉米浆、0.5-5%酵母膏，0.1-1%蛋氨酸，0.03-0.2%K2HPO4，0.01-0.1%MgSO4，0.01-0.1%ZnSO4、0.01-0.1%CuSO4、5-10ppmCoCl2，pH 7.0-7.5；
b 、将发酵液进行离心处理，去除上清液，得到湿的产腈水合酶细胞，加入湿的产腈水合酶细胞质量的1-2%的羧甲基纤维素钠，适量的去离子水，充分搅拌形成浓度为20-25%的产腈水合酶细胞悬浊液，再将此悬浊液注射到到浓度为3-5 % 的CaCl2水溶液中，注射结束以后低温保存，得固定化细胞悬浊液，即烟腈水合酶生产菌细胞悬浊液；
（2）、烟腈水合酶催化水合反应
在反应釜中，先添加容器量的50-60%的去离子水，调pH到7.0，采用分批加料的方式先向反应釜中首次添加底物 3-氰基吡啶和上述获得的生物催化剂固定化细胞悬浊液，在18-22℃，50-200rpm的搅拌速度下进行生物催化转化反应，每隔1小时对反应液中的3-氰基吡啶浓度进行检测，当浓度低于0.5g/L时，开始补加底物和生物催化剂固定化细胞悬浊液，补加的量与起始量一致，底物烟腈反应一定时间后，用HPLC法测定转化液中烟腈残留量,当烟腈残留量接近零时，即为生物催化反应的终点，所述的底物3-氰基吡啶和生物催化剂固定化细胞悬浊液的每批添加质量比为5:1；
（3）、烟酰胺的提取纯化工艺：
a、当转化液中烟酰胺的浓度在室温下达55-58 %， 开始冷却析晶,在结晶过程中开启搅拌，且当温度降到10-11 ℃时加入适量晶种，促使晶核形成并缓慢生长，所得烟酰胺晶体大，色泽好，过滤出晶体，得到一次母液，一次母液直接冷却析出烟酰胺晶体，滤出晶体，得到二次母液；
b、所得二次母液中烟酰胺浓度为25-28%， 先真空蒸发出一部分水分，使得溶液达到饱和状态再进行下一步的冷却析晶，所得三次母液在大生产时可套用至下一批转化液中，合并多次结晶的晶体，即为成品。
最终获得的烟酰胺纯度在99.9％。转化率为99.5%。
Claims (2)
1.一种利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、烟腈水合酶生产菌细胞的培养：
a、 取葡萄糖40-60g，琼脂20-30 g，牛肉膏50-60 g， MgS04 0.6-1g，NaCl 10-15 g，KH2PO4 0.7-1 g，K2HPO4 0.8-1.5g，溶于适量水中，定容至1000mL，然后调pH至6.8-7.2，作为细菌的生长培养基；将枯草芽孢杆菌放在紫外灯的条件下培养48小时，得到枯草芽孢杆菌的突变株体作为菌种，将培养基灭菌后接入培养基体积的1-5%的菌种，于摇床上以60-200rpm恒温振荡培养，培养温度25-31 ℃，培养时间24-72h，得到种子液；然后进行发酵培养：发酵培养基消毒后接入培养基体积的2-5%的种子液，发酵前中期发酵罐的通气量为1:0.7-0.9V／V·min，后期的通气量为为1：0.3-0.4V／V·min，发酵温度为25-35 ℃，以70-150rpm的速度搅拌发酵40-80h，得到发酵液，发酵罐发酵时，让罐压先慢慢上升，然后再缓慢下降；要求罐压在24小时之内控制在0.04-0.05MPa下，以后罐压的变化为24-48小时控制在0.045-0.055MPa下，48-72小时控制在0.035-0.045MPa下，72小时之后控制在0.025-0.035MPa的压力下；
b 、将发酵液进行离心处理，去除上清液，得到湿的产腈水合酶细胞，加入湿的产腈水合酶细胞质量的1-2%的羧甲基纤维素钠，适量的去离子水，充分搅拌形成浓度为20-25%的产腈水合酶细胞悬浊液，再将此悬浊液注射到到浓度为3-5 % 的CaCl2水溶液中，注射结束以后低温保存，得固定化细胞悬浊液，即烟腈水合酶生产菌细胞悬浊液；
（2）、烟腈水合酶催化水合反应
在反应釜中，先添加容器量的50-60%的去离子水，调pH到7.0，采用分批加料的方式先向反应釜中首次添加底物 3-氰基吡啶和上述获得的生物催化剂固定化细胞悬浊液，在18-22℃，50-200rpm的搅拌速度下进行生物催化转化反应，每隔1小时对反应液中的3-氰基吡啶浓度进行检测，当浓度低于0.5g/L时，开始补加底物和生物催化剂固定化细胞悬浊液，补加的量与起始量一致，底物烟腈反应一定时间后，用HPLC法测定转化液中烟腈残留量,当烟腈残留量接近零时，即为生物催化反应的终点，所述的底物3-氰基吡啶和生物催化剂固定化细胞悬浊液的每批添加质量比为5:1；
（3）、烟酰胺的提取纯化工艺：
a、当转化液中烟酰胺的浓度在室温下达55-58 %， 开始冷却析晶,在结晶过程中开启搅拌，且当温度降到10-11 ℃时加入适量晶种，促使晶核形成并缓慢生长，所得烟酰胺晶体大，色泽好，过滤出晶体，得到一次母液，一次母液直接冷却析出烟酰胺晶体，滤出晶体，得到二次母液；
b、所得二次母液中烟酰胺浓度为25-28%， 先真空蒸发出一部分水分，使得溶液达到饱和状态再进行下一步的冷却析晶，所得三次母液在大生产时可套用至下一批转化液中，合并多次结晶的晶体，即为成品。
2.根据权利要求1所述的利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法，其特征在于,所述的发酵培养基的组成：1-5%葡萄糖，1-5%液化淀粉、1-5%玉米浆、0.5-5%酵母膏，0.1-1%蛋氨酸，0.03-0.2%K2HPO4，0.01-0.1%MgSO4，0.01-0.1%ZnSO4、0.01-0.1%CuSO4、5-10ppmCoCl2，pH 7.0-7.5。
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