CN107022581A - 一种利用空气压力脉动固体发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用空气压力脉动固体发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：（1）种子液的制备；（2）固体发酵培养液的制备；（3）接种培养；（4）产物的提取和纯化。相对于现有技术，本发明有益效果在于：1）本发明中枯草杆菌的生长繁殖速度远高于常规静态固体发酵工艺，其最终生物量约为常规静态固体发酵的4~6倍，而且由于微生物数量的优势，使其发酵过程更为剧烈，对底物的利用也就更加彻底；2）本发明方法在优化的压力脉动条件下，其发酵周期比常规静态固体发酵周期缩短10~16h，γ‑聚谷氨酸产量提高30%~50%，效率高、操作简单、有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸是由L-谷氨酸、D-谷氨酸通过γ-酰胺键结合形成的一种高分子氨基酸聚合物，具有极佳的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、保湿性和可生物降解等独特理化和生物学特性，因而具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保湿等功能，是一种新型的对人体和环境无毒害的生物相容性天然高分子化合物。
微生物发酵法是目前生产γ-聚谷氨酸主要方法，基本过程是选用能大量产生γ-聚谷氨酸的菌种（如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌），为其提供合适的生长环境，满足其发酵过程的营养条件，从而在发酵基质中生产γ-聚谷氨酸，然后对发酵基质进行提取，经分离纯化得到γ-聚谷氨酸产品。微生物发酵过程条件温和，最终得到的γ-聚谷氨酸产品纯度较高。
微生物发酵方式又分为液体发酵和固体发酵。在固体发酵过程中的发酵基质一直处于静止状态的发酵方式称为常规静态固体发酵，其发酵基质为搅拌均匀的混合物料，为菌种提供发酵过程中所需要的营养来源，如氮源、碳源、水、无机物等。常规静态固体发酵的操作流程简单，产品产量高、成本低，主要反映在以下几个方面：一、发酵基质可以是农业残渣，故原料成本低；二、发酵菌种的生长状态更接近于自然状态；三、发酵过程少有废料产生，对环境污染小。常规静态固体发酵虽然有许多优点，但也因为其自身的发酵性质、发酵过程中传热传质不均匀、基料的温度和湿度较难掌控等原因，导致其发酵周期长、产量低、效率低，这些使得常规静态发酵在发展过程当中受到相当大的限制。正因为常规静态固体发酵还有诸多问题没有解决，发展新型生物反应器及其发酵工艺已成为研究热点。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术的不足，而提供一种利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，以缩短发酵周期，提高γ-聚谷氨酸产量。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）种子液的制备：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌冷却的液体种子培养基中，在30~40℃的摇瓶中培养18~36h，即得枯草芽孢杆菌种子液；根据接种的需要，该种子液可通过发酵罐扩大培养为二级种子液或三级种子液；
（2）固体发酵培养基的制备：将固体基料与营养液按照1:0.8~1:1.4的质量比分别投入压力脉动固体发酵罐中并进行搅拌，搅拌均匀后，开启高温水蒸气，在120~125℃的条件下进行高温灭菌处理，处理时间为30~60min，即得固体发酵培养基；
（3）接种培养：开启冷却水和搅拌，当压力脉动固体发酵罐的罐温降至30~40℃时，将枯草芽孢杆菌种子液按发酵培养基重量的1%~6%的接种量接入压力脉动固体发酵罐并进行搅拌，搅拌均匀后，在通风比、压力脉动固体发酵罐的搅拌转速和压力脉动固体发酵罐的罐温分别为0.1~0.8(v/v)、1~10r/min和30~40℃的条件下，进行空气压力脉动刺激培养14~28h。之后取消空气压力脉动设置，在压力脉动固体发酵罐的通风比、表压、罐温和搅拌转速分别为0.1~0.6(v/v)、0.01~0.05MPa、30~40℃和1~10r/min的条件下继续通风培养8~20h，即得固体培养物；
（4）产物的提取纯化：将步骤（3）所得的固体培养物取出，并往其中加入其重量的5~20倍的蒸馏水或去离子水，加热至90~100℃，搅拌并保温0.5~1 h，再对其进行过滤处理，最后将滤液经活性炭脱色、醇析、冷冻干燥等程序制得γ-聚谷氨酸。
其中，在步骤（3）接种培养过程中，前期采用了空气压力脉动，其所带来的有益效果是：
1）压力脉动让基料间隙的空气对流扩散，增加基料之间的湿度和温度的均匀度，还促进CO2和O2的交换；
2）发酵过程中反应器内的压力一直大于外界的压力，有效阻止了外界杂菌的进入，防止发酵基料受到污染；
3）在泄压操作中，因突然快速排气，颗粒间的气相因减压膨胀，对固体颗粒起松动作用，不但使供氧充足，而且为菌体的大量繁殖扩充了空间，所以发酵料层内外菌体都十分丰满；
4）当空气压力处于脉动状态（即周期性的加压与释压）时，微生物细胞通过细胞膜与周围基质之间发生物质、能量、信息交换，对发酵菌种的生命活动产生有利的影响，使原料转化率提高，发酵时间缩短。
另外，在步骤（3）接种培养过程中，后期取消压力脉动并采用常规通风发酵，是为了不让微生物过度生长而消耗谷氨酸及降解γ-聚谷氨酸作为营养物质，从而实现谷氨酸原料尽量向目标产物转化的目的。
作为本发明所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法的一种改进，所述固体基料由大豆粉和麸皮组成，所述大豆粉和所述麸皮的质量比例为0.1:1~1:1。
作为本发明所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法的一种改进，所述营养液的组成为：葡萄糖或蔗糖30~60g/L、谷氨酸钠10~50g/L、柠檬酸10~30g/L、K2HPO4 1g/L、NH4Cl 7g/L、FeCl3•6H2O 0.04g/L、MgSO4•7H2O 0.5g/L、CaCl2•2H2O 0.2g/L、MnSO4•H2O 0.1g/L，其余为水。
作为本发明所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法的一种改进，所述营养液的pH值通过浓度为10%的NaOH溶液调节为6.5~7.5。
作为本发明所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法的一种改进，在步骤（2）中，所述固体发酵培养基的体积为压力脉动固体发酵罐容积的20%~60%。
作为本发明所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法的一种改进，在步骤（3）中，所述空气压力脉动的气压上限为0.1~0.3MPa，所述空气压力脉动的气压下限为0.01~0.05MPa。气压上限和气压下限的压力值均是表压。
作为本发明所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法的一种改进，在步骤（3）中，所述空气压力脉动的脉动周期为10~120 min。
作为本发明所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法的一种改进，在步骤（4）中，所述过滤处理为先用100目筛网过滤，再用1~50μm滤袋式过滤器精滤。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1）本发明中枯草杆菌的生长繁殖速度远高于常规静态固体发酵工艺，其最终生物量约为常规静态固体发酵的4~6倍，而且由于微生物数量的优势，使其发酵过程更为剧烈，对底物的利用也更加彻底；
2）本发明的发酵周期为22~48h，γ-聚谷氨酸产量为100~120g/kg基质，比常规静态固体发酵工艺缩短发酵周期10~16h，产量提高30~50%，效率高、操作简单、有良好的应用前景；
3）本发明中的发酵培养物还可应用于用其他行业，如提取纳豆激酶，或直接用作菌肥等。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明及其有益效果作进一步详细说明，但是，本发明的具体实施方式并不局限于此。
实施例1
本实施例提供一种利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）种子液的制备：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌冷却的液态种子培养基中，并在37℃的摇瓶培养24h，即得枯草芽孢杆菌种子液；其中，液态种子培养基的组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 10g/L，pH值为7.0，其余为水；
（2）固体发酵培养基的制备：先将30g葡萄糖、25g谷氨酸钠、15g柠檬酸、0.5gK2HPO4、3.5gNH4Cl、0.02gFeCl3•6H2O、0.25gMgSO4•7H2O、0.1gCaCl2•2H2O和0.05gMnSO4•H2O加水溶解至500mL，再用10%的NaOH溶液调节其pH值为7.0，即得营养液；然后将该营养液投入5 L的压力脉动固体发酵罐中，再加入210g大豆粉和210g麸皮作为固体基料，将其搅拌均匀，最后通入高温水蒸气于121℃的条件下灭菌45min；
（3）接种培养：开启冷却水和搅拌，当压力脉动固体发酵罐的罐温降至30~40℃时，将枯草芽孢杆菌种子液按固体发酵培养基重量的3%接种量接入压力脉动固体发酵罐，在通风比为0.3~0.5(v/v)、压力脉动固体发酵罐的搅拌转速为10r/min和压力脉动固体发酵罐的罐温为37℃的条件下，进行压力脉动刺激培养16h，该过程中，空气压力脉动的气压上限值为0.25MPa（表压），空气压力脉动的气压下限为0.015MPa（表压），空气压力脉动的脉动周期为10~30 min。之后取消压力脉动设置，在通风比为0.2(v/v)、压力脉动固体发酵罐的罐温为37℃、罐压为0.015MPa（表压）、搅拌转速为8r/min的条件下继续通风培养18h，即得固体培养物；
（4）产物的提取纯化：将固体培养物取出，加入其重量的10倍的蒸馏水或去离子水，加热至95℃，搅拌并保温1h，然后用100目筛网过滤，再用1~50μm滤袋式过滤器精滤，最后将滤液经活性炭脱色、醇析、冷冻干燥等程序制得γ-聚谷氨酸。
本实施例所制备的γ-聚谷氨酸的产量为105~110g/kg培养基，发酵周期为34h。
实施例2
本实施例提供一种利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）种子液的制备：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌冷却的液态种子培养基中，并在38℃的摇瓶培养20h，即得枯草芽孢杆菌种子液；其中，液态种子培养基的组成为：蛋白胨8g/L，牛肉膏4g/L，NaCl 8g/L，pH值为6.5，其余为水；
（2）固体发酵培养基的制备：先将25g葡萄糖、20g谷氨酸钠、10g柠檬酸、0.5gK2HPO4、3.5gNH4Cl、0.02gFeCl3•6H2O、0.25gMgSO4•7H2O、0.1gCaCl2•2H2O和0.05gMnSO4•H2O加水溶解至500mL，再用10%的NaOH溶液调节其pH值为6.5，即得营养液；然后将该营养液投入5 L的压力脉动固体发酵罐中，再加入150g大豆粉和300g麸皮作为固体基料，将其搅拌均匀，最后通入高温水蒸气于120℃的条件下灭菌50min；
（3）接种培养：开启冷却水和搅拌，当压力脉动固体发酵罐的罐温降至30~40℃时，将枯草芽孢杆菌种子液按固体发酵培养基重量的5%接种量接入压力脉动固体发酵罐，在通风比为0.1~0.3(v/v)、压力脉动固体发酵罐的搅拌转速为5r/min和压力脉动固体发酵罐的罐温为38℃的条件下，进行压力脉动刺激培养14h，该过程中，空气压力脉动的气压上限值为0.3MPa（表压），空气压力脉动的气压下限为0.01MPa（表压），空气压力脉动的脉动周期为30~50 min。之后取消压力脉动设置，在通风比为0.1(v/v)、压力脉动固体发酵罐的罐温为38℃、罐压为0.02MPa（表压）、搅拌转速为5r/min的条件下继续通风培养16h，即得固体培养物；
（4）产物的提取纯化：将固体培养物取出，加入其重量的5倍的蒸馏水或去离子水，加热至90℃，搅拌并保温1h，然后用100目筛网过滤，再用1~50μm滤袋式过滤器精滤，最后将滤液经活性炭脱色、醇析、冷冻干燥等程序制得γ-聚谷氨酸。
本实施例所制备的γ-聚谷氨酸的产量为103~108g/kg培养基，发酵周期为30h。
实施例3
本实施例提供一种利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）种子液的制备：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌冷却的液态种子培养基中，并在30℃的摇瓶培养36h，即得枯草芽孢杆菌种子液；其中，液态种子培养基的组成为：蛋白胨12g/L，牛肉膏6g/L，NaCl 12g/L，pH值为7.5，其余为水；
（2）固体发酵培养基的制备：先将20g葡萄糖、18g谷氨酸钠、12g柠檬酸、0.5gK2HPO4、3.5gNH4Cl、0.02gFeCl3•6H2O、0.25gMgSO4•7H2O、0.1gCaCl2•2H2O和0.05gMnSO4•H2O加水溶解至500mL，再用10%的NaOH溶液调节其pH值为7.5，即得营养液；然后将该营养液投入5 L的压力脉动固体发酵罐中，再加入200g大豆粉和300g麸皮作为固体基料，将其搅拌均匀，最后通入高温水蒸气于122℃的条件下灭菌40min；
（3）接种培养：开启冷却水和搅拌，当压力脉动固体发酵罐的罐温降至30~40℃时，将枯草芽孢杆菌种子液按固体发酵培养基重量的4%接种量接入压力脉动固体发酵罐，在通风比为0.5~0.8(v/v)、压力脉动固体发酵罐的搅拌转速为8r/min和压力脉动固体发酵罐的罐温为35℃的条件下，进行压力脉动刺激培养18h，该过程中，空气压力脉动的气压上限值为0.20MPa（表压），空气压力脉动的气压下限为0.02MPa（表压），空气压力脉动的脉动周期为20~30 min。之后取消压力脉动设置，在通风比为0.3(v/v)、压力脉动固体发酵罐的罐温为35℃、罐压为0.025MPa（表压）、搅拌转速为10r/min的条件下继续通风培养18h，即得固体培养物；
（4）产物的提取纯化：将固体培养物取出，加入其重量的15倍的蒸馏水或去离子水，加热至100℃，搅拌并保温0.5h，然后用100目筛网过滤，再用1~50μm滤袋式过滤器精滤，最后将滤液经活性炭脱色、醇析、冷冻干燥等程序制得γ-聚谷氨酸。
本实施例所制备的γ-聚谷氨酸的产量为110~115g/kg培养基，发酵周期为36h。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (8)
1.一种利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）种子液的制备：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌冷却的液体种子培养基中，在30~40℃的摇瓶中培养18~36h，即得枯草芽孢杆菌种子液；
（2）固体发酵培养基的制备：将固体基料与营养液按照1:0.8~1:1.4的质量比分别投入压力脉动固体发酵罐中并进行搅拌，搅拌均匀后，开启高温水蒸气，在120~125℃的条件下进行高温灭菌处理，处理时间为30~60min，即得固体发酵培养基；
（3）接种培养：开启冷却水和搅拌，当压力脉动固体发酵罐的罐温降至30~40℃时，将枯草芽孢杆菌种子液按固体发酵培养基重量的1%~6%的接种量接入压力脉动固体发酵罐并进行搅拌，搅拌均匀后，在通风比、压力脉动固体发酵罐的搅拌转速和压力脉动固体发酵罐的罐温分别为0.1~0.8(v/v)、1~10r/min和30~40℃的条件下，进行空气压力脉动刺激培养14~28h，之后取消空气压力脉动设置，在通风比、压力脉动固体发酵罐的表压、压力脉动固体发酵罐的罐温和压力脉动固体发酵罐的搅拌转速分别为0.1~0.6(v/v)、0.01~0.05MPa、30~40℃和1~10r/min的条件下继续通风培养8~20h，即得固体培养物；
（4）产物的提取纯化：将步骤（3）所得的固体培养物取出，向其中加入其重量的5~20倍的蒸馏水或去离子水，加热至90~100℃，搅拌并保温0.5~1h，再对其进行过滤处理，最后将滤液经活性炭脱色、醇析、冷冻干燥等程序制得γ-聚谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述固体基料由大豆粉和麸皮组成，所述大豆粉和所述麸皮的质量比例为0.1:1~1:1。
3.根据权利要求1所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述营养液的组成为：葡萄糖或蔗糖30~60g/L、谷氨酸10~50 g/L、柠檬酸10~30 g/L、K2HPO4 1g/L、NH4Cl 7g/L、FeCl3•6H2O 0.04g/L、MgSO4•7H2O 0.5g/L、CaCl2•2H2O 0.2g/L、MnSO4•H2O 0.1g/L，其余为水。
4.根据权利要求3所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述营养液的pH值通过浓度为10%的NaOH溶液调节为6.5~7.5。
5.根据权利要求1所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述固体发酵培养基的体积为压力脉动固体发酵罐容积的20%~60%。
6.根据权利要求1所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述空气压力脉动的气压上限为0.1~0.3MPa，所述空气压力脉动的气压下限为0.01~0.05MPa。
7.根据权利要求6所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述空气压力脉动的脉动周期为10~120min。
8.根据权利要求1所述的利用空气压力脉动固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述过滤处理为先用100目筛网过滤，再用1~50μm滤袋式过滤器精滤。
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