CN113881721A - 一种多糖聚谷氨酸发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多糖聚谷氨酸发酵方法，包括以下步骤：1)空消，发酵罐在每次停产时和开产前必须空消，连续生产过程中每批生产结束后空消，灭菌前检查灭菌罐的夹层排水阀和罐顶排气阀处于打开状态，打开夹层罐底排污阀门将冷却水完全排出，将空气管道入罐蒸汽阀和取样管道蒸汽阀打开。该多糖聚谷氨酸发酵方法，通过对发酵罐进行严格灭菌，发酵前的空消和发酵时的实消进行有效的配合，使得对发酵罐内部细菌以及培养基内部的微生物活体进行有效的灭杀，从而使得培养菌处于一个良好的发酵环境，避免了发酵罐中灭菌不彻底会涉及到其他细菌，受到控制其他细菌的发酵过程的影响，从而导致多糖聚谷氨酸的发酵失败。
Description
技术领域
本发明涉及聚谷氨酸发酵技术领域，具体为一种多糖聚谷氨酸发酵方法。
背景技术
聚谷氨酸(γ-PGA)，又称纳豆菌胶和多聚谷氨酸，它是一种水溶性，生物降解，不含毒性，使用微生物发酵法制得的生物高分子，γ-PGA聚谷氨酸是一种有粘性的物质，在“纳豆”——发酵豆中被首次发现，γ-PGA聚谷氨酸是一种特殊的阴离子自然聚合物，是以α-胺基和γ-羧基之间经酰胺键结所构成的同型聚酰胺γ-PGA的分子量从5万到2百万道尔顿不等。
就目前行业内聚谷氨酸发酵水平而言，发酵得到的产品含量相对较低，发酵周期较长，得到高含量的产品也一般仅限于实验室小试水平，实际规模化生产中含量并不能达到要求，溶氧很低导致菌体生长过慢，聚谷氨酸的合成速率降低，并且发酵过程中很容易灭菌不充分很容易导致生成的聚谷氨酸变质，影响产品的生产质量，故此，提出一种多糖聚谷氨酸发酵方法来解决上述的问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种多糖聚谷氨酸发酵方法，具备聚谷氨酸的合成速率提高等优点，解决了发酵得到的产品含量相对较低，发酵周期较长，得到高含量的产品也一般仅限于实验室小试水平，实际规模化生产中含量并不能达到要求，溶氧很低导致菌体生长过慢，聚谷氨酸的合成速率降低的问题。
(二)技术方案
为实现上述提高聚谷氨酸的合成速率的目的，本发明提供如下技术方案：一种多糖聚谷氨酸发酵方法，包括以下步骤：
1)空消，发酵罐在每次停产时和开产前必须空消，连续生产过程中每批生产结束后空消，灭菌前检查灭菌罐的夹层排水阀和罐顶排气阀处于打开状态，打开夹层罐底排污阀门将冷却水完全排出，将空气管道入罐蒸汽阀和取样管道蒸汽阀打开，先排掉管道内的冷凝水，然后向罐内通入蒸汽，并保持蒸汽畅通，微开罐顶排气阀，使罐压逐渐上升，当罐压升至0.08MPa时关闭取样口处入罐蒸汽阀门、取样口处蒸汽阀门及取样口阀门，适当控制进、排汽，使各路进汽均匀畅通，控制罐压0.12-0.13MPa，连续生产时和停产时控制此压力灭菌5min，染菌或开产前空消时控制此压力灭菌25min，空消结束，关闭各路蒸汽入罐阀，关闭管道蒸汽阀，适当开大尾气阀门排尽管道内残余蒸汽，观察尾气颜色变淡时开启压缩空气阀门，打开进气阀，关小尾气排气阀，调节罐顶排气阀，控制压力0.05-0.10MPa，排尽罐内冷凝水后，备用。
2)投料，用饮用水将发酵罐冲洗干净后进行投料，发酵罐原料用100L的饮用水进行溶解，并且开启发酵罐搅拌，至其完全溶解，完全溶解后，继续补加饮用水120L-150L。
3)实消，发酵罐加完料并完全溶解之后，加水至相应体积，发酵罐灭菌前将培养基pH调至7.2-7.5，进行实消，通过检查夹层罐底排污阀和夹层排水阀处于打开状态，将罐顶排气阀打开，打开手动进夹套蒸汽阀，然后夹套内通入蒸汽并保持蒸汽畅通，待罐温升至90℃时向发酵罐内通入蒸汽，打开空气管道入罐蒸汽阀和取样管道蒸汽阀，先排掉管道内的冷凝水，然后向罐内通入蒸汽并保持蒸汽畅通，开始升温时，全开罐顶排气阀，待罐压出现，关小罐顶排气阀，微开种子罐的接种口使有少量蒸汽排出，当发酵罐罐温升至115℃时开始计时，控制罐压0.10-0.12MPa，罐温115.0-121.0℃，维持30min，每5min记录一次灭菌参数。
4)冷却，开大罐顶排气阀，关闭罐体各排气阀，关闭各路蒸汽入罐阀，取样口要有少量蒸汽冒出保持气封，关闭空气管路蒸汽阀之后降温，关闭夹层罐底排水阀，打开夹层冷却水阀门迅速降温，当罐压降至0.05MPa时，立即通入无菌空气，维持罐压0.05-0.10MPa，当罐温降至38-40℃时，停止降温。
5)培养接种，按照培养条件培养后进行接种，将发酵罐接种口四周用脱脂棉包住，在脱脂棉上加成品酒精，直至脱脂棉饱和，关小进气阀，开大排气阀门，使罐压维持在0.02-0.03MPa，点燃接种口脱脂棉，迅速打开接种口，并立即关闭发酵罐排气阀，将摇瓶种子液在火焰上方打开纱布，灼烧瓶口后倒入发酵罐，将接种口压盖在火焰上消毒后，拧紧接种口，开大发酵罐进气阀，当罐压大于0.05MPa时打开发酵罐排气阀，调整进气量为10m3/h，罐压0.05-0.1MPa，用湿抹布扑灭接种口火焰。
6)观察，每1h记录运转罐生长情况：罐温、罐压、空气温度、空气流量、滤器压、搅拌转速和泡沫高度，每4h取样检测发酵液pH值，将各个参数：罐温、罐压、空气流量和搅拌转速调整规定的范围内，随时观察各个参数的变化，在发酵过程的0-24h，时刻关注发酵罐的泡沫高度，当泡沫达到消泡桨位置时，及时添加消泡剂，添加量为0.5‰/次，夜班每2h到发酵平台下巡视一次，检查蒸汽及自来水不得有跑冒滴漏等异常情况，检查运转的电机和减速机有无异常声响，是否产热。
7)放罐，要放罐的发酵液取样，将搅拌和温度调整为“停止”状态，关闭发酵罐罐底蒸汽阀门，关闭发酵罐排污阀门，关闭夹层降温和升温阀门以及打开夹层罐底排污阀，打开发酵罐罐底放料阀门，农业级的聚谷氨酸不用通气，罐压落零即可，打开罐底放料阀门，开始放料。
8)洗罐，放罐结束用自来水清洗发酵罐，清洗液打入储罐，用于菌肥生产，按发酵罐灭菌操作规程进行空消。
进一步，所述步骤1)中空消前，需确认总蒸汽压力大于0.40MPa，并且确认已将设备准备好。
进一步，所述步骤2)中投料时，需要一人进行投料，一人进行复核，对原料的数量、批号及重量进行确认。
进一步，所述步骤1)中空消指使用蒸汽在空罐状态下灭菌，杀灭罐内存留的微生物活体，所述步骤3)中实消指在罐内已经加入培养基的状态下使用蒸汽杀灭培养基内微生物活体。
进一步，所述步骤1)和步骤3)均为灭菌过程，灭菌过程中要坚守工作面，不得离开，灭菌时严禁超压、超时，严禁消罐过程及消罐后罐内、罐夹层形成负压。
进一步，所述步骤5)中培养条件包括种子培养条件和发酵罐培养条件，种子培养条件包括温度、摇床转速、培养周期、体积和装液量，所述温度为37℃，所述摇床转速为250rpm，所述培养周期为6-12h，所述体积为0级种子2mL(甘油管种子)和1级种子400mL，2级种子7.2L(分两批培养)，所述装液量为200mL/500mL，所述发酵罐培养条件包括空气流量、罐温、罐压、搅拌转速和培养周期，所述空气流量为10m3/h，所述罐温为36.7-38℃，所述罐压为0.05-0.1MPa，所述搅拌转速为100-150rpm，所述培养周期为45-72h。
进一步，所述步骤7)中放罐标准为发酵培养45-72h，发酵液中葡萄糖糖浓度低于5g/L时，发酵液黏度不上升，谷氨酸消耗停止，发酵即可终止，发酵异常，放罐提前或拖后须报上级主管批准。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种多糖聚谷氨酸发酵方法，具备以下有益效果：
该多糖聚谷氨酸发酵方法，通过对发酵罐进行严格灭菌，发酵前的空消和发酵时的实消进行有效的配合，使得对发酵罐内部细菌以及培养基内部的微生物活体进行有效的灭杀，从而使得培养菌处于一个良好的发酵环境，避免了发酵罐中灭菌不彻底会涉及到其他细菌的复杂控制，以及受到控制其他细菌的发酵过程的影响，从而导致多糖聚谷氨酸的发酵失败，并且发酵过程中种子的培养环境和发酵罐的培养环境处于一个良好的发酵状态，更有利于多糖聚谷氨酸的发酵，以及通过多糖聚谷氨酸的发酵处于一整套规范的发酵流程，可有效的提高了多糖聚谷氨酸的发酵速率以及发酵质量。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：一种多糖聚谷氨酸发酵方法，包括以下步骤：
1)空消，发酵罐在每次停产时和开产前必须空消，连续生产过程中每批生产结束后空消，灭菌前检查灭菌罐的夹层排水阀和罐顶排气阀处于打开状态，打开夹层罐底排污阀门将冷却水完全排出，将空气管道入罐蒸汽阀和取样管道蒸汽阀打开，先排掉管道内的冷凝水，然后向罐内通入蒸汽，并保持蒸汽畅通，微开罐顶排气阀，使罐压逐渐上升，当罐压升至0.08MPa时关闭取样口处入罐蒸汽阀门、取样口处蒸汽阀门及取样口阀门，适当控制进、排汽，使各路进汽均匀畅通，控制罐压0.12MPa，连续生产时和停产时控制此压力灭菌5min，染菌或开产前空消时控制此压力灭菌25min，空消结束，关闭各路蒸汽入罐阀，关闭管道蒸汽阀，适当开大尾气阀门排尽管道内残余蒸汽，观察尾气颜色变淡时开启压缩空气阀门，打开进气阀，关小尾气排气阀，调节罐顶排气阀，控制压力0.05MPa，排尽罐内冷凝水后，备用。
需要说明的是，所述步骤1)中空消前，需确认总蒸汽压力大于0.40MPa，并且确认已将设备准备好。
2)投料，用饮用水将发酵罐冲洗干净后进行投料，发酵罐原料用100L的饮用水进行溶解，并且开启发酵罐搅拌，至其完全溶解，完全溶解后，继续补加饮用水120L。
需要说明的是，所述步骤2)中投料时，需要一人进行投料，一人进行复核，对原料的数量、批号及重量进行确认。
3)实消，发酵罐加完料并完全溶解之后，加水至相应体积，发酵罐灭菌前将培养基pH调至7.2，进行实消，通过检查夹层罐底排污阀和夹层排水阀处于打开状态，将罐顶排气阀打开，打开手动进夹套蒸汽阀，然后夹套内通入蒸汽并保持蒸汽畅通，待罐温升至90℃时向发酵罐内通入蒸汽，打开空气管道入罐蒸汽阀和取样管道蒸汽阀，先排掉管道内的冷凝水，然后向罐内通入蒸汽并保持蒸汽畅通，开始升温时，全开罐顶排气阀，待罐压出现，关小罐顶排气阀，微开种子罐的接种口使有少量蒸汽排出，当发酵罐罐温升至115℃时开始计时，控制罐压0.10MPa，罐温115.0℃，维持30min，每5min记录一次灭菌参数。
需要说明的是，所述步骤1)中空消指使用蒸汽在空罐状态下灭菌，杀灭罐内存留的微生物活体，所述步骤3)中实消指在罐内已经加入培养基的状态下使用蒸汽杀灭培养基内微生物活体，所述步骤1)和步骤3)均为灭菌过程，灭菌过程中要坚守工作面，不得离开，灭菌时严禁超压、超时，严禁消罐过程及消罐后罐内、罐夹层形成负压。
4)冷却，开大罐顶排气阀，关闭罐体各排气阀，关闭各路蒸汽入罐阀，取样口要有少量蒸汽冒出保持气封，关闭空气管路蒸汽阀之后降温，关闭夹层罐底排水阀，打开夹层冷却水阀门迅速降温，当罐压降至0.05MPa时，立即通入无菌空气，维持罐压0.05MPa，当罐温降至38℃时，停止降温。
5)培养接种，按照培养条件培养后进行接种，将发酵罐接种口四周用脱脂棉包住，在脱脂棉上加成品酒精，直至脱脂棉饱和，关小进气阀，开大排气阀门，使罐压维持在0.02MPa，点燃接种口脱脂棉，迅速打开接种口，并立即关闭发酵罐排气阀，将摇瓶种子液在火焰上方打开纱布，灼烧瓶口后倒入发酵罐，将接种口压盖在火焰上消毒后，拧紧接种口，开大发酵罐进气阀，当罐压大于0.05MPa时打开发酵罐排气阀，调整进气量为10m3/h，罐压0.05MPa，用湿抹布扑灭接种口火焰。
需要说明的是，所述步骤5)中培养条件包括种子培养条件和发酵罐培养条件，种子培养条件包括温度、摇床转速、培养周期、体积和装液量，所述温度为37℃，所述摇床转速为250rpm，所述培养周期为6h，所述体积为0级种子2mL(甘油管种子)和1级种子400mL，2级种子7.2L(分两批培养)，所述装液量为200mL/500mL，所述发酵罐培养条件包括空气流量、罐温、罐压、搅拌转速和培养周期，所述空气流量为10m3/h，所述罐温为36.7℃，所述罐压为0.05MPa，所述搅拌转速为100rpm，所述培养周期为45h。
6)观察，每1h记录运转罐生长情况：罐温、罐压、空气温度、空气流量、滤器压、搅拌转速和泡沫高度，每4h取样检测发酵液pH值，将各个参数：罐温、罐压、空气流量和搅拌转速调整规定的范围内，随时观察各个参数的变化，在发酵过程的0-24h，时刻关注发酵罐的泡沫高度，当泡沫达到消泡桨位置时，及时添加消泡剂，添加量为0.5‰/次，夜班每2h到发酵平台下巡视一次，检查蒸汽及自来水不得有跑冒滴漏等异常情况，检查运转的电机和减速机有无异常声响，是否产热。
7)放罐，要放罐的发酵液取样，将搅拌和温度调整为“停止”状态，关闭发酵罐罐底蒸汽阀门，关闭发酵罐排污阀门，关闭夹层降温和升温阀门以及打开夹层罐底排污阀，打开发酵罐罐底放料阀门，农业级的聚谷氨酸不用通气，罐压落零即可，打开罐底放料阀门，开始放料。
需要说明的是，所述步骤7)中放罐标准为发酵培养45h，发酵液中葡萄糖糖浓度低于5g/L时，发酵液黏度不上升，谷氨酸消耗停止，发酵即可终止，发酵异常，放罐提前或拖后须报上级主管批准。
8)洗罐，放罐结束用自来水清洗发酵罐，清洗液打入储罐，用于菌肥生产，按发酵罐灭菌操作规程进行空消。
实施例二：一种多糖聚谷氨酸发酵方法，包括以下步骤：
1)空消，发酵罐在每次停产时和开产前必须空消，连续生产过程中每批生产结束后空消，灭菌前检查灭菌罐的夹层排水阀和罐顶排气阀处于打开状态，打开夹层罐底排污阀门将冷却水完全排出，将空气管道入罐蒸汽阀和取样管道蒸汽阀打开，先排掉管道内的冷凝水，然后向罐内通入蒸汽，并保持蒸汽畅通，微开罐顶排气阀，使罐压逐渐上升，当罐压升至0.08MPa时关闭取样口处入罐蒸汽阀门、取样口处蒸汽阀门及取样口阀门，适当控制进、排汽，使各路进汽均匀畅通，控制罐压0.13MPa，连续生产时和停产时控制此压力灭菌5min，染菌或开产前空消时控制此压力灭菌25min，空消结束，关闭各路蒸汽入罐阀，关闭管道蒸汽阀，适当开大尾气阀门排尽管道内残余蒸汽，观察尾气颜色变淡时开启压缩空气阀门，打开进气阀，关小尾气排气阀，调节罐顶排气阀，控制压力0.10MPa，排尽罐内冷凝水后，备用。
需要说明的是，所述步骤1)中空消前，需确认总蒸汽压力大于0.40MPa，并且确认已将设备准备好。
2)投料，用饮用水将发酵罐冲洗干净后进行投料，发酵罐原料用100L的饮用水进行溶解，并且开启发酵罐搅拌，至其完全溶解，完全溶解后，继续补加饮用水150L。
需要说明的是，所述步骤2)中投料时，需要一人进行投料，一人进行复核，对原料的数量、批号及重量进行确认。
3)实消，发酵罐加完料并完全溶解之后，加水至相应体积，发酵罐灭菌前将培养基pH调至7.5，进行实消，通过检查夹层罐底排污阀和夹层排水阀处于打开状态，将罐顶排气阀打开，打开手动进夹套蒸汽阀，然后夹套内通入蒸汽并保持蒸汽畅通，待罐温升至90℃时向发酵罐内通入蒸汽，打开空气管道入罐蒸汽阀和取样管道蒸汽阀，先排掉管道内的冷凝水，然后向罐内通入蒸汽并保持蒸汽畅通，开始升温时，全开罐顶排气阀，待罐压出现，关小罐顶排气阀，微开种子罐的接种口使有少量蒸汽排出，当发酵罐罐温升至115℃时开始计时，控制罐压0.12MPa，罐温121.0℃，维持30min，每5min记录一次灭菌参数。
需要说明的是，所述步骤1)中空消指使用蒸汽在空罐状态下灭菌，杀灭罐内存留的微生物活体，所述步骤3)中实消指在罐内已经加入培养基的状态下使用蒸汽杀灭培养基内微生物活体，所述步骤1)和步骤3)均为灭菌过程，灭菌过程中要坚守工作面，不得离开，灭菌时严禁超压、超时，严禁消罐过程及消罐后罐内、罐夹层形成负压。
4)冷却，开大罐顶排气阀，关闭罐体各排气阀，关闭各路蒸汽入罐阀，取样口要有少量蒸汽冒出保持气封，关闭空气管路蒸汽阀之后降温，关闭夹层罐底排水阀，打开夹层冷却水阀门迅速降温，当罐压降至0.05MPa时，立即通入无菌空气，维持罐压0.10MPa，当罐温降至40℃时，停止降温。
5)培养接种，按照培养条件培养后进行接种，将发酵罐接种口四周用脱脂棉包住，在脱脂棉上加成品酒精，直至脱脂棉饱和，关小进气阀，开大排气阀门，使罐压维持在0.03MPa，点燃接种口脱脂棉，迅速打开接种口，并立即关闭发酵罐排气阀，将摇瓶种子液在火焰上方打开纱布，灼烧瓶口后倒入发酵罐，将接种口压盖在火焰上消毒后，拧紧接种口，开大发酵罐进气阀，当罐压大于0.05MPa时打开发酵罐排气阀，调整进气量为10m3/h，罐压0.1MPa，用湿抹布扑灭接种口火焰。
需要说明的是，所述步骤5)中培养条件包括种子培养条件和发酵罐培养条件，种子培养条件包括温度、摇床转速、培养周期、体积和装液量，所述温度为37℃，所述摇床转速为250rpm，所述培养周期为12h，所述体积为0级种子2mL(甘油管种子)和1级种子400mL，2级种子7.2L(分两批培养)，所述装液量为200mL/500mL，所述发酵罐培养条件包括空气流量、罐温、罐压、搅拌转速和培养周期，所述空气流量为10m3/h，所述罐温为38℃，所述罐压为0.1MPa，所述搅拌转速为150rpm，所述培养周期为72h。
6)观察，每1h记录运转罐生长情况：罐温、罐压、空气温度、空气流量、滤器压、搅拌转速和泡沫高度，每4h取样检测发酵液pH值，将各个参数：罐温、罐压、空气流量和搅拌转速调整规定的范围内，随时观察各个参数的变化，在发酵过程的0-24h，时刻关注发酵罐的泡沫高度，当泡沫达到消泡桨位置时，及时添加消泡剂，添加量为0.5‰/次，夜班每2h到发酵平台下巡视一次，检查蒸汽及自来水不得有跑冒滴漏等异常情况，检查运转的电机和减速机有无异常声响，是否产热。
7)放罐，要放罐的发酵液取样，将搅拌和温度调整为“停止”状态，关闭发酵罐罐底蒸汽阀门，关闭发酵罐排污阀门，关闭夹层降温和升温阀门以及打开夹层罐底排污阀，打开发酵罐罐底放料阀门，农业级的聚谷氨酸不用通气，罐压落零即可，打开罐底放料阀门，开始放料。
需要说明的是，所述步骤7)中放罐标准为发酵培养72h，发酵液中葡萄糖糖浓度低于5g/L时，发酵液黏度不上升，谷氨酸消耗停止，发酵即可终止，发酵异常，放罐提前或拖后须报上级主管批准。
8)洗罐，放罐结束用自来水清洗发酵罐，清洗液打入储罐，用于菌肥生产，按发酵罐灭菌操作规程进行空消。
实施例三：一种多糖聚谷氨酸发酵方法，包括以下步骤：
1)空消，发酵罐在每次停产时和开产前必须空消，连续生产过程中每批生产结束后空消，灭菌前检查灭菌罐的夹层排水阀和罐顶排气阀处于打开状态，打开夹层罐底排污阀门将冷却水完全排出，将空气管道入罐蒸汽阀和取样管道蒸汽阀打开，先排掉管道内的冷凝水，然后向罐内通入蒸汽，并保持蒸汽畅通，微开罐顶排气阀，使罐压逐渐上升，当罐压升至0.08MPa时关闭取样口处入罐蒸汽阀门、取样口处蒸汽阀门及取样口阀门，适当控制进、排汽，使各路进汽均匀畅通，控制罐压0.125MPa，连续生产时和停产时控制此压力灭菌5min，染菌或开产前空消时控制此压力灭菌25min，空消结束，关闭各路蒸汽入罐阀，关闭管道蒸汽阀，适当开大尾气阀门排尽管道内残余蒸汽，观察尾气颜色变淡时开启压缩空气阀门，打开进气阀，关小尾气排气阀，调节罐顶排气阀，控制压力0.075MPa，排尽罐内冷凝水后，备用。
需要说明的是，所述步骤1)中空消前，需确认总蒸汽压力大于0.40MPa，并且确认已将设备准备好。
2)投料，用饮用水将发酵罐冲洗干净后进行投料，发酵罐原料用100L的饮用水进行溶解，并且开启发酵罐搅拌，至其完全溶解，完全溶解后，继续补加饮用水135L。
需要说明的是，所述步骤2)中投料时，需要一人进行投料，一人进行复核，对原料的数量、批号及重量进行确认。
3)实消，发酵罐加完料并完全溶解之后，加水至相应体积，发酵罐灭菌前将培养基pH调至7.35，进行实消，通过检查夹层罐底排污阀和夹层排水阀处于打开状态，将罐顶排气阀打开，打开手动进夹套蒸汽阀，然后夹套内通入蒸汽并保持蒸汽畅通，待罐温升至90℃时向发酵罐内通入蒸汽，打开空气管道入罐蒸汽阀和取样管道蒸汽阀，先排掉管道内的冷凝水，然后向罐内通入蒸汽并保持蒸汽畅通，开始升温时，全开罐顶排气阀，待罐压出现，关小罐顶排气阀，微开种子罐的接种口使有少量蒸汽排出，当发酵罐罐温升至115℃时开始计时，控制罐压0.11MPa，罐温118.5℃，维持30min，每5min记录一次灭菌参数。
需要说明的是，所述步骤1)中空消指使用蒸汽在空罐状态下灭菌，杀灭罐内存留的微生物活体，所述步骤3)中实消指在罐内已经加入培养基的状态下使用蒸汽杀灭培养基内微生物活体，所述步骤1)和步骤3)均为灭菌过程，灭菌过程中要坚守工作面，不得离开，灭菌时严禁超压、超时，严禁消罐过程及消罐后罐内、罐夹层形成负压。
4)冷却，开大罐顶排气阀，关闭罐体各排气阀，关闭各路蒸汽入罐阀，取样口要有少量蒸汽冒出保持气封，关闭空气管路蒸汽阀之后降温，关闭夹层罐底排水阀，打开夹层冷却水阀门迅速降温，当罐压降至0.05MPa时，立即通入无菌空气，维持罐压0.075MPa，当罐温降至39℃时，停止降温。
5)培养接种，按照培养条件培养后进行接种，将发酵罐接种口四周用脱脂棉包住，在脱脂棉上加成品酒精，直至脱脂棉饱和，关小进气阀，开大排气阀门，使罐压维持在0.025MPa，点燃接种口脱脂棉，迅速打开接种口，并立即关闭发酵罐排气阀，将摇瓶种子液在火焰上方打开纱布，灼烧瓶口后倒入发酵罐，将接种口压盖在火焰上消毒后，拧紧接种口，开大发酵罐进气阀，当罐压大于0.05MPa时打开发酵罐排气阀，调整进气量为10m3/h，罐压0.075MPa，用湿抹布扑灭接种口火焰。
需要说明的是，所述步骤5)中培养条件包括种子培养条件和发酵罐培养条件，种子培养条件包括温度、摇床转速、培养周期、体积和装液量，所述温度为37℃，所述摇床转速为250rpm，所述培养周期为9h，所述体积为0级种子2mL(甘油管种子)和1级种子400mL，2级种子7.2L(分两批培养)，所述装液量为200mL/500mL，所述发酵罐培养条件包括空气流量、罐温、罐压、搅拌转速和培养周期，所述空气流量为10m3/h，所述罐温为37.5℃，所述罐压为0.075MPa，所述搅拌转速为125rpm，所述培养周期为58.5h。
6)观察，每1h记录运转罐生长情况：罐温、罐压、空气温度、空气流量、滤器压、搅拌转速和泡沫高度，每4h取样检测发酵液pH值，将各个参数：罐温、罐压、空气流量和搅拌转速调整规定的范围内，随时观察各个参数的变化，在发酵过程的0-24h，时刻关注发酵罐的泡沫高度，当泡沫达到消泡桨位置时，及时添加消泡剂，添加量为0.5‰/次，夜班每2h到发酵平台下巡视一次，检查蒸汽及自来水不得有跑冒滴漏等异常情况，检查运转的电机和减速机有无异常声响，是否产热。
7)放罐，要放罐的发酵液取样，将搅拌和温度调整为“停止”状态，关闭发酵罐罐底蒸汽阀门，关闭发酵罐排污阀门，关闭夹层降温和升温阀门以及打开夹层罐底排污阀，打开发酵罐罐底放料阀门，农业级的聚谷氨酸不用通气，罐压落零即可，打开罐底放料阀门，开始放料。
需要说明的是，所述步骤7)中放罐标准为发酵培养58.5h，发酵液中葡萄糖糖浓度低于5g/L时，发酵液黏度不上升，谷氨酸消耗停止，发酵即可终止，发酵异常，放罐提前或拖后须报上级主管批准。
8)洗罐，放罐结束用自来水清洗发酵罐，清洗液打入储罐，用于菌肥生产，按发酵罐灭菌操作规程进行空消。
本发明的有益效果是：该多糖聚谷氨酸发酵方法，通过对发酵罐进行严格灭菌，发酵前的空消和发酵时的实消进行有效的配合，使得对发酵罐内部细菌以及培养基内部的微生物活体进行有效的灭杀，从而使得培养菌处于一个良好的发酵环境，避免了发酵罐中灭菌不彻底会涉及到其他细菌的复杂控制，以及受到控制其他细菌的发酵过程的影响，从而导致多糖聚谷氨酸的发酵失败，并且发酵过程中种子的培养环境和发酵罐的培养环境处于一个良好的发酵状态，更有利于多糖聚谷氨酸的发酵，以及通过多糖聚谷氨酸的发酵处于一整套规范的发酵流程，可有效的提高了多糖聚谷氨酸的发酵速率以及发酵质量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种多糖聚谷氨酸发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)空消，发酵罐在每次停产时和开产前必须空消，连续生产过程中每批生产结束后空消，灭菌前检查灭菌罐的夹层排水阀和罐顶排气阀处于打开状态，打开夹层罐底排污阀门将冷却水完全排出，将空气管道入罐蒸汽阀和取样管道蒸汽阀打开，先排掉管道内的冷凝水，然后向罐内通入蒸汽，并保持蒸汽畅通，微开罐顶排气阀，使罐压逐渐上升，当罐压升至0.08MPa时关闭取样口处入罐蒸汽阀门、取样口处蒸汽阀门及取样口阀门，适当控制进、排汽，使各路进汽均匀畅通，控制罐压0.12-0.13MPa，连续生产时和停产时控制此压力灭菌5min，染菌或开产前空消时控制此压力灭菌25min，空消结束，关闭各路蒸汽入罐阀，关闭管道蒸汽阀，适当开大尾气阀门排尽管道内残余蒸汽，观察尾气颜色变淡时开启压缩空气阀门，打开进气阀，关小尾气排气阀，调节罐顶排气阀，控制压力0.05-0.10MPa，排尽罐内冷凝水后，备用。
2)投料，用饮用水将发酵罐冲洗干净后进行投料，发酵罐原料用100L的饮用水进行溶解，并且开启发酵罐搅拌，至其完全溶解，完全溶解后，继续补加饮用水120L-150L。
3)实消，发酵罐加完料并完全溶解之后，加水至相应体积，发酵罐灭菌前将培养基pH调至7.2-7.5，进行实消，通过检查夹层罐底排污阀和夹层排水阀处于打开状态，将罐顶排气阀打开，打开手动进夹套蒸汽阀，然后夹套内通入蒸汽并保持蒸汽畅通，待罐温升至90℃时向发酵罐内通入蒸汽，打开空气管道入罐蒸汽阀和取样管道蒸汽阀，先排掉管道内的冷凝水，然后向罐内通入蒸汽并保持蒸汽畅通，开始升温时，全开罐顶排气阀，待罐压出现，关小罐顶排气阀，微开种子罐的接种口使有少量蒸汽排出，当发酵罐罐温升至115℃时开始计时，控制罐压0.10-0.12MPa，罐温115.0-121.0℃，维持30min，每5min记录一次灭菌参数。
4)冷却，开大罐顶排气阀，关闭罐体各排气阀，关闭各路蒸汽入罐阀，取样口要有少量蒸汽冒出保持气封，关闭空气管路蒸汽阀之后降温，关闭夹层罐底排水阀，打开夹层冷却水阀门迅速降温，当罐压降至0.05MPa时，立即通入无菌空气，维持罐压0.05-0.10MPa，当罐温降至38-40℃时，停止降温。
5)培养接种，按照培养条件培养后进行接种，将发酵罐接种口四周用脱脂棉包住，在脱脂棉上加成品酒精，直至脱脂棉饱和，关小进气阀，开大排气阀门，使罐压维持在0.02-0.03MPa，点燃接种口脱脂棉，迅速打开接种口，并立即关闭发酵罐排气阀，将摇瓶种子液在火焰上方打开纱布，灼烧瓶口后倒入发酵罐，将接种口压盖在火焰上消毒后，拧紧接种口，开大发酵罐进气阀，当罐压大于0.05MPa时打开发酵罐排气阀，调整进气量为10m3/h，罐压0.05-0.1MPa，用湿抹布扑灭接种口火焰。
6)观察，每1h记录运转罐生长情况：罐温、罐压、空气温度、空气流量、滤器压、搅拌转速和泡沫高度，每4h取样检测发酵液pH值，将各个参数：罐温、罐压、空气流量和搅拌转速调整规定的范围内，随时观察各个参数的变化，在发酵过程的0-24h，时刻关注发酵罐的泡沫高度，当泡沫达到消泡桨位置时，及时添加消泡剂，添加量为0.5‰/次，夜班每2h到发酵平台下巡视一次，检查蒸汽及自来水不得有跑冒滴漏等异常情况，检查运转的电机和减速机有无异常声响，是否产热。
7)放罐，要放罐的发酵液取样，将搅拌和温度调整为“停止”状态，关闭发酵罐罐底蒸汽阀门，关闭发酵罐排污阀门，关闭夹层降温和升温阀门以及打开夹层罐底排污阀，打开发酵罐罐底放料阀门，农业级的聚谷氨酸不用通气，罐压落零即可，打开罐底放料阀门，开始放料。
8)洗罐，放罐结束用自来水清洗发酵罐，清洗液打入储罐，用于菌肥生产，按发酵罐灭菌操作规程进行空消。
2.根据权利要求1所述的一种多糖聚谷氨酸发酵方法，其特征在于，所述步骤1)中空消前，需确认总蒸汽压力大于0.40MPa，并且确认已将设备准备好。
3.根据权利要求1所述的一种多糖聚谷氨酸发酵方法，其特征在于，所述步骤2)中投料时，需要一人进行投料，一人进行复核，对原料的数量、批号及重量进行确认。
4.根据权利要求1所述的一种多糖聚谷氨酸发酵方法，其特征在于，所述步骤1)中空消指使用蒸汽在空罐状态下灭菌，杀灭罐内存留的微生物活体，所述步骤3)中实消指在罐内已经加入培养基的状态下使用蒸汽杀灭培养基内微生物活体。
5.根据权利要求1所述的一种多糖聚谷氨酸发酵方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤3)均为灭菌过程，灭菌过程中要坚守工作面，不得离开，灭菌时严禁超压、超时，严禁消罐过程及消罐后罐内、罐夹层形成负压。
6.根据权利要求1所述的一种多糖聚谷氨酸发酵方法，其特征在于，所述步骤5)中培养条件包括种子培养条件和发酵罐培养条件，种子培养条件包括温度、摇床转速、培养周期、体积和装液量，所述温度为37℃，所述摇床转速为250rpm，所述培养周期为6-12h，所述体积为0级种子2mL(甘油管种子)和1级种子400mL，2级种子7.2L(分两批培养)，所述装液量为200mL/500mL，所述发酵罐培养条件包括空气流量、罐温、罐压、搅拌转速和培养周期，所述空气流量为10m3/h，所述罐温为36.7-38℃，所述罐压为0.05-0.1MPa，所述搅拌转速为100-150rpm，所述培养周期为45-72h。
7.根据权利要求1所述的一种多糖聚谷氨酸发酵方法，其特征在于，所述步骤7)中放罐标准为发酵培养45-72h，发酵液中葡萄糖糖浓度低于5g/L时，发酵液黏度不上升，谷氨酸消耗停止，发酵即可终止，发酵异常，放罐提前或拖后须报上级主管批准。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20220104 |