CN115094008A - 一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物抗菌剂技术领域，且公开了一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，包括以下步骤：S1：活化培养，把荚膜放线杆菌从保存好的油管中转接于固体培养基平板中，于25‑30℃，培养32‑42h，进行活化处理；S2：培养接种，取培养好的固体培养基平板，用接种针挑单菌落接种于固体培养基试管中。本发明能够有效防治NE，提高饲料转化率的生物抗菌制剂，通过与噬菌体cocktail的联用，为动物的生态健康养殖提供新的途径，通过把培养基培养偶的菌落放入密封罐中发酵，并加入到液体发酵培养基中，控制发酵温度、通气量、转速和酸碱度，能够提高培养基的发酵速度大大提高产量。

Description

一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法
技术领域
本发明涉及生物抗菌剂技术领域，具体为一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法。
背景技术
抗菌剂是指能够在一定时间内，使某些微生物(细菌、真菌、酵母菌、藻类及病毒等)的生长或繁殖保持在必要水平以下的化学物质，细菌耐药是全球大健康下的关注热点，如何减少抗生素，有效控制细菌病都将势在必行。
目前具有芽孢难根除的Cp，获得了噬菌体的有效应用，且噬菌体因病原的存在而生存，即病原完全杀死，噬菌体才会逐渐消减，直到病原完全清除，这与传统抗生素随时间出现衰减不同，从而有力的证实了噬菌体在针对此类难根除病原的高效性和持久性，是任何一种抗菌物质无法比拟的，但是目前此类的研发还不够成熟，不能满足人们的要求，因此提出一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，通过与益生菌联用建立雏鸡肠道微生物屏障，获得能够有效防治NE，提高饲料转化率的生物抗菌制剂。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，包括以下步骤：
S1：活化培养，把荚膜放线杆菌从保存好的油管中转接于固体培养基平板中，于25-30℃，培养32-42h，进行活化处理；
S2：培养接种，取培养好的固体培养基平板，用接种针挑单菌落接种于固体培养基试管中，于26-38摄氏度，培养30-45h；
S3：继续发酵，把培养基培养偶的菌落放入密封罐中发酵，按照接种量为2-6％加入到液体发酵培养基中，发酵温度为26-32摄氏度；
S4：离心处理，在培养基培养后对在培养基培养后对其进行离心处理，离心时采用微滤加超滤的纯化浓缩膜过滤，然后收集菌体，收集菌体剩下的离心液回收，然后当做培养基原料备用；
S5：制备悬浮液，把离心后的菌体加入混合罐中，然后加入保护剂，制备悬浮液，加入菌体后置于70-80℃，浓度为2-6％的碱溶液中，然后用去离子水和酸溶液反复冲洗，然后置于打浆机内，形成乳浊液；然后置于离心机内，获得悬浮液；
S6：比对分析，通过宏基因组分析禽NE的病原菌群数据信息，分析家禽养殖中Cp菌群特征及致病特性，建立噬菌体cocktail及益生菌制剂的动物模型，进行临床试验及评估；
S7：分装，把制备的悬浮液进行分装，分装时对包装瓶进行紫外线杀菌处理；
S8：储存，把分装后的物料放入冷冻室内冷冻干燥储存。
作为本发明再进一步的方案，所述S3中密封罐中的装料系数为0.5-0.65，在发酵时进行通气，通气量为每小时1-4m3。
进一步的，所述S3中在发酵时带动密封罐转动，转速为60-125r/min，并进行间歇转动，间歇时间为2-7min。
在前述方案的基础上，所述S3中在发酵时调节pH，pH值为6-8。
进一步的，所述S3中在发酵后再次放入发酵罐中二次发酵。
在前述方案的基础上，所述S5中针对病原特征获得Cp特异性噬菌体及益生菌，研发能够对抗Cp中主要致病型别的噬菌体cocktail及益生菌保健制剂。
本发明再进一步的方案，所述S5中建立噬菌体cocktail及益生菌制剂的动物模型，进行临床试验及评估，将噬菌体cocktail及益生菌制剂联合应用于规模化禽养殖场NE的预防和治疗，评价其抗菌效果及防治NE的保护性效果。
进一步的，所述S7中在分装时进行检测，检测时进行抽检，抽检后称重分装。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，具备以下有益效果：
1、本发明通过把培养基培养偶的菌落放入密封罐中发酵，并加入到液体发酵培养基中，控制发酵温度、通气量、转速和酸碱度，能够提高培养基的发酵速度大大提高产量。
2、本发明中，通过进行二次发酵处理，同一个发酵罐多菌种发酵工艺，解决了单一菌种发酵投资大生产效率低的问题。
3、本发明中，能更有效的除杂和保存噬菌体的完整结构，解决离心工艺设备复杂、成本高、操作性差、除杂不彻底和破坏噬菌体结构的问题，能够回收离心后的废料，再次使用，形成循环，提高了物料的循环效率，节约了资源，绿色环保。
4、本发明中，利用益生菌用于0日龄雏鸡建立肠道微生物保护屏障，不仅能够抵御Cp感染，能够有效防治NE，还能有效调节雏鸡生长，提高饲料转化率，通过与噬菌体cocktail的联用，通过生物源噬菌体和益生菌的联合应用，建立雏鸡肠道中Cp的保护性屏障并获得能够有效攻克Cp的噬菌体配方，加强动物福利。
附图说明
图1为本发明提出的一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法的流程结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
参照图1，一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，包括以下步骤：
S1：活化培养，把荚膜放线杆菌从保存好的油管中转接于固体培养基平板中，于26℃，培养34h，进行活化处理；
S2：培养接种，取培养好的固体培养基平板，用接种针挑单菌落接种于固体培养基试管中，于29摄氏度，培养35h；
S3：继续发酵，把培养基培养偶的菌落放入密封罐中发酵，按照接种量为4％加入到液体发酵培养基中，发酵温度为28摄氏度，S3中密封罐中的装料系数为0.5-0.65，在发酵时进行通气，通气量为每小时1-4m3，S3中在发酵时带动密封罐转动，转速为60-125r/min，并进行间歇转动，间歇时间为2-7min，S3中在发酵时调节pH，pH值为6-8，通过把培养基培养偶的菌落放入密封罐中发酵，并加入到液体发酵培养基中，控制发酵温度、通气量、转速和酸碱度，能够提高培养基的发酵速度大大提高产量，S3中在发酵后再次放入发酵罐中二次发酵，通过进行二次发酵处理，同一个发酵罐多菌种发酵工艺，解决了单一菌种发酵投资大生产效率低的问题；
S4：离心处理，在培养基培养后对在培养基培养后对其进行离心处理，离心时采用微滤加超滤的纯化浓缩膜过滤，能更有效的除杂和保存噬菌体的完整结构，解决离心工艺设备复杂、成本高、操作性差、除杂不彻底和破坏噬菌体结构的问题，然后收集菌体，收集菌体剩下的离心液回收，然后当做培养基原料备用，能够回收离心后的废料，再次使用，形成循环，提高了物料的循环效率，节约了资源，绿色环保；
S5：制备悬浮液，把离心后的菌体加入混合罐中，然后加入保护剂，制备悬浮液，加入菌体后置于70-80℃，浓度为2-6％的碱溶液中，然后用去离子水和酸溶液反复冲洗，然后置于打浆机内，形成乳浊液；然后置于离心机内，获得悬浮液；
S6：比对分析，通过宏基因组分析禽NE的病原菌群数据信息，分析家禽养殖中Cp菌群特征及致病特性，建立噬菌体cocktail及益生菌制剂的动物模型，进行临床试验及评估，利用益生菌用于0日龄雏鸡建立肠道微生物保护屏障，不仅能够抵御Cp感染，还能有效调节雏鸡生长，提高饲料转化率，通过与噬菌体cocktail的联用，通过生物源噬菌体和益生菌的联合应用，建立雏鸡肠道中Cp的保护性屏障并获得能够有效攻克Cp的噬菌体配方，加强动物福利；
S7：分装，把制备的悬浮液进行分装，分装时对包装瓶进行紫外线杀菌处理；
S8：储存，把分装后的物料放入冷冻室内冷冻干燥储存。
实施例2
参照图1，一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，包括以下步骤：
S1：活化培养，把荚膜放线杆菌从保存好的油管中转接于固体培养基平板中，于29℃，培养36h，进行活化处理；
S2：培养接种，取培养好的固体培养基平板，用接种针挑单菌落接种于固体培养基试管中，于29摄氏度，培养32h；
S3：继续发酵，把培养基培养偶的菌落放入密封罐中发酵，按照接种量为2-6％加入到液体发酵培养基中，发酵温度为26-32摄氏度，S3中密封罐中的装料系数为0.5-0.65，在发酵时进行通气，通气量为每小时1-4m3；
S4：离心处理，在培养基培养后对在培养基培养后对其进行离心处理，离心时采用微滤加超滤的纯化浓缩膜过滤，能更有效的除杂和保存噬菌体的完整结构，解决离心工艺设备复杂、成本高、操作性差、除杂不彻底和破坏噬菌体结构的问题，然后收集菌体，收集菌体剩下的离心液回收，然后当做培养基原料备用，能够回收离心后的废料，再次使用，形成循环，提高了物料的循环效率，节约了资源，绿色环保；
S5：制备悬浮液，把离心后的菌体加入混合罐中，然后加入保护剂，制备悬浮液，加入菌体后置于75℃，浓度为3％的碱溶液中，然后用去离子水和酸溶液反复冲洗，然后置于打浆机内，形成乳浊液；然后置于离心机内，获得悬浮液，S5中针对病原特征获得Cp特异性噬菌体及益生菌，研发能够对抗Cp中主要致病型别的噬菌体cocktail及益生菌保健制剂，S5中建立噬菌体cocktail及益生菌制剂的动物模型，进行临床试验及评估，将噬菌体cocktail及益生菌制剂联合应用于规模化禽养殖场NE的预防和治疗，评价其抗菌效果及防治NE的保护性效果；
S6：比对分析，通过宏基因组分析禽NE的病原菌群数据信息，分析家禽养殖中Cp菌群特征及致病特性，建立噬菌体cocktail及益生菌制剂的动物模型，进行临床试验及评估，利用益生菌用于0日龄雏鸡建立肠道微生物保护屏障，不仅能够抵御Cp感染，还能有效调节雏鸡生长，提高饲料转化率，通过与噬菌体cocktail的联用，通过生物源噬菌体和益生菌的联合应用，建立雏鸡肠道中Cp的保护性屏障并获得能够有效攻克Cp的噬菌体配方，加强动物福利；
S7：分装，把制备的悬浮液进行分装，分装时对包装瓶进行紫外线杀菌处理，S7中在分装时进行检测，检测时进行抽检，抽检后称重分装；
S8：储存，把分装后的物料放入冷冻室内冷冻干燥储存。
在该文中的描述中，需要说明的是，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：活化培养，把荚膜放线杆菌从保存好的油管中转接于固体培养基平板中，于25-30℃，培养32-42h，进行活化处理；
S2：培养接种，取培养好的固体培养基平板，用接种针挑单菌落接种于固体培养基试管中，于26-38摄氏度，培养30-45h；
S3：继续发酵，把培养基培养偶的菌落放入密封罐中发酵，按照接种量为2-6％加入到液体发酵培养基中，发酵温度为26-32摄氏度；
S4：离心处理，在培养基培养后对在培养基培养后对其进行离心处理，离心时采用微滤加超滤的纯化浓缩膜过滤，然后收集菌体，收集菌体剩下的离心液回收，然后当做培养基原料备用；
S5：制备悬浮液，把离心后的菌体加入混合罐中，然后加入保护剂，制备悬浮液，加入菌体后置于70-80℃，浓度为2-6％的碱溶液中，然后用去离子水和酸溶液反复冲洗，然后置于打浆机内，形成乳浊液；然后置于离心机内，获得悬浮液；
S6：比对分析，通过宏基因组分析禽NE的病原菌群数据信息，分析家禽养殖中Cp菌群特征及致病特性，建立噬菌体cocktail及益生菌制剂的动物模型，进行临床试验及评估；
S7：分装，把制备的悬浮液进行分装，分装时对包装瓶进行紫外线杀菌处理；
S8：储存，把分装后的物料放入冷冻室内冷冻干燥储存。
2.根据权利要求1所述的一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，其特征在于，所述S3中密封罐中的装料系数为0.5-0.65，在发酵时进行通气，通气量为每小时1-4m3。
3.根据权利要求2所述的一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，其特征在于，所述S3中在发酵时带动密封罐转动，转速为60-125r/min，并进行间歇转动，间歇时间为2-7min。
4.根据权利要求3所述的一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，其特征在于，所述S3中在发酵时调节pH，pH值为6-8。
5.根据权利要求1所述的一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，其特征在于，所述S3中在发酵后再次放入发酵罐中二次发酵。
6.根据权利要求1所述的一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，其特征在于，所述S5中针对病原特征获得Cp特异性噬菌体及益生菌，研发能够对抗Cp中主要致病型别的噬菌体cocktail及益生菌保健制剂。
7.根据权利要求6所述的一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，其特征在于，所述S5中建立噬菌体cocktail及益生菌制剂的动物模型，进行临床试验及评估，将噬菌体cocktail及益生菌制剂联合应用于规模化禽养殖场NE的预防和治疗，评价其抗菌效果及防治NE的保护性效果。
8.根据权利要求1所述的一种防治禽产气荚膜梭菌的生物抗菌制剂研发方法，其特征在于，所述S7中在分装时进行检测，检测时进行抽检，抽检后称重分装。
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