CN102757994A - 一种脂肽类生物表面活性剂的工业化生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鼠糖脂生物表面活性剂干粉的工业化生产方法。该方法包括下列步骤：(1)菌种选育；(2)斜面种子培养；(3)菌种扩大培养；(4)工业发酵培养；(5)生产出的脂肽类生物表面活性剂发酵液经高速离心机在8000rpm/min的转速下离心，分别得到脂肽分离液及枯草芽孢杆菌。由本方法生产的脂肽表面活性剂发酵液原液表面张力＜26mN/m，经离心去除菌体后再稀释500倍表面张力＜34mN/m。经分离得到的脂肽分离液可用于三元复合驱采油中，其驱油效果在水驱基础上可提高8-16％。经分离得到的枯草芽孢杆菌经检测每6ml发酵液中的菌数可达到100亿个以上，可用于生产加工EM菌液，应用于农业、畜牧养殖、污水处理(工业污水及养殖污水)等领域。
Description
技术领域：
本发明涉及一种脂肽类生物表面活性剂的工业化生产方法。
背景技术：
表面活性剂是指能显著降低表面张力和界面张力的一种具备一定结构、有亲水亲油特性的物质。主要分为化学类表面活性剂及生物类表面活性剂，最常用的为化学类表面活性剂，但其生产过程、使用过程中一般会有有毒、有害及对环境有污染的情况产生。相比，生物类表面活性剂主要是利用微生物的生理代谢产生的，其具有良好的表面活性外，还具备有结构多样性，低毒或无毒，生物可降解，适应极端温度、pH和盐度等特性。其原料一般来源于植物而不是石油，具有成本低廉、生产过程无害、无污染等特点。其在石油开采、环保、医药、日化、食品等诸多领域具有较大的研究和应用价值。
枯草芽孢杆菌产生的脂肽(译为Surfactin)，1968年被Arima等人首次发现，它的表面活性很强，是生物表面活性剂领域研究最早、最广的品种之一，被广泛的应用于食品、环境、石油开采、土壤修复等领域的研究中。然而，产量低、成本高一直是制约脂肽类表面活性剂的广泛应用的主要原因，以至于到目前为止，仍无法实现Surfactin的工业化的大规模生产。另外，由于生物发酵过程本身的不稳定性，从实验室技术向工业化生产技术转化是一个很难的问题。
发明内容：
本发明的目的是提供一种适用于工业化规模生产脂肽类生物表面活性剂的方法。由本方法生产的脂肽表面活性剂发酵液原液表面张力＜26mN/m，经离心去除菌体后再稀释500倍表面张力＜34mN/m。经分离得到的脂肽分离液可用于三元复合驱采油中，其驱油效果在水驱基础上可提高8-16％。经分离得到的枯草芽孢杆菌经检测每6ml发酵液中的菌数可达到100亿个以上，可用于生产加工EM菌液，应用于农业、畜牧养殖、污水处理(工业污水及养殖污水)等领域。
本发明所采用的技术方案是：该脂肽类生物表面活性剂的工业化生产方法包括以下步骤：
(1)菌种选育：出发菌选取中国工业微生物菌种保藏管理中心编号为10366的枯草芽孢杆菌，经过富集培养，血平板分离筛选，获得一株高产的生产菌，编号为VTS-1106；
(2)斜面种子培养：培养基的配比为葡萄糖15-25g/L，硝酸铵3-8g/L，磷酸二氢钾0.8-1.2g/L，磷酸氢二钠1-2g/L，硫酸镁0.2-0.8g/L，酵母粉0.5-1g/L，L-谷氨酸0.5-1g/L，烟酸0.0002g/L，余量为水；pH值7.2-7.3，0.1Mpa灭菌20min，斜面培养在37℃恒温培养24h，检查无染菌备用。
(3)菌种扩大培养：向种子罐中加入培养基，将种子罐用蒸气高温灭菌，温度121℃，压力0.05Mpa，灭菌20min；将培养好的斜面菌种接至种子罐进行扩大培养，培养温度37℃，培养18h-24h，检测细菌数达到1010-1012即可供发酵使用；培养基的配比为：培养基的配比为：葡萄糖1.5-2g/100ml，硝酸铵0.4-0.6g/100ml，氯化钙0.007-0.009g/100ml，磷酸二氢钾0.15-0.2g/100ml磷酸氢二钠0.8-0.85g/100ml，硫酸镁0.02-0.025g/100ml，酵母粉0.06-0.1g/100ml，余量为水；
(4)工业发酵培养：
制备培养基：称取培养基加入发酵罐中，搅拌溶解并调整PH值为6.0；培养基配比：葡萄糖15-25g/L，硝酸铵3-8g/L，磷酸二氢钾0.8-1.2g/L，磷酸氢二钠1-2g/L，硫酸镁0.2-0.8g/L，酵母粉0.5-1g/L，L-谷氨酸0.5-1g/L，烟酸0.0002g/L，余量为水
灭菌：采用蒸气高温灭菌，升温至121℃灭菌20min，灭菌完成后冷却，做无菌检查。
接种：经检测无菌后向发酵罐内接种，接种量为2％。
培养：接种完毕后，开始培养；将温度控制在37±2℃，通风比1∶0.6-1.0，转速130rpm/min，罐压0.05mpa，pH值6.5-7.0；
流加：待发酵过程中糖的消耗量降至1％左右时，向发酵罐内流加50wt的蔗糖水溶液，流加量为发酵培养基中葡萄糖总添加量的20wt％。
放罐：待检测发酵液中的残糖量降至0.2％左右时，发酵结束，整体发酵时间控制在48-60h。
(5)生产出的脂肽类生物表面活性剂发酵液经高速离心机在8000rpm/min的转速下离心，分别得到脂肽分离液及枯草芽孢杆菌。
本发明的技术效果是：由本方法生产的脂肽表面活性剂发酵液原液表面张力＜26mN/m，经离心去除菌体后再稀释500倍表面张力＜34mN/m。经分离得到的脂肽分离液可用于三元复合驱采油中，其驱油效果在水驱基础上可提高8-16％。经分离得到的枯草芽孢杆菌经检测6ml发酵液中的菌数可达到100亿个以上，可用于生产加工EM菌液，应用于农业、畜牧养殖、污水处理(工业污水及养殖污水)等领域。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明进行具体描述：
该脂肽类生物表面活性剂的工业化生产方法包括以下步骤：
(1)菌种选育：出发菌选取中国工业微生物菌种保藏管理中心编号为10366的枯草芽孢杆菌，经过富集培养，血平板分离筛选，获得一株高产的生产菌，编号为VTS-1106；
(2)斜面种子培养：培养基的配比为葡萄糖20g/L，硝酸铵5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，酵母粉0.8g/L，L-谷氨酸0.8g/L，烟酸0.0002g/L，余量为水；pH值7.2-7.3，0.1Mpa灭菌20min，斜面培养在37℃恒温培养24h，检查无染菌备用。斜面培养总量按≥步骤(3)菌种扩大培养量的6％计算。
(3)菌种扩大培养：向种子罐中加入培养基，将种子罐用蒸气高温灭菌，温度121℃，压力0.05Mpa，灭菌20min；将培养好的斜面菌种接至种子罐进行扩大培养，培养温度37℃，培养20h，检测细菌数达到1010-1012即可供发酵使用；培养基的配比为：培养基的配比为：葡萄糖1.8g/100ml，硝酸铵0.5g/100ml，氯化钙0.008g/100ml，磷酸二氢钾0.18g/100ml磷酸氢二钠0.8g/100ml，硫酸镁0.025g/100ml，酵母粉0.08g/100ml，余量为水；菌种培养总量按≥步骤(4)工业发酵生产总量的2％计算。
(4)30m3工业发酵培养：
制备培养基：根据当批生产总量，将培养基加入发酵罐中，搅拌溶解并调整PH值为6.0；培养基配比：葡萄糖20g/L，硝酸铵5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，酵母粉0.8g/L，L-谷氨酸0.8g/L，烟酸0.0002g/L，余量为水
灭菌：采用蒸气高温灭菌，升温至121℃灭菌20min，灭菌完成后冷却，做无菌检查。
接种：经检测无菌后向发酵罐内接种，接种量为2％。
培养：接种完毕后，开始培养；将温度控制在37±2℃，通风比1∶1.0，转速130rpm/min，罐压0.05mpa，pH值6.5-7.0；
流加：待发酵过程中糖的消耗量降至1％左右时，向发酵罐内流加50wt的蔗糖水溶液，流加量为发酵培养基中葡萄糖总添加量的20wt％。
放罐：待检测发酵液中的残糖量降至0.2％左右时，发酵结束。
(5)生产出的脂肽类生物表面活性剂发酵液经高速离心机在8000rpm/min的转速下离心，分别得到脂肽分离液及枯草芽孢杆菌。
表面张力采用白金板法检测，使用的仪器为QBZV全自动表面张力仪。残糖量采用裴林法检测。通过上述工业生产方法生产出的脂肽表面活性剂发酵液原液表面张力为23.56mN/m，经离心去除菌体后再稀释500倍表面张力为33.41mN/m。
在驱油领域的应用：
该工业方法生产的脂肽类生物表面活性剂，应用于大庆油田萨北开发区小井距试验区葡I4-10油层开展了生物表面活性剂三元复合驱先导性矿场试验，采用与进口表活剂ORS41复配的强碱体系，提高采收率15.41％。该三元体系中加入了浓度为0.2％的脂肽类生物表面活性剂，在提高采收率的同时使体系中磺酸盐类表面活性剂的用量下降了50％，复合驱化学剂总成本降低了30％。
在养殖领域的应用：
用于处理污染鱼塘，将分离得到的枯草芽孢杆菌按100～200g/亩兑水均匀泼洒，每10～15天使用一次。水质严重恶化的可隔5～7天使用一次。处理完毕的鱼塘可达到无异味，水质清澈透明的效果。
Claims (2)
1.一种鼠糖脂生物表面活性剂干粉的工业化生产方法，该方法包括以下步骤：
(1)菌种选育：出发菌选取中国工业微生物菌种保藏管理中心编号为10366的枯草芽孢杆菌，经过富集培养，血平板分离筛选，获得一株高产的生产菌，编号为VTS-1106；
(2)斜面种子培养：培养基的配比为葡萄糖15-25g/L，硝酸铵3-8g/L，磷酸二氢钾0.8-1.2g/L，磷酸氢二钠1-2g/L，硫酸镁0.2-0.8g/L，酵母粉0.5-1g/L，L-谷氨酸0.5-1g/L，烟酸0.0002g/L，余量为水；pH值7.2-7.3，0.1Mpa灭菌20min，斜面培养在37℃恒温培养24h，检查无染菌备用；
(3)菌种扩大培养：向种子罐中加入培养基，将种子罐用蒸气高温灭菌，温度121℃，压力0.05Mpa，灭菌20min；将培养好的斜面菌种接至种子罐进行扩大培养，培养温度37℃，培养18h-24h，检测细菌数达到1010-1012即可供发酵使用；培养基的配比为：培养基的配比为：葡萄糖1.5-2g/100ml，硝酸铵0.4-0.6g/100ml，氯化钙0.007-0.009g/100ml，磷酸二氢钾0.15-0.2g/100ml磷酸氢二钠0.8-0.85g/100ml，硫酸镁0.02-0.025g/100ml，酵母粉0.06-0.1g/100ml，余量为水；
(4)工业发酵培养：
制备培养基：称取培养基加入发酵罐中，搅拌溶解并调整PH值为6.0；培养基配比：葡萄糖15-25g/L，硝酸铵3-8g/L，磷酸二氢钾0.8-1.2g/L，磷酸氢二钠1-2g/L，硫酸镁0.2-0.8g/L，酵母粉0.5-1g/L，L-谷氨酸0.5-1g/L，烟酸0.0002g/L，余量为水；
灭菌：采用蒸气高温灭菌，升温至121℃灭菌20min，灭菌完成后冷却，做无菌检查；接种：经检测无菌后向发酵罐内接种，接种量为2％；
培养：接种完毕后，开始培养；将温度控制在37±2℃，通风比1∶0.6-1.0，转速130rpm/min，罐压0.05mpa，pH值6.5-7.0；
流加：待发酵过程中糖的消耗量降至1％左右时，向发酵罐内流加50wt的蔗糖水溶液，流加量为发酵培养基中葡萄糖总添加量的20wt％；
放罐：待检测发酵液中的残糖量降至0.2％左右时，发酵结束，整体发酵时间控制在48-60h；
(5)生产出的脂肽类生物表面活性剂发酵液经高速离心机在8000rpm/min的转速下离心，分别得到脂肽分离液及枯草芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的鼠糖脂生物表面活性剂干粉的工业化生产方法，其特征在于：斜面种子培养：培养基的配比为葡萄糖20g/L，硝酸铵5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，酵母粉0.8g/L，L-谷氨酸0.8g/L，烟酸0.0002g/L，余量为水；菌种扩大培养：培养基的配比为：葡萄糖1.8g/100ml，硝酸铵0.5g/100ml，氯化钙0.008g/100ml，磷酸二氢钾0.18g/100ml磷酸氢二钠0.8g/100ml，硫酸镁0.025g/100ml，酵母粉0.08g/100ml，余量为水；工业发酵培养：培养基配比为葡萄糖20g/L，硝酸铵5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，酵母粉0.8g/L，L-谷氨酸0.8g/L，烟酸0.0002g/L，余量为水。
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